Способ получения рекомбинантного интерферона альфа-2b и интерферонсодержащий препарат (варианты)
Владельцы патента RU 2294372:
ООО "ЦИТОКИН" (RU)
ФГУП ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ИНСТИТУТ ОСОБО ЧИСТЫХ БИОПРЕПАРАТОВ (RU)
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантного лейкоцитарного интерферона альфа-2b человека и может быть использовано в медицине. Интерферон альфа-2b человека получают путем культивирования трансформированного штамма E.coli BL21 (DES) [pAYC-ET-(hIFN-α2b)-lacI] в питательной среде, разрушения клеток микроорганизма, удаления ДНК и РНК, концентрирования полученного продукта отмывкой белка, центрифугирования и денатурации образовавшегося осадка в растворе гуанидин гидрохлорида в присутствии 0,05-0,15 мас.% метионина с последующей ренатурацией интерферона в присутствии 0,3-0,5 М аргинина, и его очистки последовательно на катионите Солоза КГ 20/30, Sp-целлюлозе и фенил-Сефарозе CL 4В. Изобретение позволяет существенно повысить выход лейкоцитарного интерферона альфа-2В человека медицинского назначения. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 5 табл.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к препаратам рекомбинантного интерферона альфа-2в человека медицинского назначения (далее ИНТ) и способам их получения.
Известны способы получения интерферона человека из лейкоцитов донорской крови человека, индуцированных вирусами, двуцепочечными РНК и другими индукторами (а.с. СССР №297296, 1970; №1366064, 1983, №1713591, 1986, кл. С 12 N 15/00; пат. РФ №1364343, 1984; №1709615, 1990; №2066188, 1993, кл. С 12 N 15/00).
Недостатками этих способов являются, как правило, низкий выход продукта, невозможность масштабирования этого процесса, вероятность контаминации конечного продукта вирусами человека, такими как вирус гепатита В и С, вируса иммунодефицита и др. Кроме того, к недостаткам следует отнести наличие в конечных очищенных препаратах примесей окисленного белка, димеров и других молекулярных вариантов. Поэтому в настоящее время более перспективным признан способ получения ИНТ микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Используемые при этом химические подходы позволяют создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию.
В настоящее время в качестве исходных микроорганизмов используют в основном различные искусственно сконструированные штаммы Р. Pastoris, Ps. putida и Е.coli.
Недостатком штамма Р.Pastoris (J.N.Garcia, J.A.Aguiar et. al. // High level expression of human IFN-2в in Pichia pastoris. // Biotecnologia Aplicada, 12(3), 152-155, 1995) является низкий уровень выхода целевого продукта на грамм биомассы, а штамма Ps. putida (Пат. СССР №1640996, 1989, кл. С 12 N 15/00) - сложность выделения конечного продукта и, следовательно, трудоемкость и высокая себестоимость процесса с его участием.
Использование в качестве продуцентов штаммов Е.coli: [ATCC 31633 и 31644 (пат. УР №13380, 1997, С 12 N 15/21); НВ 101 (пат. СССР №1417800, 1985, кл. С 12 N 15/00), SG 20050 (Кравченко В.В. и др. Биоорганическая химия, 1987, т.13, N 9, с.1186-1193)] позволяет получать препараты интерферона с достаточно высоким выходом, однако выход конечного продукта во многом определяется технологией выделения, концентрирования и очистки ИНТ.
Известен способ получения ИНТ, включающий в себя культивирование клеток Ps. putida, разрушении биомассы, обработку полиэтиленимином, фракционирование сернокислым аммонием, гидрофобную хроматографию на фенилсилохроме С-80, рН-фракционирование лизата, его концентрирование и диафильтрацию, ионообменную хроматографию на целлюлозе DE-52, элюирование в градиенте рН, ионообменную хроматографию полученного элюента на целлюлозе СМ-52, концентрирование пропусканием через кассету фильтров и гель- фильтрацию на Сефадексе G-100 (А.св. СССР №1640996, 1995, кл. С 07 К 14/56).
Недостатком способа является его низкая продуктивность при использовании технологии на основе клеток Ps. Putida, а также многостадийность и большие потери конечного продукта.
Известен способ получения ИНТ, включающий в себя культивирование штамма Е.coli SG 20050/pIF16, в LB-бульоне в колбах на качалке, центрифугирование биомассы, ее промывку буферным раствором и обработку ультразвуком для разрушения клеток. Полученный лизат центрифугируют, промывают 6М раствором мочевины в буферном растворе, содержащем хлористый натрий, калий фосфат и этилендиамина тетраацетат натрия (EDTA), растворяют в растворе гуанидин гидрохлорида и центрифугируют (пат. РФ №2054041, 1996, кл. С 12 N 15/21).
Недостатками способа являются его относительно невысокая производительность, неустойчивость продуцента в процессе ферментации и, как следствие, нестабильность выхода интерферона.
Известен способ получения ИНТ, заключающийся в культивировании штамма E.coli 294 АТСС 31446, трансформированного введением плазмид, замораживании полученных клеток, их разрушении механическими методами, суспендировании в буферном растворе и гомогенизировании. Для удалении ДНК и РНК к гомогенизату добавляют полиэтиленимин, после чего удаляют фильтрацией или центрифугированием твердые вещества. Верхний слой концентрируют ультрафильтрацией, а затем подвергают сначала аффинной хроматографии, регулированию рН, а затем подвергают ионообменной хроматографии на целлюлозе СМ-52 или ее эквиваленте с использованием буферных растворов (пат. СССР №1414319, 1981, кл. С 12 N 15/00). Недостатком способа является его многостадийность и низкая технологичность.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ выделения и очистки ИНТ из штамма Escherichia coli SS5 (пат. РФ №2165455, 1999, кл. С 12 N 15/21).
Способ заключается в культивировании в питательной среде штамма Escherichia coli SS5, разрушении клеток микроорганизма обработкой их 1-2 мас.% лизоцимом, удалении ДНК и РНК введением в лизат избытка ДНК-азы при комнатной температуре в течение по крайней мере 1 часа и очисткой белка отмывкой детергентами, центрифугированием, растворением осадка в 6М буферном растворе гуанидин гидрохлорида, последующей ренатурацией ИНТ в буферном растворе, содержащем детергенты, такие как Твин-20, Тритон Х-100, Тритон Х-114 или полигистидин и очистке ИНТ с помощью ионообменной хроматографии на ионообменных смолах типа Ватман СМ-52 целлюлоза.
Выход ИНТ в результате применения способа в оптимальном режиме составляет 200 мг с 1 л культуральной среды.
Недостатком способа является нестабильность штамма при работе в производственных условиях и невысокий выход высокоочищенного ИНТ.
Вместе с тем, наряду с проблемой получения препарата интерферона с максимальным выходом, важнейшее значение имеет получения препарата, достаточно стабильного при длительном хранении. Подобно другим протеинам, интерферон подвергается, особенно в водных растворах, модификации и химическому разложению за счет протекания процессов протеолиза, окисления, дисульфидного обмена и т.д. Кроме того, на его биологическую активность негативно воздействуют такие факторы, как агрегация, осаждение и адсорбция.
Для уменьшения потерь активности интерферона в состав лекарственной формы вводят различные стабилизирующие добавки. Известно использование в качестве стабилизаторов биологической активности интерферона человеческого альбумина (ЕР №0133767, А 61 К 45/02, 1984), сахаров - глюкозы, маннозы, галактозы, фруктозы, сахарозы и др. (ЕР №0133767, А 61 К 45/02, 1984), декстранов и гидроксиэтилкрахмала (ЕР №0150067, А 61 К 45/02,1985), полиэтиленгликоля и гидроксиэтилцеллюлозы (ЕР №0152345, А 61 К 45/02, 1985), поликарбоновых кислот сополимеров метилметакрилата и малеиновой кислоты, Na-соли карбоксиметилцеллюлозы и ксилита (DE №3642223, А 61 К 45/02, 1988).
Однако использование известных добавок вызывает в свою очередь определенные проблемы. Так, применение человеческого альбумина как стабилизатора лекарственных форм интерферонов связано с дополнительным контролем полученных лекарственных форм на отсутствие вируса гепатита В, вируса СПИДа. Использование этого компонента ограничено также недостаточностью сырья донорской крови.
При использовании в качестве стабилизирующих веществ аминокислот или их производных в смеси с человеческим альбумином (ЕР №0082481, А 61 К 45/02, 1982 или US №4496537, А 61 К 45/02, 1983) биологическая стабильность этой композиции сохранялась в достаточной степени только 6 месяцев. Кроме того, данной композиции свойственны описанные выше недостатки, связанные с применением человеческого альбумина.
Кроме того, использование указанных добавок эффективно только для стабилизации препарата в сухом виде и мало эффективно применительно к жидким формам ИНТ.
Известна интерферонсодержащая композиция, содержащая наряду с интерфероном частично гидролизованный декстран (полиглюкин), хлорид натрия и фосфатную смесь (компоненты фосфатного буферного раствора) (RU №2095081, А 61 К 38/21, 1997). Однако в данной смеси при длительном хранении образуется до 25% окисленного интерферона и до 10% продуктов его димеризации, что затрудняет его использование в клинической практике без дополнительной обработки. Кроме того, композиция не может храниться длительное время в виде раствора, что ограничивает возможности ее использования.
Известна созданная ранее авторами настоящего патента композиция, содержащая на 1-100 млн ME интерферона α-2, 0.05-0,1 мг ацетата α-токоферола, 0.02-10 мг органической кислоты, способной кристаллизоваться без разложения (аскорбиновая, лимонная, глициновая, мочевая, янтарная и т.п.), и буферообразующие соли, (1М фосфатный, ацетатный, карбонатный или трис- буферные растворы) обеспечивающие в водном растворе рН 7,4 (Патент РФ №2165455, 2001).
Композиция обеспечивает хорошую сохранность препарата при хранении - 96-98% активного интерферона при хранении в течение 6 месяцев, может храниться достаточно долго в виде раствора, однако среди активного интерферона анализ обнаруживает 3-5% димеров и 10-20% окисленного интерферона.
Наиболее близкой по составу к заявляемой композиции является препарат, содержащий рекомбинантный альфа-2 интерферон человека с активностью 10-20 млн МЕ/мл и содержанием белка 0.1-0.2 мг/мл; многоатомный спирт (манит или сорбит) 1.0-5.0 мг/мл, мочевину или ЭДТА 0.05-3.0 мг/мл; плазмозамещающий раствор, в частности полиглюкин 4.0-12 мг/мл, фосфатно-солевой буфер с рН 7.0-7.6 11.0-14.5 мг/мл (пат. РФ №2236866, 2002).
Композиция обеспечивает хорошую сохранность препарата при хранении в сухом виде при комнатной температуре - 70-90% активного интерферона при хранении в течение 6 месяцев, однако ее применение не позволяет сохранять препарат в достаточно долго в виде раствора, кроме того, среди активного интерферона анализ обнаруживает значительное количество димеров и более 20% окисленного интерферона.
В этой связи перед авторами стояла задача получения стабильной композиции ИНТ при его хранении как в сухой, так и в жидкой формах и способа его получения.
В ходе разработки технологии получения композиции стабильного препарата ИНТ авторами было установлено, что на скорость деструкции интерферона существенное значение влияет наличие в препарате, закладываемом на хранение различных примесей, в частности продуктов его окисления (ИО) и димеризации (ИД). В частности, в таблице 1 показано влияние наличия ИО и ИД в исходном препарате на изменение активности ИНТ при хранении.
| Таблица 1 | ||||
| Влияние наличия продуктов окисления и димеризации ИНТ в исходном препарате на изменение его активности ИНТ при хранении в виде раствора при температуре +37°С. | ||||
| Характеристика исходной смеси | Активность ИНТ после 12 недель хранения, МЕ/мл | Сохранение активности ИНТ, % | ||
| Содержание ИО, % | Содержание ИД, % | Активность ИНТ, МЕ/мл | ||
| 1,2±0.3 | 1,2±0.3 | (10.5±0.8)×106 | (9.2±0.6)×106 | 87,6 |
| 4,2±0.3 | 2,8±0.6 | (10.3±2.6)×106 | (4.2±0.6)×106 | 40,8 |
| 4.6±0.6 | 6.8±3.3 | (10.6±0.8)×106 | (1,2±0.6)×106 | 11.3 |
| 7.6±0.6 | 23,8±0.3 | (12.5±1.8)×106 | (2.2±0.6)×105 | 1.8 |
Исходя из этого была поставлена задача разработать технологию получения ИНТ, позволяющую наряду с получением ИНТ с высоким выходом минимизировать содержание в конечном продукте ИО и ИД, и создана на основе получаемого продукта интерферонсодержащая композиция, стабильная при хранении как в сухой, так и в жидкой формах.
Указанная задача в отношении способа решалась путем использования штамма E.coli BL21 (DE3) [pAYC-ET-(hIFN-α2b)-lacI], обладающего более высокой продуцирующей способностью по сравнению с известными аналогами.
Штамм Е.coli BL21 (DE3) [pAYC-ET-(hIFN-(α2b)-lacI] - продуцент рекомбинантного интерферона-α2b человека был получен в результате трансформации реципиентного штамма Е.coli BL21(DE3), созданной in vitro плазмидой pAYC-ET-(hlFN-α2b)-lacI.
Реципиентный штамм Е.coli BL21 (DE3) (F-ompTr- Bm- Blon; λD69imm21int::(lacI→PlacUV5-T7_gene1)) получен в лаборатории проф. Студиера (США) [Studier, F.W. and Moffatt, B.A. //. J. Mol. Biol. 189 (1986) 113-130] на основе штамма Е.coli BL21 путем введения профага λD69imm21, в котором в область гена int предварительно с помощью технологии генной инженерии была введена искусственная кассета, содержащая нативный ген репрессора лактозного оперона Е.coli (lacI), а также структурная часть гена, кодирующего РНК полимеразу бактериофага Т7 (gene 1, Т7) под контролем промотора pIacuv5 Е.coli.
Этот штамм широко применяется в лабораторной практике как специализированный реципиент для обеспечения индуцибельной (при добавлении IPTG) экспрессии генов, транскрибирующихся под контролем промоторов, узнаваемых РНК полимеразой бактериофага Т7 (Studier, F. W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J. and Dubendorff, J.W. // Methods in Enzymology, 185 (1990) 60-89).
Рекомбинантная плазмида pAYC-ET-(hIFN-α2b)-lacI вводилась в реципиентный штамм Е.coli BL21 (DE3) стандартным методом Са2+ - зависимой трансформации клеток, (Sambrook J., Fritsch Е., Maniatis T.H Molecular Cloning. A Laboratory Manual. - New York: Cold Spring Harbor, 1989), с последующим отбором целевых трансформантов на агаризованной питательной среде, содержащей стрептомицин (Sm) в концентрации 50 мкг/мл.
Рекомбинантная плазмида pAYC-ET-(hIFN-α2b)-lacI была получена по стандартным генно-инженерным методикам (Sambrook J., Fritsch Е., Maniatis T.H Molecular Cloning. A Laboratory Manual. - New York: Cold Spring Harbor, 1989) на основе pAYC32 в качестве вектора. Конструирование pAYC32 на основе плазмиды RSF1010 и ее нуклеотидная последовательность описаны в литературе (Tsygankov, Y.D. and Chistoserdov, A.Y. // Plasmid 14(1985) 118-125;. Chistoserdov, A.Y., and Tsygankov, Y.D. //. Plasmid 16 (1986) 161-167).
Штамм E.coli BL21(DE3) [pAYC-ET-(hIFN-α2b)-lacI] характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки. Грамотрицательные прямые палочки с закругленными краями, размером 1.1-1.5×2.0-3.0 мкм, одиночные, спор и капсул не образуют. Колонии на питательном агаре LB гладкие, слабовыпуклые, с ровным краем. В жидких средах образуют равномерную муть. Штамм идентифицирован по Определителю Берги (1974) как штамм вида Escherichia coli.
Физико-биологические признаки. Типичные для Escherichia coli. Каталазоположительные. Оксидазоотрицательные. Факультативные анаэробы. Катаболизируют D-глюкозу, L-арабинозу, D-ксилозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, маннит, D-маннозу, L-рамнозу, сорбит, тригаллозу с образованием кислоты (и газа). Не гидролизуют желатину, мочевину, индол (+), триптофандезаминаза (-), лизиндекарбоксилаза (+), рост в присутствии KCN (-), малонат не используют, пигмент не образуют. Реакция «Фогес-Проскауэра» отрицательная. Не образуют H2S.
Генетические особенности. Escherichia coli BL-21 (F-, ompT, lon, hsd S, gal, r-m-) характеризуется отсутствием lon и ompT протеаз для предотвращения расщепления рекомбинантного белка и признаками, кодируемыми рекомбинантной плазмидой pAYC-ET-(hIFN-α2b)-lacI: устойчивостью к стрептомицину (Sm) (в концентрации 50 мкг/мл). Штамм лизогенен по DE3, который содержит ген Т7 RNA pol под контролем lacUV5 промотора (индукторы - IPTG, галактоза; лактоза.). Плазмида имеет размер 10,868 kbp. В результате индукции наблюдается эффективный синтез белка с молекулярной массой, характерной для зрелого интерферона - α2b человека, при этом уровень накопления этого полипептида (по данным компьютерного денситометрирования сканированного геля) составляет 10%-20% от суммарных белков.
Условия хранения штамма. Штамм хранится лиофильно высушенным (до 2 лет), криоконсервированным при -70°С (до 6 месяцев) в 15%-ном растворе глицерина (или 7% растворе диметилсульфоксида) в питательной среде LB (Бакто-триптон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, хлористый натрий - 10 г/л, рН 6.8).
Условия размножения штамма. Штамм выращивают при 30°С в L-бульоне или среде М9 (г/л: NH4CI - 1.0, КН2PO4 - 3.0, Na2HPO4 - 6.0, глюкоза - 4.0, CaCl2 - 0.01, MgSO4×7H2O - 0.12. рН среды 6,8-7,0). Все среды содержат стрептомицин в концентрации 30 мкг/см.
Условия индукции целевого белка. Индукторы - IPTG, галактоза, лактоза.
Основные свойства штамма. Является продуцентом интерферона - α2b. может быть использован для получения медицинских и ветеринарных препаратов на основе рекомбинантного интерферона - α2b.
Штамм был депонирован в ГНУ ВНИИСХМБ Россельхозакадемии 31.05.05 под регистрационным номером «ВНИИСХМ Д258».
Однако в ходе работы над технологией его внедрения выяснилось, что при использовании ранее использованной технологии очистки, предлагаемой в пат. РФ №2165455, полученный продукт содержит значительное количество окисленной формы интерферона и димеров (20% суммарно), что приводит к большим потерям активности при хранении и практически исключает его использование в качестве медицинского препарата. В этой связи была разработана технология очистки, позволяющая получить препарат с требуемыми свойствами.
Было найдено, что вышеупомянутые примеси удается устранить путем введения при денатурации 0,05-0.15 мас.% метионина в буферный раствор гуанидин гидрохлорида, что привело к исключению образования окисленной формы, но привело к сокращению выхода интерферона. Решение последней проблемы стало возможным благодаря проведению ренатурации в присутствии 0.3-0.5 М аргинина, что позволило повысить выход интерферона.
Проведение хроматографической очистки последовательно на катионите Солоза КГ 20/30, Sp-целлюлозе и фенил-Сефарозе CL 4В позволило полностью освободиться от димеров при минимальных потерях целевого продукта.
При использовании метионина в концентрации менее 0.05 мас.% не удается полностью избежать образования окисленной формы ИНТ, более 0.15 мас.% не дает дополнительного эффекта и экономически неэффективно. Использование аргинина в концентрации менее 0.3 М не позволяет получить достаточно высокий выход ИНТ, который достигает максимума при 0.5 М аргинина. Дальнейшее повышение концентрации аргинина не позволяет повысить выход ИНТ и экономически нецелесообразно.
Таким образом, технический результат достигается за счет проведения процесса культивирования с использованием штамма E.coli BL21 (DE3) [pAYC-ET-(hIFN-α2b)-lacI], проведения процесса денатурации при введении 0,05-0.15 мас.% метионина в буферный раствор гуанидин гидрохлорида, проведению ренатурации в присутствии 0.3-0.5 М аргинина и осуществлении хроматографической очистки последовательно на катионите Солоза КГ 20/30, Sp-целлюлозе и фенил-Сефарозе CL 4B. Хроматографию на катионите Солоза КГ 20/30 и Sp-целлюлозе оптимально проводить в присутствии метионина, что гарантирует исключение вероятности образования окисленной формы ИНТ.
Оптимальными условиями очистки являлись:
- на стадии очистки на Солоза КГ 20/30 - рН 6.8 с использованием в качестве растворителя трис-HCl буферного раствора, содержавшего, 1 mM этилен-диаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 0,1 мас.% метионина;
- на стадии очистки на Sp-целлюлозе: колонка уравновешивается 0,05 М трис-HCl буферным раствором, содержащим 1 mM ЭДТА и 0,1 мас.% метионина; отмывается сначала с использованием уравновешивающего буферного раствора, а затем 0,1 М фосфатным буферный раствор с 1 mM ЭДТА при рН 5,2. Элюцию проводят 0,1 М фосфатным буферным раствором при рН 8,2.
- хроматографию на фенил-Сефарозе проводят с использованием в качестве уравновешивающего раствора 0,1 М фосфатный буферный раствор с 1 mM ЭДТА и 0.01-0.001% Твин-20 при рН 7,4.
В полученный в результате использования указанной технологии конечный продукт добавляют натриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), альфа-токоферол ацетат (АТА) и полиглюкин с получением интерферонсодержащей композиции, содержащей по одному варианту следующие ингредиенты:
- для препарата в сухой лиофилизированной форме:
| Рекомбинантный альфа-2 интерферон человека | |
| с активностью 2·106-4·107 МЕ/мл | 1-100 мкг/мл |
| Ацетат α-токоферола | 0,1-5 мкг/мл |
| Полиглюкин | 0.1-1.0 мг/мл |
| ЭДТА | - 0.8-1.6 мг/мл |
буферобразующие соли в количестве, обеспечивающем рН в диапазоне от 5.0 до 8.4, причем содержание неидентифицированных примесей составляет 0.01-0.1 мг/мл;
а по второму варианту - для препарата в жидкой форме-
| Рекомбинантный альфа-2 интерферон человека | |
| с активностью 2·106-4·107 МЕ/мл | 1-100 мкг/мл |
| Ацетат α-токоферола | 0,1-5 мкг/мл |
| Полиглюкин | 0.1-1.0 мг/мл |
| ЭДТА | 0.8-1.6 мг/мл |
| Неидентифицированные примеси | 0.01-0.1 мг/мл |
буферный раствор, обеспечивающий рН в диапазоне от 5.0 до 8.4, остальное Сопоставление предлагаемой композиции и ближайшего аналога показало, что в заявляемой композиции исключено введение многоатомного спирта,. В его состав вводят АТА (в дозе, в 10 раз меньшую, чем в известных рецептурах, полиглюкин - в дозе, от 10 до 100 раз меньшем, чем в прототипе.
Полученная композиция способна сохранять активность ИНТ как в сухой, так и в жидкой форме в широком диапазоне рН - от 5.0 до 8.4, что является ее дополнительным (явление, не наблюдаемое в других композициях) преимуществом (см. Табл.2).
| Таблица 2 | ||||
| Влияние рН раствора ИНТ на изменение его активности при хранении при +37°С. | ||||
| Характеристика исходной смеси | Активность ИНТ после 12 недель хранения, МЕ/мл | Сохранение активности ИНТ, % | ||
| рН | Содержание ИД+ИО, % | Активность ИНТ, МЕ/мл | ||
| 5.0 | 0.02±0.001 | (10.5±0.8)×106 | (9.2±0.6)×106 | 87,6 |
| 5.4 | 0.02±0.001 | (10.5±0.8)×106 | (9.6±0.4)×106 | 91,4 |
| 5.8 | 0.03±0.001 | (10.9±0.8)×106 | (9.2±0.6)×106 | 84.4 |
| 6.2 | 0.02±0.001 | (11.2±0.8)×106 | (10.2±0.6)×l05 | 91.1 |
| 6.6 | 0.02±0.001 | (10.8±0.8)×106 | (9.4±0.6)×105 | 87.0 |
| 7.0 | 0.02±0.001 | (10.9±0.8)×106 | (9.2±0.7)×105 | 84.4 |
| 7.4 | 0.04±0.001 | (10.9±0.8)×106 | (9.2±0.6)×105 | 84.4 |
| 7.8 | 0.02±0.001 | (10.9±0.8)×106 | (9.2±0.7)×105 | 84.4 |
| 8.0 | 0.04±0.001 | (10.9±0.8)×106 | (9.4±0.6)×105 | 86.2 |
| 8.2 | 0.02±0.001 | (10.9±0.8)×106 | (9.6±0.6)×105 | 88.1 |
| 8.4 | 0.04±0.001 | (11.8±0.8)×106 | (10.8±0.6)×105 | 91.5 |
Сущность и преимущества заявляемого способа иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. К тельцам включения, полученным из 40 г биомассы штамма E.coli BL21 (DE3) [pAYC-ET-(hIFN-α2b)-lacI] (отцентрифугированным при 20×103 об/мин в течение 15-20 мин), добавляли 80 мл раствора следующего состава: 8 М гуанидин гидрохлорид, 0,1 М трис-HCl, рН 7,8-8,0, 1 mM ЭДТА, 0,1% метионин, перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 1 часа, центрифугировали при 20×103 об/мин и помещали полученный супернатант на 1,5-2 часа в морозильную камеры. После размораживания раствор выдерживался 30-40 мин при 37°С.
Затем к нему при перемешивании на магнитной мешалке добавляяли 1 л олажденного до +2-4°С раствора следующего состава: 0,1М трис-HCl, рН 7,8-8,0, 1 mM ЭДТА, 0,1% метионин, 0,5 М аргинин.
Ренатурационный раствор титровали 0,2 М HCl до рН 6,8, центрифугировали 30 мин при 14×10 об/мин. Супернатант наносили на колонку, содержащую катионит Солоза КГ 20/30 и промывали трис-HCl буферным раствором, содержащим 1 mM ЭДТА и 0,1% метионин, при рН 6,8. Первые 250 мл отбрасывали, последующие 1.5 л (проскок) собирали и ценрифугировали 60 мин при 14×103 об/мин.
Супернатант наносили на колонку, содержащую 100 мл Sp-целлюлозы, уравновешенную 0,05 М трис-HCl буферным раствором, содержащим 1 mM ЭДТА и 0,1% метионин, при рН 5,2. Отмывали сорбент 300 мл уравновешивающего буфера, затем 300 мл 0,1 М фосфатным буфером рН 5,2 с 1 mM ЭДТА. Элюцию проводили 0,1 М фосфатным буфером рН 8,2. Полученный элюат титровали до рН 7,4 1 М фосфорной кислотой и наносили на колонку, содержащую 100 мл фенил-Сефарозы, уравновешенной 0,1 М фосфатным буфером с 1 mM ЭДТА при рН 7,4 и 0.01-0.1% Твин 20. Первые 300 мл отбрасывали, следующие 500 мл собирали и концентрировали. Используя данную схему очистки, нарабатывали несколько партий INF. Результаты представлены в таблице.3
| Таблица 3 | |||||
| Характеристика полученных партий интерферона | |||||
| Кол-во биомассы, г | Объем, мл | Сб., Мг/мл | Mr | Удельная активность, Ед/мг | Кол-во ЛПС, Нг/мл |
| 15 | 530 | 0,23 | 130 | 1,7×108 | 4 |
| 5 | 310 | 0,175 | 55 | 2,8×108 | 5 |
Средний выход из 100 г биомассы составлял 1150 мг. Электрофорез в редуцирующих и нередуцирующих условиях показал, что молекулярная масса полученного белка составляет порядка 18 кДа, содержание примесей не более 5%. Удельная активность INF составляла 1,7-2,2×108 ед/мг белка.
Пример 2. В условиях примера 1 проводили опыты по влиянию условий денатурации и ренатурации на выход целевого продукта. Полученные результаты приведены в таблице 4 (буфер А: 0,1 М трис-HCl, 0,2 mM ЭДТА рН, 8,0)
| Таблица 4 | |||
| Влияние условий денатурации и ренатурации на выход целевого продукта | |||
| № | Условия денатурации | Условия ретанурации | Количество INF (ИФА), мг |
| 2 | 6 М гуанидин + 0,1% метионина | Буфер А + 0,5 М аргинина | 25,0 |
| 3 | 6 М гуанидин + 0,05% метионина | Буфер А + 0,3 М аргинина | 21,0 |
| 4 | 6 М гуанидин + 0,15% метионина | Буфер А + 0,4 М аргинина | 23,8 |
| 5 | 6 М гуанидин | Буфер А | 12,5 |
| 6 | 6 М гуанидин + 0,1% метионина | Буфер А | 12,3 |
Пример З. Препарат ИНТ для испытаний на стабильность готовили следующим образом. Генно-инженерный интерферон в виде жидкой субстанции (от 2·106 МЕ/мл до 4·107 ME/мл) в количестве от 0.5 мл до 2.5 мл, полученный по примеру 1, забуференный до заданного рН, смешивают с заданными количествами полиглюкина и ЭДТА и при необходимости корректируют рН добавлением 10М NaOH. К полученной смеси добавляют водно-спиртовый раствор ацетат α-токоферола. Полученную смесь переносят во флаконы или ампулы и завальцовывают или запаивают. При необходимости полученную жидкую смесь замораживают во флаконах или ампулах (незавальцованных и незапаянных) и затем лиофильно высушивают.
Для экспериментальной проверки заявленного способа (смеси) стабилизации препарата были приготовлены сухие и жидкие смеси, содержащие указанные компоненты в соотношениях, приведенных в таблице 1, а также контрольные смеси, не содержащие ряд компонентов. До и после шестимесячного хранения было проведено определение биологической активности препарата на клетках диплоидной ткани опухоли легкого человека в присутствии (против) вируса везикулярного стоматита. При определении активности препарата сухие формы разводили в соответствующем количестве воды, а жидкие использовали без дальнейшей обработки.
Стабильность сухих и жидких форм препарата интерферона-α-2 при хранении (температура 4°С) приведена в таблице 5.
| Таблица 5 | |||||||
| Влияние состава препарата на активность интерферона при хранении. | |||||||
| Состав препарата | Результаты хранения | ||||||
| ИНТ, МЕ/мл ×106 | Полиглюкин, мг/мл | АТА, мкг/мл | ЭД-ТА, мг/мл | ИО+ИД, мкг/мл | рН | Активность ИНТ, МЕ/мл ×106 | Степень сохранения активности, % |
| Хранение жидкой формы в течение 12 недель при +37°С | |||||||
| 10.6±1.8 | 0 | 0.1 | 1.2 | 0.04±0.01 | 6.0 | 4.2±0.6 | 39.6 |
| 10.5±0.8 | 0.01 | 0.1 | 1.2 | 0.04±0.01 | 6.0 | 9.2±0.6 | 87.6 |
| 10.6±1.8 | 0.1 | 0.1 | 1.2 | 0.04±0.01 | 6.0 | 9.2±0.8 | 86.8 |
| 10.5±0.8 | 0.5 | 0.1 | 1.2 | 0.04±0.01 | 6.0 | 9.5±0.8 | 89.8 |
| 10.6±1.8 | 1.0 | 0.1 | 1.2 | 0.04±0.01 | 6.0 | 9.2±0.6 | 86.8 |
| 12.5±1.8 | 10.0 | 0.1 | 1.2 | 0.04±0.01 | 6.0 | 9.2±0.6 | 73.6 |
| 10.5±0.8 | 0.1 | 0.05 | 1.2 | 0.04±0.01 | 7.0 | 9.2±0.6 | 87.6 |
| 10.6±0.8 | 0.1 | 0.1 | 1.2 | 0.03±0.01 | 7.0 | 9.6±0.6 | 90.6 |
| 10.5±0.8 | 0.1 | 0.5 | 1.2 | 0.03±0.01 | 7.0 | 9.2±0.6 | 87.6 |
| 10.3±2.6 | 0.1 | 1 | 1.2 | 0.03±0.01 | 7.0 | 9.3±0.6 | 90.8 |
| 10.6±1.8 | 0.1 | 5 | 1.2 | 0.03±0.01 | 7.0 | 9.6±0.6 | 91.3 |
| 12.5±1.8 | 0.1 | 10.0 | 1.2 | 0.03±0.01 | 7.0 | 2.2±0.6 | 17.6 |
| 10.6±1.8 | 0.1 | 50.0 | 1.2 | 0.03±0.01 | 7.0 | 3.2±0.6 | 28.3 |
| 12.5±1.8 | 0.1 | 0.1 | 0 | 0.06±0.01 | 7.5 | 10.4±2.6 | 83.6 |
| 11.3±0.8 | 0.1 | 0.1 | 0.04 | 0.06±0.01 | 7.5 | 9.75±0.6 | 86.3 |
| 10.8±0.6 | 0.1 | 0.1 | 0.2 | 0.06±0.01 | 7.5 | 8.86±0.6 | 82.0 |
| 10.4±0.9 | 0.1 | 0.1 | 0.4 | 0.06±0.01 | 7.5 | 7.95±0.6 | 76.3 |
| 10.1±0.6 | 0.1 | 0.1 | 0.8 | 0.06±0.01 | 7.5 | 9.15±0.9 | 90.8 |
| 9.5±0.9 | 0.1 | 0.1 | 1.2 | 0.06±0.01 | 7.5 | 9.5±1.9 | 100.0 |
| 11.6±0.8 | 0.1 | 0.1 | 1.6 | 0.06±0.01 | 7.5 | 11.1±1.6 | 95.9 |
| 10.2±0.6 | 0.1 | 0.1 | 2.0 | 0.06±0.01 | 7.5 | 7.91±0.6 | 77.6 |
| Хранение в сухой форме после 6 мес.хранения при 4°С (рН расчетное) | |||||||
| 10.6±0.6 | 0.1 | 0.1 | 1.2 | 0.02±0.01 | 7.5 | 10.5±0.6 | 99,6 |
| 10.9±0.9 | 0.1 | 0.1 | 1.2 | 0.2±0.01 | 7.5 | 10.3±0.6 | 95.1 |
| 10.3±0.6 | 0.1 | 0.1 | 1.2 | 2.0±0.1 | 7.5 | 7.8±0.6 | 77.4 |
| 11.5±0.9 | 0.1 | 0.1 | 1.2 | 0.02±0.01 | 5.0 | 10.6±0.6 | 98.2 |
| 11.3±0.8 | 0.1 | 0.1 | 1.2 | 0.02±0.01 | 8.4 | 11,19±0.6 | 99.0 |
Приведенные результаты показали, что при использовании заявляемого способа удается существенно повысить выход интерферона-2в медицинского назначения, а предлагаемая композиция способна длительное время сохранять активность как в сухой, так и в жидкой формах.
1. Способ получения рекомбинантного интерферона альфа-2b человека с использованием трансформированного методами генетической инженерии штамма Escherichia coli, включающий в себя его культивирование в питательной среде, разрушение клеток микроорганизма, удаление ДНК и РНК, концентрирование полученного продукта отмывкой белка, центрифугированием и денатурацией образовавшегося осадка в растворе гуанидин гидрохлорида с последующей ренатурацией интерферона и его очистку с использованием ионообменной хроматографии, отличающийся тем, что культивируют штамм E.coli BL21 (DE3) [pAYC-ET-(hIFN-α2b)-lacI], денатурацию проводят при введении 0,05-0,15 мас.% метионина в буферный раствор гуанидин гидрохлорида, ренатурацию осуществляют в присутствии 0,3-0,5 М аргинина, а хроматографическую очистку проводят последовательно на катионите Солоза КГ 20/30, Sp-целлюлозе и фенил-Сефарозе CL 4В.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографию на катионите Солоза КГ 20/30 и Sp-целлюлозе проводят в присутствии метионина.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что хроматографию на Солоза КГ 20/30 проводят при рН 6,8 с использованием в качестве растворителя трис-HCl буферного раствора, содержавшего 1 mM этилендиаминотеграуксусной кислоты и 0,1 мас.% метионина.
4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что хроматографию на Sp-целлюлозе проводят с использованием в качестве уравновешивающего раствора 0,05 М трис-HCl буферного раствора, содержащего 1 mM этилендиаминотетрауксусной кислоты и 0,1 мас.% метионина; отмывку осуществляют сначала с использованием уравновешивающего буферного раствора, затем 0,1 М фосфатным буферным раствором с 1 mM этилендиаминотетрауксусной кислоты при рН 5,2, а элюцию проводят 0,1 М фосфатным буферным раствором при рН 8,2.
5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что хроматографию на фенил-Сефарозе проводят с использованием в качестве уравновешивающего раствора 0,1 М фосфатного буферного раствора, содержащего 1 mM этилендиаминотетрауксусной кислоты при рН 7,4.
6. Противовирусный интерферонсодержащий препарат в сухой лиофилизированной форме, содержащий рекомбинантный альфа-2 интерферон человека, ЭДТА, полиглюкин и солевую буферную систему, отличающийся тем, что он содержит рекомбинантный альфа-2b интерферон человека, полученный способом по п.1, и буферообразующие соли, обеспечивающие рН от 5,0 до 8,4, а также дополнительно ацетат α-токоферола при следующем соотношении ингредиентов до начала лиофильной сушки:
| Рекомбинантный альфа-2b интерферон человека с активностью 2·106-4·107 МЕ/мл | 1-100 мкг/мл |
| Ацетат α-токоферола | 0,1-5 мкг/мл |
| Полиглюкин | 0,1-1,0 мг/мл |
| ЭДТА | 0,8-1,6 мг/мл |
| Неидентифицированные примеси | 0,01-0,1 мг/мл |
| Буферообразующие соли | В количестве, обеспечивающем рН от 5,0 до 8,4. |
7. Противовирусный интерферонсодержащий препарат, содержащий рекомбинантный альфа-2 интерферон человека, ЭДТА, полиглюкин и солевую буферную систему, отличающийся тем, что он находится в жидкой форме и содержит рекомбинантный альфа-2b интерферон человека, полученный способом по п.1, ацетат α-токоферола, полиглюкин, ЭДТА и буферобразующие соли, обеспечивающие рН от 5,0 до 8,4 при следующем соотношении ингредиентов:
| Рекомбинантный альфа-2b интерферон человека с активностью 2·106-4·107 МЕ/мл | 1-100 мкг/мл |
| Ацетат α-токоферола | 0,1-5 мкг/мл |
| Полиглюкин | 0,1-1,0 мг/мл |
| ЭДТА | 0,8-1,6 мг/мл |
| Неидентифицированные примеси | 0,01-0,1 мг/мл |
| Буферный раствор, обеспечивающий рН от 5,0 до 8,4 | Остальное |
