Противоопухолевое средство для перорального применения и способ его получения

Изобретение относится к медицине и описывает противоопухолевое средство, относящееся к классу гестагенов, 17α-ацетокси-3β-бутаноилокси-6-метил-прегна-4,6-диен-20-он, с возможностью перорального применения. Данное соединение не токсично, не имеет побочных андрогенных свойств, по противоопухолевой активности превосходит использующийся в клинической практике гестаген депо-провера и обладает химиосенсибилизирующим действием. Предложен способ получения препарата восстановлением мегестрола ацетата боргидридом натрия с последующей этерификацией продукта восстановлением ангидридом масляной кислоты. С целью повышения выхода и упрощения выделения целевого продукта в чистом виде реакционную смесь после этерификации для удаления избытка масляной кислоты обрабатывают раствором аммиака. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 ил.

 

Противоопухолевое средство для перорального применения и способ его получения.

Изобретение относится к медицине, в частности к химии стероидов, и касается конкретно гестагенов, обладающих противоопухолевой активностью.

Известно использование гестагенов в онкологии для лечения гормонозависимых опухолей, таких как рак тела матки, рак молочной железы, рак эндометрия. В качестве препаратов на основе гестагенов используют такие, как мегейс, депо-провера, депостат [Машковский М.Д. «Лекарственные средства», Москва, «Медицина», часть 2, 1993, стр.547-548]. Наиболее широкое применение получил препарат депо-провера, в котором в качестве гестагена используют медроксипрогестерона ацетат, для лечения рака молочной железы, рака эндометрия [«Федеральное руководство по использованию лекарственных средств для врачей». Выпуск I, 2000, стр.517].

Указанные в этих препаратах гестагены содержат Δ⁴-3-кетогруппировку, характерную не только для прогестерона, но и для тестостерона. Последнее может быть причиной наличия у этих гестагенов побочных андрогенных свойств, вызывающих верилизацию у женщин.

В настоящей заявке в качестве противоопухолевого средства предлагается гестаген формулы 1-3β-бутаноилокси-6-метил-17α-ацетокси-прегна-4,6-диен-20-он (соединение 1) и способ его получения.

Заявляемое соединение обладает высокой противоопухолевой активностью, не обнаруживает побочных андрогенных свойств (тест Хершбергера), и в его структуре не содержится Δ⁴-3-кетогруппировки.

На фиг.1 - влияние соединения 1 в комбинации с винкристином на рост перевиваемого острого лимфолейкоза мыши Р388, резистентного к винкристину;

на фиг.2 - цитостатическая активность гестагенов в отношении клеток MCF-7;

на фиг.3 - цитостатическая активность гестагенов в отношении клеток HeLa.

Противоопухолевая активность заявляемого средства показана в опытах на мышах линии СВА с перевиваемым раком шейки матки РШМ-5. В качестве препарата сравнения использовали депо-провера (МПА, медроксипрогестерона ацетат).

Пример 1.

Изучение противоопухолевой активности исследуемого соединения проводили на перевиваемом раке шейки матки РШМ-5, чувствительном к прогестинам при ортотопической перевивке. Опухоль первоначально индуцирована метилхолантреном в подкожном аутотрансплантате шейки матки мыши - СВА в 1970 г. Опухоль перевивали при лапаротомии фрагментом размером 1 мм³ в один из рогов матки с помощью троакара мышам СВА, находящимся под гексеналовым наркозом. При перевивке использовали мышей-самок линии СВА, массой 18-20 грамм. Лечение начинали на 3 день после перевивки опухоли. Курс лечения составлял 14 дней при ежедневном введении изучаемых гестагенов. Забой мышей проводили на 17 день после начала опыта. Противоопухолевый эффект оценивали по торможению роста опухоли (изменению массы опухоли), рассчитывая коэффициент ТРО (торможение роста опухоли). В опытных группах использовали по 8 мышей, в контрольной - 13 мышей.

Схема введения:

Соединение 1 вводили в дозах 0,5; 1 и 2 мг/мышь перорально через зонд ежедневно в течение 14 дней. Растворитель - 1% крахмальный клейстер. Депо-провера вводили в дозах 1 и 2 мг/мышь перорально через зонд ежедневно в течение 14 дней. Растворитель - дистиллированная вода.

Результаты исследования влияния соединения 1 на рост опухоли РШМ-5 представлены в таблице 1.

Таблица 1. Противоопухолевая активность соединения 1 при пероральном введении в течение 14 дней мышам с раком шейки матки РШМ-5.
Группа	Доза (мг/мышь)	Масса опухоли, М±м (мг.)	ТРО(торможение роста опухоли), %
Контроль	-	417±93,5	-
	0,5	265,4±126,85	36
Соединение 1	1	113,6±27,76	73*,**
	2	285,3±128,99	32
МПА	1	205±71,76	55*
	2	187,1±73,7	55*
Примечание: * - достоверные отличия от контроля для р≤0,01; ** - достоверное отличие от ТРО для МПА (р≤0,05).

Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что соединение 1 в дозе 1 мг/мышь тормозит рост опухоли РШМ-5 на 73%, тогда как МПА в той же дозе - на 55%. Таким образом, заявляемое средство при пероральном применении обладает противоопухолевой активностью в отношении РШМ-5, причем по терапевтическому эффекту превосходит препарат сравнения МПА.

Пример 2.

Заявляемое соединение обладает выраженным химиосенсибилизирующим действием, повышая противоопухолевое действие винкристина в отношении перевиваемого острого лимфолейкоза мыши Р388, резистентного к винкристину.

Для оценки химиосенсибилизирующего действия соединения 1 сравнивали противоопухолевую активность винкристина как самостоятельного соединения с противоопухолевой активностью винкристина в комбинации с соединением 1.

Мышам линии DBA2 привили лимфолейкоз Р388, устойчивый к винкристину, 2 млн. клеток/мышь, на следующий день группе «Винкристин» (7 мышей, средний столбец на фиг.1) ввели винкристин 1 мкг/г внутрибрюшинно (20 мкг/мышь), группе «Винкристин + соединение 1» (7 мышей, правый от центра столбец на фиг.1) винкристин 1 мкг/г внутрибрюшинно (20 мкг/мышь) и через 2 часа соединение 1 1 мг/мышь (50 мг/кг) перорально в масле.

Контрольная группа (7 мышей, первый столбец на фиг.1) получила масло перорально. На 7 день после прививания подсчитали нарастание опухоли по количеству клеток асцитной жидкости. На фиг.1 представлены результаты эксперимента по оценке влияния соединения 1 в комбинации с винкристином на рост перевиваемого острого лимфолейкоза мыши Р388, резистентного к винкристину.

По оси ординат - рост опухоли (процент нарастания, %), * - достоверное отличие количества клеток в группе «Винкристин + соединение 1» от группы «Винкристин».

В контрольной группе опухоль наросла за 7 дней на 185%, в группе «Винкристин» - на 80%, в группе «Винкристин + соединение 1» - на 35%. Таким образом, соединение 1 в дозе 1 мг/мышь (50 мг/кг) проявляет химиосенсибилизирующее действие, повышая противоопухолевый эффект винкристина на 16% и ингибируя в комбинации с винкристином рост опухоли на 53%. Винкристин как самостоятельное соединение ингибирует рост опухоли на 37%.

Соединение 1 достоверно (Р<0,001) усиливает противоопухолевое действие винкристина в отношении гормоннезависимого резистентного острого лимфолейкоза мыши Р388, следовательно, является по отношению к данной опухоли химиосенсибилизатором.

Пример 3.

Заявляемое средство обладает цитостатической активностью в отношении клеток рака молочной железы человека (линия MCF-7) и рака шейки матки человека (линия HeLa).

Цитостатическую активность определяли как подавление жизнеспособности клеток (%) в присутствии изучаемых соединений. Влияние гестагенов на жизнеспособность опухолевых клеток оценивалось методом МТТ (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромистый) [Mealey K.L., Barhoumi R., Burghardt R.C. et al. Doxycycline induces expression of P glycoprotein in MCF-7 breast carcinoma cells // Antimicrob. Agents Chemother. - 2002 - V.46. N 3. - P.755-761]. В качестве соединений сравнения использовали МПА и прогестерон.

Данные о цитостатической активности гестагенов в отношении клеток MCF-7 представлены на фиг.2. Цитостатическая активность гестагенов в отношении клеток HeLa представлена на фиг.3.

На фигурах по оси ординат - процент живых клеток, %; в каждой данной на фигурах концентрации с 1 по 4 столбец соответственно: прогестерон, соединение 1, МПА, контроль; * - достоверное отличие от контроля при Р<0,001, ◆ - достоверное отличие от контроля при Р<0,05.

В отношении клеток рака молочной железы человека MCF-7 соединение 1 обладает более выраженным цитостатическим действием, чем прогестерон и сходным цитостатическим действием с МПА (Р<0,05). Соединение 1 обладает более выраженным цитостатическим действием, чем МПА и прогестерон в культуре клеток HeLa (P<0,05).

Пример 4.

Заявляемое соединение не токсично. Это показано в исследованиях на острую токсичность в опытах на крысах при введении доз соединения, превышающих терапевтическую в 50-100 раз (с учетом широкого интервала рекомендованных доз).

Пример 5.

Предметом изобретения является также способ получения соединения 1 боргидридным восстановлением мегестрола ацетата с последующей этерификацией продукта восстановления ангидридом масляной кислоты.

Этерификацию стероидов, содержащих гидроксильную группу, проводят, как правило, в пиридине с использованием избытка ангидрида [T.W.Greene. Protective groups in organic synthesis. New-York, Wiley-Interscience, 1981, стр 110]. Этот общий метод применен в описанном способе получения заявляемого соединения (Пат. Росс. 2099347). Однако образующаяся при разложении избытка ангидрида масляная кислота затрудняет выделение целевого продукта в чистом виде. При воспроизведении описанного в аналоге способа получения для выделения продукта требуется дополнительная очистка путем перекристаллизации или хроматографии на окиси алюминия, что снижает выход продукта.

В настоящем изобретении для освобождения от избытка масляной кислоты реакционную смесь после этерификации обрабатывают раствором аммиака.

Предлагаемый способ позволяет получать целевой продукт без дополнительной очистки с выходом до 90% (в расчете на мегестрола ацетат).

Получают 3β-бутаноилокси-6-метил-17α-ацетокси-прегна-4,6-диен-20-он следующим образом.

К охлажденной суспензии 100 г мегестрола ацетата в 600 мл метанола прибавляют порциями 9,8 г боргидрида натрия. Смесь перемешивают 30 минут, после чего при охлаждении прибавляют 250 мл воды и нейтрализуют раствор добавлением разбавленной HCl до рН 7,0. Выпавший осадок С₃-карбинола фильтруют, промывают водой и сушат. Получают 97,5 г карбинола, который растворяют в 195 мл пиридина, приливают 85 мл ангидрида масляной кислоты, перемешивают при 30°С в течение 1 ч, а затем продолжают перемешивание при комнатной температуре в течение 5 ч. Для разложения избытка масляной кислоты раствор перемешивают с 40 мл воды в течение 1 ч, после чего медленно приливают к водному раствору аммиака (44 мл 25%-ного аммиака в 1,1 л воды). Смесь перемешивают 1 ч, осадок отфильтровывают и промывают водой, затем метанолом. Получают 102,8 г продукта (86,6% в расчете на мегестрола ацетат), т.пл. 118-120°С, [α]_D - 78° (с 1,0; CHCl₃), идентичного с заведомым образцом [т.пл. 117-118.5°С, [α]_D - 77° (Пат. Росс. 2099347)].

Заявляемое изобретение не очевидно для специалистов, работающих в области химиотерапии опухолей.

Несмотря на обилие в настоящее время самых разнообразных по строению и действию лекарственных препаратов противоопухолевой активности, поиск новых лекарственных средств в борьбе со злокачественными новообразованиями до настоящего времени представляет собой актуальную задачу как в отношении повышения эффективности противоопухолевых средств, так и снижения их токсичности, а также возможности использования в самых различных сочетаниях.

В связи с большой социально-экономической значимостью проблемы лечения злокачественного роста создание новых соединений представляет собой актуальную проблему как экспериментальной, так и клинической медицины.

Создание соединения потребовало длительных научных исследований, большого коллектива сотрудников - химиков, фармакологов, биологов и других специалистов, выполнявших подчас значительный объем не только творческой, но и достаточно трудоемкой и оригинальной технической работы.

Совершенно неочевидной до настоящего времени является возможность создания средств для перорального приема, содержащих гестагены - заявляемое средство является первым отечественным гестагеном, пригодным для применения внутрь.

Таким образом, заявляемое соединение, гестаген 3β-бутаноилокси-6-метил-17α-ацетоксипрегна-4,6-диен-20-он, конкурентоспособно с известными гестагенами, входящими в состав широко применяемых противоопухолевых зарубежных препаратов, а по отдельным показателям превосходит их, что, разумеется, очень ценно и в клиническом, и в социальном, и в экономическом отношениях.

1. Противоопухолевое средство для перорального введения, характеризующееся тем, что оно представляет собой 3β-бутаноилокси-6-метил-17α-ацетокси-прегна-4,6-диен-20-он формулы 1

2. Способ получения соединения формулы 1 по п.1 восстановлением мегестрола ацетата боргидридом натрия с последующей этерификацией продукта восстановления ангидридом масляной кислоты, отличающийся тем, что реакционную смесь после этерификации обрабатывают 1%-водным раствором аммиака для связывания образующейся при разложении избытка ангидрида масляной кислоты с последующим выделением образовавшегося осадка.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что раствор аммиака используют в соотношении 3:1 к объему реакционной массы.