Способ получения аффинного адсорбента для фракционирования целлюлолитических ферментов

Изобретение относится к области биотехнологии ферментных препаратов, может быть использовано для очистки и фракционирования целлюлолитических ферментов и касается способов получения аффинного адсорбента. Способ заключается в химическом присоединении к поверхности гидроксиапатита субстрата целлюлаз, например натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы. Изобретение обеспечивает получение аффинного адсорбента с высокой избирательностью адсорбции. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.

 

Изобретение относится к области биотехнологии ферментных препаратов, может быть использовано для очистки и фракционирования целлюлолитических ферментов и касается способа получения аффинного адсорбента на основе гидроксиапатита.

Известен способ получения гидроксиапатита (прототип), включающий стадию получения брушита (СаНРО4) путем медленного сливания 0.5М растворов CaCl2 и Na2HPO4 (по 2 л), фильтрование брушита, его 4-кратную промывку тремя литрами воды, обработку суспензии брушита в 3 л воды 100 мл 40%-ного NaOH при кипячении в течение 1 часа (нагрев 45 мин) при постоянном медленном перемешивании, отделение гидроксиапатита от очень мутного супернатанта фильтрованием, 4-кратную промывку гидроксиапатита тремя литрами воды, 2-кратную обработку 0.01М фосфатным буфером (рН 6.8) при нагревании до 100°C и 2-кратную обработку 0.001М фосфатным буфером (рН 6.8) при кипячении в течение 15 мин (Справочник биохимика: Пер. с англ. / Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. - М.: Мир, 1991. - С.463).

Недостатками адсорбента, получаемого по данному способу, является низкая избирательность адсорбции целлюлолитических ферментов. Поэтому при фракционировании экзо- и эндоглюканаз на колонках необходимо использовать ступенчатый или линейный градиент концентрации буфера, а при разделении экзо- и эндоглюканаз с помощью адсорбции в объеме - ступенчатую промывку адсорбента, что усложняет процесс фракционирования.

Технический результат настоящего изобретения заключается в получении аффинного адсорбента на основе гидроксиапатита с высокой избирательностью адсорбции экзоглюканаз.

Технический результат достигается путем химического присоединения к поверхности гидроксиапатита субстрата целлюлолитических ферментов, например натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы.

Способ осуществляют следующим образом. Проводят стадию получения брушита путем медленного сливания растворов CaCl2 и Na2HPO4 аналогично тому, как это описано в прототипе. Для получения аффинного адсорбента к суспензии брушита добавляют раствор натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ) в пропорции от 2:1 до 1:1 по сухому веществу, доводят рН среды до 13.0 раствором гидроксида натрия и нагревают реакционную смесь в кипящей водяной бане в течение 1 часа при постоянном медленном перемешивании.

Для получения аффинного гидроксиапатита (адсорбента) может быть использован кристаллический гидроксиапатит. В этом случае предварительно проводят его активацию путем обработки орто-фосфорной кислотой при рН среды от 4.0 до 4.5.

При нагревании брушита в сильнощелочной среде в присутствии Na-КМЦ происходит образование гидроксиапатита, при этом гидроксильные группы Na-КМЦ включаются в его кристаллическую решетку. Это приводит к присоединению Na-КМЦ к поверхности гидроксиапатита. Поперечная сшивка частиц гидроксиапатита полимерными цепями Na-КМЦ способствует образованию ограниченно набухающего в воде материала.

Пример 1. К 1470.6 см3 0.5М раствора CaCl2 медленно приливают при перемешивании 1470.6 см3 0.5М раствора Na2HPO4 (стехиометрический выход брушита 100 г). Брушит отфильтровывают, проводят его 4-кратную промывку тремя литрами воды и суспендируют в 1.0 дм3 дистиллированной воды. К суспензии брушита приливают 500 см3 раствора Na-КМЦ с массовой концентрацией 100 г/дм3, перемешивают в течение 10 минут, после чего добавляют 40%-ный раствор гидроксида натрия до установления рН среды 13.0. Смесь помещают в кипящую водяную баню и выдерживают в течение 1 часа до осаждения целевого продукта и получения прозрачной надосадочной жидкости. Образовавшуюся массу отделяют от раствора центрифугированием или фильтрованием, высушивают при 110°C и размалывают.

Пример 2. Аналогично примеру 1, добавляя к суспензии брушита 1000 см3 раствора Na-КМЦ с массовой концентрацией 100 г/дм3.

Пример 3. К суспензии 100 г гидроксиапатита (фракция от 100 до 250 мкм) в 1000 см3 дистиллированной воды приливают раствор ортофосфорной кислоты до установления рН среды от 4.0 до 4.5 и перемешивают в течение 10 минут для активации гидроксиапатита. Далее приливают 500 см раствора Na-КМЦ с массовой концентрацией 100 г/дм3, перемешивают в течение 10 минут, после чего добавляют 40%-ный раствор гидроксида натрия до установления рН среды 13.0. Смесь помещают в кипящую водяную баню и выдерживают в течение 1 часа до осаждения целевого продукта и получения прозрачной надосадочной жидкости. Образовавшуюся массу отделяют от раствора центрифугированием или фильтрованием, высушивают при 110°C и размалывают.

Пример 4. Аналогично примеру 3, добавляя к суспензии гидроксиапатита после активации 1000 см3 раствора Na-КМЦ с массовой концентрацией 100 г/дм3.

Емкость адсорбентов по эндо- и экзоглюканазам определяют адсорбцией в объеме. Для этого порцию раствора ферментного препарата Целловиридин Г20х после диафильтрации против 2000 дм3 0.01М ацетатного буфера обрабатывают навеской адсорбента при перемешивании в течение 30 мин и 4°C. Адсорбент отфильтровывают и определяют активности ферментов в растворах. Емкость адсорбентов по эндо- и экзоглюканазам рассчитывают по разности суммарных активностей растворов до и после обработки.

Единица эндоглюканазной активности соответствует количеству фермента, приводящему к снижению относительной вязкости 0.3%-ного раствора Na-КМЦ, равному 1 мин-1, при рН 4.5 и 30°C.

Единица экзоглюканазной активности соответствует количеству фермента, приводящему к расщеплению хроматографической бумаги с образованием 1 мг глюкозы за 1 час при рН 4.5 и 50°C. Характеристики адсорбентов, полученных по примерам 1-4, приведены в таблице 1.

Таблица 1
ПримерВыход, % от массы адсорбентаНасыпная плотность, г/см3Набухаемость*, см3Фильтрующие свойства**, мл/см2×часЕмкость по эндоглюканазе, ед/гЕмкость по экзоглюканазе, ед/г
1.124.30.895.8576.6-212.3
2.142.30.99.7862.7-238.0
3.117.30.778.6747.5-243.8
4.133.70.7812.9744.0-271.5
прототип-0.771.435.64432.0206.3
* - в дистиллированной воде при рН 6.0;

** - скорость свободного истечения 0.01М ацетатного буфера рН 4.7 через слой адсорбента площадью 1 см2 и высотой 1 см (мл/см2×час).

1. Способ получения аффинного адсорбента для фракционирования целлюлолитических ферментов, предусматривающий получение брушита из кальция хлорида, путем обработки его гидрофосфатом натрия, фильтрование брушита, его 4-кратную промывку водой и суспендирование в дистиллированной воде, отличающийся тем, что суспензию брушита обрабатывают раствором Na-КМЦ при массовом соотношении от 2:1 до 1:1, перемешивают в течение 10 мин, после чего добавляют 40%-ный раствор гидроксида натрия до установления рН 13, с последующим кипячением смеси в течение 1 ч до осаждения целевого продукта, отделением его и высушиванием.

2. Способ получения аффинного адсорбента для фракционирования целлюлолитических ферментов, отличающийся тем, что кристаллический гидроксиапатит суспендируют в дистиллированной воде, активируют раствором ортофосфорной кислоты при рН от 4,0 до 4,5, перемешивают в течение 10 мин, обрабатывают раствором Na-КМЦ при массовом соотношении 2:1 до 1:1, перемешивают в течение 10 мин, после чего добавляют 40%-ный раствор гидроксида натрия до установления рН 13, с последующим кипячением смеси в течение 1 ч до осаждения целевого продукта, отделением его и высушиванием.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения афинного сорбента для очистки коллагеназ, и может быть использовано для выделения высокоочищенных и высокоактивных ферментных препаратов, которые используются в медицине, биохимии, пищевой промышленности, в ферментативном синтезе пептидов, а также для исследовательских целей.
Изобретение относится к медицине, неврологии, лечению церебрастенического синдрома (ЦС) и заключается в проведении терапии с учетом данных комплексного обследования ребенка.
Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для лечения осложнений после экстракции катаракты с имплантацией искусственного хрусталика глаза, сопровождающихся фибринозной экссудацией.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения химических ожогов пищевода. .
Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано при лечении оптического неврита при оптохиазмальном арахноидите в стадии ремиссии.
Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для лечения больных, страдающих глаукомной оптической нейропатией. .

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для профилактики развития онкологических заболеваний, или инфекций, вызываемых бактериями, грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, или заболеваний, развивающихся вследствие мутаций генов соматических клеток.

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для лечения заболеваний, сопровождающихся изменениями внеклеточной ДНК крови, а именно: генерализованных инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, или заболеваний, вызываемых грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, а также заболеваний, обусловленных мутациями генов соматических клеток.
Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и касается лечения больных в раннем послеоперационном периоде после вмешательств на органах средостения, пищеводе.
Изобретение относится к фармации, а именно к способам получения гемостатических препаратов. .
Изобретение относится к медицине, оториноларингологии, и может быть использовано при лечении хронического гнойного среднего отита и болезни трепанационной полости
Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано в качестве метода лимфостимуляции при нарушениях гемолимфоциркуляции нижних конечностей у больных с синдромом диабетической стопы
Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано в качестве метода стимуляции лимфотока коленного сустава у больных с синдром диабетической стопы
Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано при лечении рецидивирующих увеитов
Изобретение относится к медицине, а именно к челюстно-лицевой хирургии, и может быть использовано при лечении больных с переломами нижней челюсти
Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, эфферентным методам в медицине, и может быть использовано при лечении распространенного гнойного перитонита
Изобретение относится к медицине, а именно к анестезиологии и реаниматологии, и может быть использовано для защиты гортани во время пролонгированной интубации трахеи
Изобретение относится к медицине, к офтальмологии, и может быть использовано для определения показаний к дифференцированному лечению больных с ранней гипертензией в послеоперационном периоде антиглаукоматозных операций фильтрующего типа

Изобретение относится к лекарственным средствам, применяемым для лечения и профилактики заболеваний, связанных с недостаточностью или отсутствием в организме человека фермента лактазы

Изобретение относится к области биотехнологии ферментных препаратов, может быть использовано для очистки и фракционирования целлюлолитических ферментов и касается способов получения аффинного адсорбента

Наверх