Способ получения 6 -метилгидрокортизона

Изобретение относится к синтезу органических веществ, в частности к получению стероидов, используемых в химической, микробиологической и фармацевтической отраслях промышленности. Изобретение конкретно относится к улучшенному способу получения 6α-метилгидрокортизона из гидрокортизона или его 21-ацилоксипроизводного. Получают 6α-метилгидрокортизон способом, включающим предварительную защиту 11β-, 17α- и 21-гидроксильных групп гидрокортизона или его 21-ацилоксипроизводного методом исчерпывающей этерификации с образованием 11β,17α,21-триалканоилоксипроизводного, метиленирование С6 положения, восстановление 6-метиленовой группы в 6α-метильную, которое проводят до или после удаления защитных группировок. 3 з.п. ф-лы.

 

Настоящее изобретение относится к области органического синтеза, конкретно касается получения стероидных соединений (кортикостероидов), таких как 6α-метилгидрокортизон, и может быть использовано в химической, микробиологической и фармацевтической отраслях промышленности.

6α-Метилгидрокортизон является промежуточным соединением в синтезе 6α-метилпреднизолона из гидрокортизона.

Полученный в соответствии с предлагаемым способом 6α-метилгидрокортизон может быть использован не только как исходный субстрат для дальнейшего превращения в 6α-метилпреднизолон, а также как самостоятельный лекарственный препарат в виде 21-эфиров [J. Am. Chem. Soc., 1956, 78(23), 6213-6214; US 4912098, 27.03.1990].

Все известные способы введения С6-метильного заместителя можно разделить на 2 группы.

В первую группу входят синтезы, включающие промежуточную эпоксидацию Δ5-двойной связи действием надкислоты. Для образования Δ5-двойной связи исходные Δ4-3-кетосоединения подвергают кетализации, при этом одновременно проводя защиту 3 и 20-кетогрупп. Последующее раскрытие 5,6-эпоксида с одновременным введением метильной группы осуществляют метилирующим реагентом, например метиллитием или метилмагнийбромидом (Схема 1). Так, например, известен способ введения метильной группы в положение С6, заключающийся в обработке 11β,17α,21-тригидрокси-5-прегн-4-ен-3,20-дион 3,20-бис-(алкилен кеталя) (I) пербензойной кислотой в хлороформе, взаимодействием полученного 5α,6α-оксидо-11β,17α,21-тригидроксиаллопрегнан-3,20-дион 3,20-бис-(алкилен кеталя) (II) с метилмагнийбромидом в среде тетрагидрофурана, приводящим к 5α,11β,17α,21-тетрагидрокси-6β-метилаллопрегнан-3,20-дион 3,20-бис-(алкилен кеталю) (III). Последущее снятие защитной кетальной группы 2 N серной кислотой в метаноле приводит к 5α,11β,17α,21-тетрагидрокси-6β-метилаллопрегнан-3,20-диону (IV), обработка последнего водным 0.1 N раствором гидроксида натрия в абсолютном этаноле приводит к целевому соединению - 6α-метилгидрокортизону (V) [US 2897218, 28.07.1959; US 2928851, 15.03.1960; G.B.Spero et al., J. Am. Chem. Soc., 1956, 78(23), 6213-6214].

Недостатками данного способа являются многостадийность, образование большого количества побочных продуктов, с чем связана необходимость дорогостоящей очистки конечных продуктов и, как следствие, невысокие выходы промежуточных и целевого соединений.

В другую группу входят способы синтеза 6α-метилсоединений, в частности 6α-метилгидрокортизона, ключевой стадией в которых является введение метиленовой группы в положение С6. Восстановление метиленовой группы в метильную группу приводит к целевому 6α-метилсоединению.

Введение С6-метиленовой группы осуществляют с использованием в качестве метиленирующего агента формальдегида или его производных. Эти способы предусматривают обязательную предварительную енолизацию α,β-ненасыщенного кетона кольца А, необходимую для поляризации системы двойных связей с образованием нуклеофильного атома углерода С6, с последующим замещением атома водорода при С6 на формильную или метиленовую группу и различаются тем, что в одних случаях образованный промежуточный диенол выделяют в виде эфира [D.Burn et al., Tetrahedron, 1965, 21(6), 1619-1624] или диенамина [F.Schneider et al., Helv. Chim. Acta, 1973, 56(7), 2396-2404], в других же енолизация проводится in situ без выделения промежуточного продукта.

Известно несколько вариантов С6-метиленирования енолизованных Δ4-3-кетостероидов. К первой группе методов С6-алкилирования можно отнести способ с применением формилирования по Вильсмейеру, ко второй группе - методы так называемой прямой конденсации с формальдегидом или его производными:

метод прямого метиленирования, описанный Анненом и соавт.[US 4322349, 30.03.1982; Synthesis, 1982, №1, р.34-40; Liebigs Ann. Chem. 1983, (4), р.712; ЕР 0100874, 22.02.1984; ЕР 0149222, 24.07.1985]

и метод конденсации с реагентом Манниха [R.Bohlmann et al., DE 4121484, 07/01, 1993].

Метод с применением реактива Вильсмейера включает следующую последовательность реакций: присоединение реактива Вильсмейера к 3-метиловому эфиру Δ3,5-прегнадиена с образованием 6-формильного замещенного; дальнейшее превращение формильного производного реакцией восстановления до оксиметильного производного и последующими гидролизом и дегидратацией - в метиленовое. Последующее каталитическое гидрирование двойной связи 6-метиленовой группы завершается образованием 6α-метильного заместителя [Burn D., et al., Tetrahedron, 1964, 20(3), 597-609; Burn D., et al., Tetrahedron, 1965, 21(6), 1619-1624; Burn D., et al., Tetrahedron, 1969, 25(5), 1155-1158; US 3117966, 14.01.1964; US 3112305, 26.11.1963] (Схема 2).

Метод прямого метиленирования, предложенный Анненом и соавт. [Annen К., et al., Synthesis, 1982, №1, р.34-40; ЕР 0034115, 19.08.1981; DE 3004508, 06.08.1981; ЕР 0100874, 22.02.1984; ЕР 0149222, 24.07.1985; DE 3204281, 21.07.1983], заключается во взаимодействии стероида с производными формальдегида (такими как диметилацеталь, диэтилацеталь формальдегида или метоксиметилацетат) в хлорированных растворителях при температуре кипения в присутствии избытка хлорокиси фосфора и ацетата натрия (Схема 3).

Однако, несмотря на значительно более короткий путь к целевому продукту, этот способ не позволяет получать выходы выше, чем 40-45% [US 48760456, 24.10.1989].

Известен способ введения метиленовой группы в положение 6 молекулы 21-ацетата гидрокортизона, согласно которому последний путем нагревания в тетрагидрофуране с этилортоформиатом в присутствии каталитического количества сульфокислоты превращают в соответствующий диенол-эфир, который затем взаимодействует с реактивом Манниха, образующимся in situ из водного раствора формальдегида и N-метиланилина в присутствии того же катализатора. Последующая обработка соляной кислотой приводит к целевому продукту. Однако выход 6-метиленпроизводного 21-ацетата гидрокортизона не превышает 50% [DE 4121484, 07. 01.1993].

Низкий выход можно объяснить наличием побочных реакций с участием незащищенных гидроксигрупп при С11 и С17. В жестких условиях реакции прямого метиленирования (кипячение в хлорированных углеводородах с хлорокисью фосфора в течение 5-6 часов) или в условиях реакции Манниха в присутствии свободного гидроксила при С17 можно ожидать появление нежелательных продуктов дегидратации и D-гомоаннелирования. Поэтому, даже применение защиты 11β-гидроксильной группы в виде трифторацетата или 11β-триметилсилильного эфира не позволяет достичь высоких выходов на стадии метиленирования при наличии свободной 17α-гидроксигруппы [US 4322349, 30.03.1982].

Формилирование 17,20:20,21-бисметилендиоксипроизводного гидрокортизона с незащищенной 11β-гидроксигруппой в условиях реакции Вильсмейера (ДМФ, POCl3 или фосген) также, вероятно, не дает хорошего результата (авторы не приводят выход 6-метиленового продукта), так как реакция формилирования при С6 осложняется в данном случае побочными реакциями с участием 11β-гидроксигруппы [GB 929985, 26.06.1963; D. Burn, et al., Tetrahedron, 1969, 25(5), р.1155-1158].

Таким образом, мы пришли к выводу, что помимо обязательного выполнения условия енолизации существует другой общий для всех вариантов фактор, обеспечивающий успешность осуществления процесса С6 функционализации без образования нежелательных продуктов сопутствующих реакций по гидроксильным группам. Это необходимость предварительной защиты всех гидроксильных групп, имеющихся в структуре молекулы исходного стероида: не только защиты диоксиацетоновой боковой цепи, но и 11-гидроксигруппы. Для защиты диоксиацетоновой боковой цепи может быть применена бисметилендиоксизащита (БМДО-защита), позволяющая в одну стадию защитить имеющиеся в боковой цепи функциональные группы, включая гидроксильные.

Известно, что для защиты 11β-гидроксигруппы ее обычно превращают в тригалоацетат (в частности, трифторацетат) или используют триметилсилильную защиту. Эти защиты считаются наиболее приемлемыми, так как не только легко образуются, но и легко удаляются. Применение для защиты 11β-гидроксигруппы метода этерификации ангидридами низших кислот возможно, однако было ограничено (в частности, ранее не применялось при С6-метиленировании) из-за проблем, возникающих при их последующем удалении с помощью химических методов сольволиза.

Поэтому третьим существенным моментом в синтезе 6-метилгидрокортизона является селективное удаление защитных групп без модификации структуры молекулы. Однако известно, что снятие защиты гидроксила при C11 применением традиционных методов химического сольволиза (например, щелочного гидролиза) может привести к образованию нежелательных продуктов трансдиаксиального элиминирования сложноэфирной группы с образованием Δ9(11)-двойной связи или продукта переэтерификации сложноэфирной группы с образованием трудноотделимого простого эфира. Даже в случае применения трифторацетоксизащиты как наиболее оптимального варианта, избежать появления продукта 9,11-дегидрирования не удается.

Определенную трудность представляет удаление БМДО-защиты диоксиацетоновой боковой цепи, что является серьезным препятствием ее использования, особенно в коммерческих целях. Обычно используют для удаления БМДО-защиты смесь уксусной (или муравьиной) и концентрированной соляной кислот, а также концентрированной фтористоводородной кислоты [GB 1138173, 27.12.1968]. В этих условиях происходит образование побочных продуктов, например возможна этерификация свободных гидроксильных групп в стероидном ядре или в свободной боковой цепи (например, образование 11β-формиата, 21-формиата или продуктов D-гомоперегруппировки). Попытка далее химически гидролизовать 11β-формиат, что требует значительно более жестких условий гидролиза, приводит к образованию существенного количества продуктов D-гомоаннелирования, а также к образованию продуктов деградации диоксиацетоновой боковой цепи. Все это приводит к снижению выхода конечного продукта и загрязнению его относительно большим количеством нежелательных побочных продуктов. Выход продукта гидролиза, как правило, не превышает 65-70%.

Общим недостатком использования известных способов является то, что при образовании значительных количеств примесей указанные выше методы неэффективны и при многократной кристаллизации происходят большие потери основного продукта. Для того чтобы избежать потерь основного продукта и повысить эффективность способа выделения, прибегают к различным приемам, например к хроматографированию на колонке с силикагелем.

Наиболее близким по сущности к предложенному является способ получения 6α-метилгидрокортизона [US 4322349, 30.03.1982], заключающийся в том, что в синтезе 6-метиленпроизводного прямой конденсацией с производным формальдегида в присутствии сильного кислого конденсирующего агента используют гидрокортизон, 21-гидроксигруппа которого защищена с помощью образования ацетоксипроизводного, а 11β- и 17α-гидроксигруппы защищены образованием нитроэфиров.

Так, раствор 21-ацетокси-11β,17α-динитроокси-4-прегнен-3,20-диона и метилаля в дихлорметане обрабатывают смесью пентоксида фосфора и силикагеля. Смесь перемешивают 3 дня при комнатной температуре и затем добавляют новые порции метилаля, пентоксида фосфора и силикагеля. Через 2 дня реакционную смесь отфильтровывают, остаток промывают дихлорметаном и упаривают в вакууме досуха. Продукт хроматографируют на силикагеле, используя градиентное элюирование. Из 5 г исходного соединения получают 2,6 г 6-метилензамещенного.

Недостатками описанного в [US 4322349] процесса являются:

- низкий выход продукта метиленирования - 21-ацетокси-11β,17α-динитроокси-6-метиленпрегн-4-ен-3-она;

- применение для очистки 21-ацетокси-11β,17α-динитроокси-6-метиленпрегн-4-ен-3-она колончатой хроматографии с градиентным элюированием, существенно усложняющей технологический процесс;

- отсутствие информации о способах удаления защитных групп и выходе 11β,17α,21-тригидрокси-6-метиленпрегн-4-ен-3-она.

Технической задачей в заявленном изобретении является увеличение выхода целевого продукта путем снижения вероятности протекания побочных реакций на стадии функционализации положения С6 стероидной молекулы и практически полное исключение образования побочных продуктов и осмоления реакционной массы на стадии удаления защитных группировок и получение 6α-метилгидрокортизона способом, лишенным вышеуказанных недостатков.

Техническая задача решается способом получения 6-метилгидрокортизона формулы (I)

из гидрокортизона формулы (II),

где R=H,

или его 21-ацилоксипроизводного (R=Acyl),

включающим предварительную защиту 11β-, 17α- и 21-гидроксильных групп гидрокортизона методом исчерпывающей этерификации ангидридом или хлорангидридом кислоты при соотношении к 1 молю стероида, например, не менее 3,0 молей ацилирующего агента (R=H) или 2,0 молей (R=Acyl) в среде апротонного растворителя или в среде ацилирующего агента, например ангидрида кислоты, в условиях кислотного или основного катализа с использованием каталитических количеств катализатора - минеральной или органической кислоты, неорганического или органического основания; последующее С6-метиленирование образовавшегося 11β,17α,21-триалканоилоксигидрокортизона - 11β,17α,21-триацилокси - [или 21-ацилокси-11β,17α-бис-(трифторацетокси)]-гидрокортизона конденсацией с формальдегидом или его производным при соотношении их, например, соответственно от 1 до 10 молей реагента на 1 моль стероида, восстановление полученного 6-метиленпроизводного в 11β,17α,21-триалканоилокси-6α-метилгидрокортизон - в 11β,17α,21-триацилокси-[(или 21-ацилокси-11β,17α-бис-(трифторацетокси)]-6α-метилгидрокортизон, удаление защиты 11β-, 17α- и 21-гидроксильных групп химическим методом и/или ферментативным дезацилированием, выделение 6α-метилгидрокортизона из культуральной жидкости; при этом восстановление 6-метиленпроизводного в 6α-метилпроизводное осуществляют до или после удаления защиты 11β-, 17α- и 21-гидроксильных групп.

Удаление защитных групп (эфиров 11β-, 17α- и 21-гидроксильных групп) осуществляют ферментативным путем с помощью бактериального штамма Agromyces mediolanus BKM Ac-1388 (syn. Corynebacterium mediolanum).

Удаление защитных групп может быть осуществлено и химическим методом, в частности, например сольволизом, или комбинацией химического метода и ферментативного метода.

Сущность заявленного изобретения, касающегося получения 6а-метилгидрокортизона, заключается в том, что гидрокортизон (или его 21-ацилоксипроизводное) сначала подвергают предварительной защите 11β-, 17α- и 21-гидроксильных групп (или 11β- и 17α-гидроксильных групп), затем метиленированию положения С6, восстановлению 6-метиленовой группы, удалению защитных группировок.

С целью повышения выхода и упрощения процесса защищенный по 11β-, 17α- и 21-гидроксильным группам гидрокортизон подвергают метиленированию положения С6 и далее восстановлению 6-метиленовой группы в 6-метильную, которое проводят до или после удаления защитных группировок.

При этом защиту гидроксильных групп проводят одновременно методом исчерпывающего ацилирования в условиях кислого или основного катализа, а удаление защитных группировок осуществляют методом ферментативного дезацилирования.

Кроме того, дезацилирование осуществляют с использованием бактерий Agromyces mediolanus BKM Ас-1388 (syn. Corynebacterium mediolanum).

Кроме того, ферментативное дезацилирование может быть проведено после восстановления 6-метиленовой группы в 6-метильную.

Преимущества заявляемого способа состоят в следующем:

- проведение защиты всех гидроксильных групп может быть осуществлено в одну химическую стадию (исчерпывающее ацилирование);

- отсутствие необходимости использования многократной кристаллизации основного продукта или хроматографирования с целью его очистки, так как удаление защитных групп в одну ферментативную стадию приводит к незначительному появлению побочных соединений;

- значительно сокращаются потери основного продукта;

- общий достигаемый выход 6-метилгидрокортизона из гидрокортизона составляет 81-82% в зависимости от использованного варианта защиты гидроксильных групп и метода метиленирования.

Способ получения 6-метилгидрокортизона формулы (I) осуществляется по следующей схеме (Схема 4).

Гидрокортизон (11β,17α,21-тригидроксипрегн-4-ен-3,20-дион) формулы (II, R=H или Ас)

подвергают защите 11β-, 17α- и 21-гидроксильных групп методом исчерпывающего ацилирования (предпочтительно ацетилирования или трифторацетилирования) действием ангидрида или хлорангидрида соответствующей кислоты в среде апротонного растворителя или в среде ацилирующего реагента (например, ангидрида кислоты) в присутствии каталитического количества минеральной (хлорная, серная, фосфорная и т.п.) или органической (п-толуолсульфокислота, сульфосалициловая и т.п.) кислоты. Для ацилирования в условиях щелочного катализа используют органические основания (предпочтительно диметиламинопиридин), неорганические основания (оксиды и карбонаты кальция, магния и т.п.). Полученный с выходом 97-98% 11β,17α,21-триалканоилокси-гидрокортизон (III или IIIa) подвергают енолизации Δ4-3-кетосистемы (in situ) действием каталитического количества п-толуолсульфокислоты и конденсации с производным формальдегида с последующим превращением полученного 6-метиленпроизводного (IV или IVa) в 11β-,17α-,21-триалканоилокси-6α-метилгидрокортизон (V или Va). Затем ферментативным дезацилированием последнего с применением дезацилирующей культуры (предпочтительно Agromyces mediolanus) получают 6α-метилгидрокортизон (I). Могут быть использованы как растущие, так и покоящиеся с нагрузкой исходного субстрата до 12,5 г/л и продолжительностью ферментации от 6 до 24 часов. При этом удаление защитных групп 6-метиленпроизводного (IV или IVa) может быть реализовано до проведения реакции восстановления с образованием 6-метиленгидрокортизона (VI).

Выделение 6α-метилгидрокортизона из культуральной жидкости осуществляют традиционной экстракцией несмешивающимся с водой растворителем или экстракцией стероида из пасты биомассы любым подходящим растворителем после ее отделения от водной фазы. Для извлечения стероида может быть также применен сорбционный способ извлечения. Выход 6α-метилгидрокортизона на стадии ферментативного дезацилирования составляет 95-98%.

Общий достигаемый выход 6α-метилгидрокортизона из гидрокортизона составляет 81-82% в зависимости от использованного варианта защиты гидроксильных групп и метода метиленирования.

Полученный в соответствии с предлагаемым способом 6α-метилгидрокортизон может быть использован не только как исходный субстрат для дальнейшего превращения в 6α-метилпреднизолон, а также как самостоятельный лекарственный препарат в виде 21-эфиров [J. Am. Chem. Soc., 1956, 78(23), 6213-6214; US 4912098, 27.03.1990].

Заявленное изобретение иллюстрируется следующими примерами, не ограничивающими его.

Ацилирование свободных гидроксильных групп проводят с использованием минимально необходимого количества ангидрида (или хлорангидрида) карбоновой кислоты (не менее 2 молей на 1 моль стероида) в безводных условиях в апротонном растворителе.

В качестве апротонного растворителя при осуществлении изобретения - способа получения 6α-метилгидрокортизона - используют, например, хлорированные углеводороды (например, хлористый метилен, дихлорэтан, хлороформ и т.п.), диалкилкетоны (например, ацетон, метилэтилкетон), а также ацилирующий агент (например, ангидрид кислоты).

В качестве производного формальдегида при получении 6-метиленпроизводного (как промежуточного продукта при получении 6α-метилгидрокортизона) используют диалкилацетали формальдегида (например, метилаль, диэтилацеталь и т.п.), реагенты Манниха, полученные при взаимодействии формальдегида и органического основания (например, метиламин, диметиламин, метиланилин и т.п.).

В качестве восстановителей в реакции восстановления 6-метиленпроизводных в 6α-метилпроизводные в заявленном изобретении используют, например, борогидрид натрия, циклогексен и другие традиционно используемые восстановители, а также восстановление осуществляют гидрированием в присутствии традиционно используемых катализаторов, например палладия, адсорбированного на угле (палладиевый катализатор), и других.

В качестве среды для проведения реакции восстановления могут быть использованы полярные растворители, такие как низшие карбоновые кислоты (например, уксусная кислота), алифатические спирты (например, метанол, этанол) или их эфиры (например, этилацетат).

Микробиологическое дезацилирование может быть реализовано как растущими, так и покоящимися клетками Agromyces mediolanus.

Удаление защиты 11β, 17α, 21-гидроксильных групп (например, трифторацетильной) может быть реализовано с помощью химических методов (сольволизом) или проведено комбинацией химического и ферментативного методов (например, ацетильной).

Пример 1. Получение 11β,17α,21-триацетоксипрегн-4-ен-3,20-диона (триацетата гидрокортизона, III).

Вариант 1.

К 190 мл ледяной уксусной кислоты при температуре 0-2°С добавляют 170 мл уксусного ангидрида и по каплям 25 мл 57%-ной хлорной кислоты. Затем при этой же температуре добавляют порциями 50 г гидрокортизона. Реакционную массу подогревают до комнатной температуры и выдерживают в течение 1 часа. После завершения реакции реакционную смесь выливают в 5%-ный раствор аммиака, охлажденный до температуры 4-6°С, и выдерживают в течение 30 минут. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают водой до рН 7.

Получают 65,8 г триацетата гидрокортизона с выходом 97,6% и т.пл. 149-151°С.

Спектр ЯМР 1Н (CDCl3, δ, м.д., J/Гц): 0.85 с (3Н, 18-СН3), 1.25 с (3Н, 19-СН3), 2.01 с (3Н, СН3С(О)), 2.05 с (3Н, СН3С(О)), 2.12 с (3Н, СН3С(О)), 4.70 дд (2Н, 21-СН2, J=16.6, J=68.3), 5.50 кв (1H, 11-H, J=2.9), 5.67 с (1H, 4-H).

Вариант 2.

Суспензию 25 г гидрокортизона, 25 г свежепрокаленного СаО в 500 мл уксусного ангидрида кипятят в течение 4 часов. Затем реакционную массу охлаждают и выливают в 6,5-кратное количество 5% раствора аммиака при температуре не выше 10°С. Суспензию перемешивают в течение 2 часов при этой же температуре, осадок отфильтровывают, промывают водой до рН 7. Высушенный осадок растворяют в ацетоне, раствор обрабатывают углем, упаривают досуха. Осадок кристаллизуют из эфира. Получают 28,1 г триацетата гидрокортизона с выходом 83,4% и т.пл. 152-154°С.

Вариант 3.

К суспензии 50 г гидрокортизона в 700 мл хлористого метилена добавляют при перемешивании последовательно 95 мл триэтиламина, 300 мл уксусного ангидрида и 8,5 г диметиламинопиридина. Реакционную массу кипятят в течение 18 часов. Затем реакционную массу охлаждают и медленно выливают в раствор аммиака (520 мл 25%-ного аммиака в 4 л воды) и перемешивают в течение 1 часа. Органический слой отделяют, водный экстрагируют хлористым метиленом. Объединенные органические слои сушат Na2SO4, обрабатывают осветляющим углем и упаривают. Полученный остаток растворяют в этилацетате и разбавляют при перемешивании петролейным эфиром. Осадок отфильтровывают. Получают 67,4 г триацетата гидрокортизона с выходом 97%.

Пример 2. Получение 21-ацетокси-11β,17α-бис-(трифторацетокси)-прегн-4-ен-3,20-диона (IIIa).

К суспензии 10 г 21-ацетата гидрокортизона в 80 мл безводного ацетона при температуре не выше +5°С добавляют 10,4 мл триэтиламина, 8.4 мл трифторуксусного ангидрида и 0.3 г 4-(диметиламино)пиридина. Реакционную массу перемешивают 1 час при комнатной температуре и выливают в 400 мл воды. Осадок отфильтровывают, промывают водой до рН 7.

Получают 14,5 г 21-ацетокси-11β,17α-бис-(трифторацетокси)-прегн-4-ен-3,20-диона с выходом 98,5% и т.пл. 114-116°С.

Спектр ЯМР 1Н (CDCl3, δ, м.д., J/Гц): 0.94 с (3Н, 18-СН3), 1.28 с (3Н, 19-СН3), 2.15 с (3Н, СН3С(О)), 4.75 дд (2Н, 21-CH2, J=16.9, J=81.5), 5.70 уш.с (1Н, 11-Н), 5.72 с (1Н, 4-Н).

Пример 3. Получение 11β,17α,21-триацетокси-6-метиленпрегн-4-ен-3,20-диона (IV).

Вариант 1.

К смеси 10 г NaOAc, 150 мл хлороформа и 150 мл метилаля добавляют 14 мл POCl3. Смесь кипятят в атмосфере аргона при перемешивании 1 час. Затем добавляют 10 г триацетата гидрокортизона и по каплям в течение 1-1,5 ч еще 14 мл POCl3 и кипячение продолжают. После завершения реакции (4-6 часов) кипячение прекращают, реакционную смесь охлаждают и медленно выливают в раствор 160 мл 25% NH3 в 1 л воды со льдом. Интенсивно перемешивают в течение 1 часа. Водный слой отделяют, к органическому слою добавляют 100 мл 5% раствора HCl и интенсивно перемешивают 1 час. Органический слой отделяют, промывают дважды водой, растворитель упаривают. После кристаллизации получают 8,5 г 11β,17α,21-триацетокси-6-метиленпрегн-4-ен-3,20-диона с выходом 83% и т.пл.133-135°С.

Вариант 2.

К раствору 10 г триацетата гидрокортизона в 75 мл тетрагидрофурана при перемешивании добавляют 10 мл этанола, 10 мл этилортоформиата и 130 мг п-толуолсульфокислоты и нагревают до 40°С. Реакционную массу выдерживают в течение 1 часа и добавляют дополнительно 130 мг п-толуолсульфокислоты, и после перемешивания в течение еще 1 часа при температуре 40°С добавляют 4.3 мл N-метиланилина и 3-6 мл водного 37%-ного раствора формальдегида. Реакционную массу выдерживают в течение 2 часов, затем охлаждают до комнатной температуры, добавляют 25 мл концентрированной соляной кислоты и перемешивают 30 мин. Смесь экстрагируют хлористым метиленом, органический слой промывают водой до нейтральной реакции, растворитель упаривают. После кристаллизации получают 9,4 г 11β,17α,21-триацетокси-6-метиленпрегн-4-ен-3,20-диона с выходом 92% и т.пл. 136-138°С.

Спектр ЯМР 1Н (CDCl3, δ, м.д., J/Гц): 0.86 с (3Н, 18-СН3), 1.18 с (3Н, 19-СН3), 2.02 с (3Н, СН3С(О)), 2.08 с (3Н, СН3С(О)), 2.14 с (3Н, СН3С(О)), 4.72 дд (2Н, 21-CH2, J=16.6, J=71.8), 5.04 дт (2Н, 6-С=СН2, J=1.8, J=36.3), 5.55 кв (1H, 11-H, J=3.0), 5.86 с (1Н, 4-Н).

Пример 4. Получение 21-ацетокси-11β,7α-бис-(трифторацетокси)-6-метиленгидрокортизона (IVa).

В условиях примера 3 вариант 2 из 1 г 21-ацетокси-11β,17α-бис-(трифторацетокси)-прегн-4-ен-3,20-диона получают 0.93 г 21-ацетокси-11β,17α-бис-(трифторацетокси)-6-метиленгидрокортизона с выходом 91%, т.пл. 106-108°С.

Спектр ЯМР 1H (CDCl3, δ, м.д., J/Гц): 0.93 с (3Н, 18-СН3), 1.19 с (3Н, 19-СН3), 2.15 с (3Н, СН3С(О)), 4.75 дд (2Н, 21-СН2, J=16.9, J=85.8), 5.08 дт (2Н, 6-С=СН2, J=1.8, J=39.6), 5.72 кв (1H, 11-H, J=3.0), 5.89 с (1H, 4-Н).

Пример 5. Получение триацетата 6α-метилгидрокортизона (V)

5 г триацетата 6-метиленгидрокортизона растворяют в 250 мл этанола, добавляют 15 мл циклогексена и 1 г PdO/C. Реакционную смесь кипятят при перемешивании в течение 24 часов. Катализатор отфильтровывают, растворитель упаривают. После кристаллизации получают 4,8 г триацетата 6α-метилгидрокортизона с выходом 95%, т.пл. 142-144°С.

Спектр ЯМР 1Н (CDCl3, δ, м.д., J/Гц): 0.87 с (3Н, 18-СН3), 1.07 д (2Н, 6-СН3, J=6.3), 1.25 с (3Н, 19-СН3), 2.03 с (3Н, СН3С(О)), 2.06 с (3Н, СН3С(О)), 2.14 с (3Н, СН3С(О)), 4.71 дд (2Н, 21-СН2, J=16.6, J=65.6), 5.52 кв (1H, 11-H, J=2.9), 5.73 с (1Н, 4-H).

Пример 6. Получение 21-ацетокси-17α-гидрокси-11β-трифторацетокси-6α-метилгидрокортизона (Va).

В условиях примера 5 из 0.7 г 21-ацетокси-11β,17α-бис-(трифторацетокси)-6-метиленгидрокортизона получают 0.6 г 21-ацетокси-17α-гидрокси-11β-трифторацетокси-6α-метилгидрокортизона с выходом 97%, т.пл. 112-114°С.

Спектр ЯМР 1H (CDCl3, δ, м.д., J/Гц): 0.80 с (3Н, 18-СН3), 1.07 д (2Н, 6-СН3, J=6.0), 1.24 с (3Н, 19-СН3), 2.14 с (3Н, СН3С(О)), 4.87 дд (2Н, 21-СН2, J=17.1, J=156.2), 5.67 уш.с (1H, 11-Н), 5.74 с (1H, 4-H).

Пример 7. Получение 11β,17α,21-тригидрокси-6-метилпрегн-4-ен-3-она (6α-метилгидрокортизона, I).

Вариант 1.

В условиях примера 5 из 1 г 11β,17α,21-тригидрокси-6-метиленпрегн-4-ен-3-она (6-метиленгидрокортизона) получают 0.9 г 6α-метилгидрокортизона с выходом 90%, т.пл. 204-206°С.

Вариант 2.

К суспензии 2 г 21-ацетокси-11β,17α-бис-(трифторацетокси)-6α-метилгидрокортизона, 24 мл метанола и 6 мл воды добавляют 6,5 мл 10% водного раствора NaOH, поддерживая рН реакционной массы на значении 8-8,5. Реакционную массу выдерживают при температуре 30-35°С. По окончании реакции реакционную суспензию разбавляют 10 мл воды и выдерживают при температуре 5-8°С в течение 12 часов. Осадок отфильтровывают, промывают охлажденной смесью воды и метанола. Получают 1,07 г 6α-метилгидрокортизона с выходом 94,5%.

Вариант 3.

Получение 6α-метилгидрокортизона из 11β-, 17α-, 21-триацетокси-6α-метилгидрокортизона осуществляют путем проведения микробиологического деацетилирования с использованием бактерий Agromyces mediolanus BKM Ac-1388.

Бактерии A. mediolanus выращивают на среде следующего состава, г/л: глюкоза - 3,0; дрожжевой автолизат - 10,0; К2HPO4 - 1,71; Na2HPO4×12H2O - 4,57; NaCl - 2,0. Вода дистиллированная - до 1000 мл, рН - 7,0.

Выращивание клеток проводят в колбах Эрленмейера объемом 0,75 л, содержащих 100 мл среды, на качалке (220 об/мин) при температуре 28-30°С. Через 24-32 часа роста культуральную жидкость используют в качестве инокулята для засева среды в ферментер. Оптическая плотность (ОП) при 20-кратном разбавлении составляет 0,3 при длине оптического пути 1 см.

Выращивание трансформирующей культуры в ферментере.

Выращивание трансформирующей культуры проводят в ферментере объемом 3 л, (рабочий объем 1,6 л) в той же питательной среде, при подаче воздуха 1,0 л/мин, перемешивании 500 об/мин и температуре 28°С. Объем посевного материала - 1-2%.

Через 24-32 часа роста вносят 20 г переосажденного 11β-,17α-,21-триацетокси-6α-метилгидрокортизона.

Приготовление переосажденного 11β-,17α-,21-триацетокси-6α-метилгидрокортизона.

20 г 11β-,17α-,21-триацетокси-6α-метилгидрокортизона растворяют в 100 мл ДМФ на кипящей водяной бане и сразу же выливают в 1000 мл смеси воды и измельченного льда при интенсивном перемешивании. Суспензию центрифугируют со скоростью 5000 об/мин в течение 10 мин. Осадок суспендируют в 200 мл среды и вносят в ферментер для трансформации.

Проведение процесса трансформации.

Процесс трансформации проводят в тех же условиях, что и выращивание культуры. Превращение стероида контролируют, отбирая пробы из реакционной среды через определенные промежутки времени (6-8 ч). В процессе трансформации происходит защелачивание среды до рН 7,5. После того, как весь исходный субстрат будет израсходован, в среду постепенно добавляют 10% раствор гидроксида натрия, поддерживая значение рН около 8,0, для завершения гидролиза 17-ацетоксигруппы. Общая продолжительность процесса (включая щелочную обработку) составляет 48-72 ч. По данным ВЭЖХ превращение осуществляется на 99%.

По окончании процесса деацетилирования клеточную массу центрифугируют со скоростью 5000 об/мин, 6α-метилгидрокортизон извлекают из пасты биомассы экстракцией этилацетатом, кристаллизуют из гексана. Получают 14,23 г (95%) 6α-метилгидрокортизона.

Вариант 4.

Выращивание трансформирующей культуры A. mediolanus и приготовление исходного субстрата проводят, как описано в варианте 3. По окончании роста клеточную массу отделяют от среды центрифугированием в асептических условиях. Из 100 мл культуральной жидкости получают 1,0-1,2 г влажной биомассы, которую ресуспендируют в 100 мл фосфатного буфера (рН - 7,5-8,0) и используют для процесса трансформации.

Трансформацию стероида отмытыми клетками проводят в указанном фосфатном буфере при температуре 28-30°С при подаче воздуха 0,5 л/мин и перемешивании 500 об/мин. Субстрат вносят дробно в концентрации 5 г/л с интервалом 4 часа. Общая концентрация исходного субстрата составляет 10 г/л. Общая продолжительность процесса составляет 60-72 ч. По данным ВЭЖХ превращение осуществляется на 99%.

По окончании процесса ферментации 6α-метилгидрокортизон извлекают экстракцией этилацетатом, кристаллизуют из гексана. Получают 6α-метилгидрокортизон с выходом 90%.

Пример 8. Получение 6-метиленгидрокортизона (VI).

Вариант 1.

Получение 6α-метиленгидрокортизона из 11β-,17α-,21-триацетокси-6α-метиленгидрокортизона осуществляют путем микробиологической трансформации клетками A. mediolanus в условиях примера 7 вариант 3. Из 6,8 г 11β-,17α-,21-триацетокси-6α-метиленгидрокортизона, загруженного в ферментер для трансформации, получают 4,68 г 6-метиленгидрокортизона с выходом 92%, т.пл. 198-200°С.

Спектр ЯМР 1Н (CDCl3, δ, м.д., J/Гц): 0.94 с (3Н, 18-СН3), 1.34 с (3Н, 19-СН3), 4.48 ддд (2Н, 21-СН2, J=4.8, J=19.7, J=137.7), 4.50 м (1Н, 11-Н), 5.02 дт (2Н, 6-С=СН2, J=1.9, J=41.4), 5.85 c (1H, 4-H).

Вариант 2.

В условиях примера 7 вариант 2 из 1 г 21-ацетокси-11β,17α-бис-(трифторацетокси)-6-метиленгидрокортизона получают 0.6 г 6-метиленгидрокортизона с выходом 97.5%.

Таким образом, как следует из приведенных примеров, заявленный в качестве изобретения способ получения 6α-метилгидрокортизона позволяет получить продукт с достаточно высоким выходом и высокой степенью чистоты.

1. Способ получения 6α-метилгидрокортизона из гидрокортизона или его 21-ацилокси-производного, включающий предварительную защиту 11β, -17α- и 21-гидроксильных групп гидрокортизона методом исчерпывающей этерификации ангидридом или хлорангидридом кислоты в среде апротонного растворителя или в среде ацилирующего агента в условиях кислотного или основного катализа с использованием каталитических количеств катализатора - минеральной или органической кислоты, неорганического или органического основания, последующее 6-метиленирование образовавшегося 11β, -17α-, 21-триалканоилоксигидрокортизона конденсацией с формальдегидом или его производным, восстановление полученного 6-метиленпроизводного гидрированием в 11β, -17α-, 21-триалканоилокси-6α-метилгидрокортизон, удаление защиты 11β, -17α- и 21-гидроксильных групп химическим методом и/или ферментативным дезацилированием, выделение 6α-метилгидрокортизона из культуральной жидкости, при этом восстановление 6-метиленпроизводного в 6α-метилпроизводное осуществляют до или после удаления защиты 11β, -17α- и 21-гидроксильных групп.

2. Способ получения 6α-метилгидрокортизона по п.1, отличающийся тем, что в качестве среды на стадии этерификации используют ангидрид кислоты.

3. Способ получения 6α-метилгидрокортизона по п.1, отличающийся тем, что ферментативное дезацилирование осуществляют с помощью бактерий Agromyces mediolanus.

4. Способ получения 6α-метилгидрокортизона по п.1, отличающийся тем, что удаление защиты 11β, -17α-, 21-гидроксильных групп, например трифторацетильной, может быть реализовано с помощью химических методов - сольволизом или проведено комбинацией химического и ферментативного методов.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к композициям, содержащим полугидрат 16 -бромо-3 -гидрокси-5 -андростан-17-она и один или более эксципиент, обычно при этом композиция содержит менее 3% воды.

Изобретение относится к медицине и описывает противоопухолевое средство, относящееся к классу гестагенов, 17 -ацетокси-3 -бутаноилокси-6-метил-прегна-4,6-диен-20-он, с возможностью перорального применения.

Изобретение относится к области тонкого органического синтеза, именно - к технологии получения тритерпеновых соединений, бетулина, используемого в фармацевтической и парфюмерно-косметической промышленности.

Изобретение относится к улучшенному способу получения бетулиновой кислоты из бетулоновой кислоты и может быть использовано в производстве антиопухолевых и анти-ВИЧ лекарственных препаратов.

Изобретение относится к улучшенному способу получения биологически активных веществ из продуктов химической переработки растительной биомассы, в частности к способу получения бетулиновой кислоты из бетулина.

Изобретение относится к ветеринарной фармакологии. .

Изобретение относится к выделению ценных химических продуктов из отходов деревопереработки, а именно к способу выделения бетулина формулы (1) из внешнего слоя коры березы (бересты).
Изобретение относится к способам получения олеаноловой кислоты, используемой в качестве стандартного образца (образцы сравнения) при проведении стандартизации лекарственного растительного сырья, а также фитопрепаратов, содержащих тритерпеновые сапонины - производные олеаноловой кислоты.
Изобретение относится к офтальмологии и предназначено для профилактики отторжения трансплантата после сквозной кератопластики (СК) у детей в группе высокого риска.
Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и касается лечения аутоиммунного тиреоидита. .

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения острых и хронических инфекций среднего уха. .

Изобретение относится к области ветеринарии и может быть использовано для регулирования половой охоты у кошек и собак. .
Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано в качестве метода стимуляции лимфотока коленного сустава у больных с синдром диабетической стопы.

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и касается лечения злокачественного экзофтальма при тиреотоксикозе. .
Изобретение относится к медицине, в частности к гастроэнтерологии, и касается выбора фармпрепарата для лечения заболеваний, обусловленных и сопровождающихся нарушением метаболизма желчных кислот (ЖК-т) и холестерина.
Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии и может быть использовано при комплексном лечении больных бронхиальной астмой с учетом индивидуального подхода.

Изобретение относится к медицине. .
Изобретение относится к области медицины, а именно к анестезиологии-реаниматологии и невропатологии, может быть использовано при лечении больных ишемическим инсультом
Наверх