Способ оценки аутоиммунитета к антигену печени человека

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано для оценки аутоиммунитета к ганглиозиду гепатоцитов человека. Сущность способа состоит в том, что в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа определяют содержание аутоантител IgM и IgG к ганглиозиду ткани печени, рассчитывают отношение содержания аутоантител в исследуемой сыворотке по отношению к их содержанию в отрицательном контроле и при его значении больше единицы определяют наличие аутоиммунного процесса в печени человека. Техническим результатом является разработка способа, позволяющего осуществлять диагностику аутоиммунного процесса в ткани печени с высокой точностью и специфичностью.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологическим и биохимическим методам исследования параметров биологических субстратов с целью оценки аутоиммунного процесса в печени человека.

Известен способ определения в сыворотке крови LKM-1 (аутоантител к микросомам печени и почек) (Yamamoto A.M. et al., 1993; Choudhuri К. et al., 1998). В результате определяют LKM-1 аутоантитела к микросомам печени и почек методом иммуноферментного анализа, но этим способом LKM-1 аутоантитела выявляются лишь при аутоиммунном гепатите II типа. Кроме того выработка анти-LKM-1-аутоантител индуцируется не только при аутоиммунной патологии, но и при отравлении рядом химических и лекарственных веществ (фенобарбитал, карбамазепин и др.) и также отмечается при вирусных гепатитах С и D.

Известен также способ определения антинуклеарных аутоантител (ANA) (Feltkamp Т.Е.W. 1996, Alvarez F. et al., 1999). По этому способу при диагностике аутоиммунного гепатита I типа в сыворотке крови определяют аутоантитела к антигенам структур ядра клетки (ANA) методом иммуноферментного анализа. Недостатком этого способа является то, что при аутоиммунном гепатите I типа, для дифференциальной диагностики которого преимущественно используется определение антинуклеарных аутоантител, они выявляются лишь в 70-80% случаев. Кроме того, ANA не являются специфическими аутоантителами лишь при аутоиммунном гепатите I типа и встречаются при широком спектре аутоиммунных заболеваний различной локализации, прежде всего при ревматологической патологии (системной красной волчанке, синдроме Шегрена, системной склеродермии, синдроме Шарпа), а также при ряде других нарушений аутоиммунной природы.

Наиболее близким по достижению цели является способ по Заявке № 2003115886/15, G 01 N 33/564 от 27.05.2003 г. «Способ диагностики аутоиммунных поражений печени у больных хроническими гепатитами». Этим способом определяются антимитохондриальные антитела (АМА), иммуноглобулины А, М, G и γ-глобулины. Также дополнительно определяются антиглиадиновые антитела (AGA), циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), антимитохондриальные антитела (с индексом значений - J>1,1), антиглиадиновые антитела (более 25 ед/мл), циркулирующие иммунные комплексы (более 120 ед), диагностирующие аутоиммунные поражения. Таким образом, недостатком такого метода диагностики аутоиммунного поражения печени является необходимость использования 5-ти и более тестов, которые также не являются гепатоспецифическими.

Целью предлагаемого способа является повышение эффективности, специфичности и надежности диагностики аутоиммунного поражения печени.

Нами предлагается выявление наличия аутоантител различных классов к ганглиозиду гепатоцитов человека, которые являются объектом агрессии при аутоиммунных поражениях печени. Для достижения этой цели проводят иммуноферментный анализ сывороток крови лиц, подлежащих обследованию.

Используют иммунологические планшеты, сорбированные спиртовым раствором высокоочищенного ганглиозида, полученного in situ из ткани печени человека. Определяют содержание аутоантител классов IgM и IgG к ганглиозиду ткани печени, рассчитывают отношение содержания аутоантител в исследуемой сыворотке по отношению к их содержанию в отрицательном контроле и при его значении больше единицы определяют наличие аутоиммунного процесса в печени человека.

Способ осуществляется следующим образом:

Раствор высокоочищенного ганглиозида ткани печени с концентрацией 1-10 мкг/мл в этаноле вносят в лунки иммунологического планшета по 0,02-0,05 мл и оставляют до высыхания.

В лунки 2-х планшетов (или стрипов), сорбированных раствором высокоочищенного ганглиозида гепатоцитов человека, вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки, разведенной в 100 раз фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ, рН 7,2), содержащим 0,05% БСА (или иного раствора с аналогичными свойствами).

В первую лунку планшетов (стрипов) вносят 0,1 мл ФСБ-БСА (контроль фона). Во вторую лунку планшетов (стрипов) вносят 0,1 мл, разведенной в 100 раз ФСБ-БСА, сыворотки крови здорового донора (отрицательный контроль). В третью лунку планшетов (стрипов) вносят 0,1 мл, разведенной в 100 раз, сыворотки крови с высоким уровнем специфических аутоантител (возможно использование сыворотки больных аутоиммунным гепатитом).

Планшеты закрывают крышками и выдерживают в течение 1 ч при температуре (37±0,5)°С, после чего промывают 3 раза ФСБ-БСА.

Затем в каждую лунку первого планшета (стрипа) вносят по 0,1 мл, разведенного в рабочей концентрации ФСБ-БСА, конъюгата к IgM, а в каждую лунку второго планшета (стрипа) - 0,1 мл конъюгата к IgG. Планшеты закрывают крышками и инкубируют в течение 1 ч при температуре (37±0,5)°С. После чего промывают 3 раза ФСБ-БСА. Затем во все лунки планшетов (стрипов) вносят 0,1 мл субстратно-индикаторного раствора, выдерживают в течение 30 минут в защищенном от света месте при температуре от 18 до 20°С, после чего во все лунки добавляют по 0,05 мл стоп-реагента (2N серная кислота) и немедленно производят учет результатов исследования с помощью фотометрического устройства.

На основании полученных данных оптической плотности (ОП) определяют наличие специфических аутоантител IgM и IgG к ганглиозиду печени в условных единицах. Для этого ОП исследуемой сыворотки делят на ОП отрицательной контрольной сыворотки и сравнивают с аналогичными показателями, полученными для положительной контрольной сыворотки.

Пример конкретного осуществления способа

У пациентов «А» и «Б» в чистую сухую пробирку без добавления антикоагулянта производят забор венозной или капиллярной крови, из которой впоследствии получают сыворотку общепринятым методом. Полученную сыворотку используют для исследования.

В первые две лунки каждого из двух планшетов (или стрипов), сорбированных раствором высокоочищенного ганглиозида клеток печени, вносят по 0,1 мл, разведенной в 100 раз ФСБ-БСА, сыворотки крови пациентов «А» и «Б». В другие лунки вносят по 0,1 мл ФСБ-БСА (контроль фона), в следующие лунки вносят по 0,1 мл, разведенной в 100 раз, сыворотки крови здорового донора (отрицательный контроль), в остальные лунки вносят 0,1 мл, разведенной в 100 раз, сыворотки крови больного с аутоиммунным гепатитом (положительный контроль).

Планшеты (стрипы) закрывают крышками и выдерживают в течение 1 ч при температуре (37±0,5)°С. После чего промывают 3 раза ФСБ-БСА. Затем в каждую лунку первого планшета (стрипа) вносят по 0,1 мл, разведенного ФСБ-БСА, конъюгата к IgM в рабочей концентрации, а в каждую лунку второго планшета (стрипа) - по 0,1 мл конъюгата к IgG в рабочей концентрации. Закрытые крышками планшеты инкубируют в течение 1 ч при температуре (37±0,5)°С. После чего промывают 3 раза ФСБ-БСА. Затем во все лунки планшетов (стрипов) вносят по 0,1 мл субстратно-индикаторного раствора, выдерживают в течение 30 минут, в защищенном от света месте, при температуре от 18 до 20°С, после чего во все лунки добавляют по 0,05 мл стоп-реагента (2N серная кислота) и немедленно производят учет результатов исследования с помощью фотометрического устройства.

Были получены следующие значения оптической плотности (ОП)

Аутоантитела класса IgM:

- Контроль фона (ФСБ-БСА) - 0,05

- Отрицательный контроль (сыворотка здорового донора) - 0,15

- Положительный контроль (сыворотка больного аутоиммунным гепатитом) - 1,78

- Сыворотка пациента «А» - 0,36

- Сыворотка пациента «Б» - 1,54

Уровень (индекс) аутоантител IgM к ганглиозиду гепатоцитов для положительной контрольной сыворотки (отношение величины ОП положительной контрольной сыворотки к ОП отрицательной контрольной сыворотки) составляет 1,78:0,15=11,9.

Затем определяют индекс уровня аутоантител в сыворотке крови пациента «А»: 0,36:0,15=2,4.

Аналогичным образом определяют индекс антител в сыворотке крови пациента «Б»: 1,54:0,15=10,3.

Аутоантитела класса IgG:

- Контроль фона (ФСБ-БСА) - 0,06

- Отрицательный контроль (сыворотка здорового донора) - 0,12

- Положительный контроль (сыворотка больного аутоиммунным гепатитом) - 1,92

- Сыворотка пациента «А» - 0,28

- Сыворотка пациента «Б» - 1,99

Уровень (индекс) аутоантител IgG к ганглиозиду гепатоцитов для положительной контрольной сыворотки (отношение величины ОП положительной контрольной сыворотки к ОП отрицательной контрольной сыворотки) составляет 1,92:0,12=16,0.

Затем определяют индекс уровня аутоантител в сыворотке крови пациента «А»: 0,28:0,12=2,33.

Аналогичным образом определяют индекс антител в сыворотке крови пациента «Б»: 1,99:0,12=16,6.

Таким образом, в сыворотке крови пациента «Б» содержание аутоантител к ганглиозиду гепатоцитов человека оказалось высоким как по классу IgM, так и по классу IgG, сопоставимым с их концентрацией в положительной контрольной сыворотке. Более высокое содержание аутоантител класса IgG обусловлено хронизацией процесса у больного «Б». В сыворотке крови пациента «А» содержание аутоантител к ганглиозиду гепатоцитов человека оказалось низким.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет осуществлять более объективную оценку специфического аутоиммунного компонента при гепатитах, так как основан на определении аутоантител к ганглиозиду гепатоцитов человека. Предлагаемый ганглиозид локализуется на внешней стороне мембран гепатоцитов, является биохимической основой структур ряда рецепторных образований и доступен для аутоагрессии без цитолиза гепатоцитов, что может определять первичность аутоиммунного поражения ткани печени.

Исследование уровня аутоантител к специфическому ганглиозиду гепатоцитов человека обеспечивает высокую точность, надежность и специфичность диагностики аутоиммунного процесса в ткани печени.

Использование с этой целью иммуноферментного анализа обеспечивает высокую методическую чувствительность, точность, воспроизводимость и быстродействие диагностики.

Возможность широкого практического применения обеспечивается использованием широко распространенного в учреждениях практического здравоохранения типового оборудования для иммуноферментного анализа. Высокое быстродействие при достаточной точности, наряду с комплексной автоматизацией, дает возможность эффективно использовать предлагаемый способ при массовых клинических обследованиях лиц, инфицированных вирусами гепатитов А, В, С, D, особенно с подозрением на развитие аутоиммунного процесса в печени.

Метод разработан и апробирован в лаборатории иммунохимии Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Академика И.Н.Блохиной.

Список литературы

1. Yamamoto A.M., Crestiel D., Hotberg J.C et al, «Characterization of anty-liver-kidney microsome antibody (anti-LKM-1) from hepatitis С virus-positive and negative sera//Gastroenterol., 104:1762-1767, 1993.

2. Choudhuri К., Gregorio G.V., Mieli-Vergani G. et al Immunjlogical cross-reactivity to multiple autoantigens in patients with liver kidney microsomal type 1 autoimmune hepatitis//Hepatology, 28:1177-1181, 1998.

3. Barland P., Lipstein E., Selection and use of laboratory tests in the rheumatic diseases//Am. J.Med., V.100 (suppl. 2A), 16s-23s.

4. Feltkamp T.E.W. Antinuclear antibody determination in a routine laboratory//Ann.Rheum. Dis., V.55, 723-727, 1996.

5. Alvarez F., Berg P.A., Bianchi F.B. et al., International autoimmune hepatitis group reports review of criteria for diagnosis//Hepatology, 1999, V.31, p.929-938.

6. Заявка RU 2003115886/15, G 01 N 33/564 от 27.05.2003 - «Способ диагностики аутоиммунных поражений печени у больных хроническими гепатитами».

Способ определения наличия аутоиммунного процесса в печени человека путем исследования сыворотки крови методом иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что определяют содержание аутоантител IgM и IgG к ганглиозиду ткани печени, рассчитывают отношение содержания аутоантител в исследуемой сыворотке по отношению к их содержанию в отрицательном контроле и при его значении больше единицы определяют наличие аутоиммунного процесса в печени человека.