Способ определения вирулентности штаммовбруцелл

 

23I064

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Содиалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства №

Заявлено 17.Ъ.1967 (№ 1158121/30-15) Кл. 301т, 6 с присоединением заявки №

Приоритет

Опубликовано 15.XI.1968. Бюллетень № 35

Дата опубликования описания 17.III.1969

МПК А 61k

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

УДК 619;578.088.1:576.8. .097.21:576.851.42 (088.8) Авторы изобретения

К. П. Студенцов и Б. Ф. Резников

Заявитель Карагандинская научно-исследовательская ветеринарная станция

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУЛЕНТНОСТИ ШТАММОВ

БРУЦЕЛЛ

Определение дезамииазиой активности у бруцелл

Извсстные способы определения вирулентности (степени патогенности) болезнетворных микроорганизмов, например бруцелл, не позволяют определять вирулентность микроорганизмов без заражения подопытных животных.

Предложенный способ отличается тем, что с целью быстрого определения вирулентности без использования лабораторных животных вирулентность шгаммов бруцелл определяют путем сравнения активности их ферментов— уреазы и дезаминаз. Активность уреазы определяют при оптимальных условиях на желатиновой среде, содержащей только один субстрат, ферментируемый бруцеллами, а именно— мочевину. Активность дезаминаз определяют по степени подщелачивания питательной среды, не содержащей мочевину.

По предложенному способу вирулентность бруцелл определяют не на животных, а на основании биохимических свойств бруцелл,, т. е. по способности бруцелл образовывать аммиак при гидролитическом расщеплении мочевины под действием уреазы и дезаминировании аминокислот питательной среды под действием дезаминаз.

Перед определением активности дезаминаз и уреазы культуры исследуемых штаммов необходимо проверить на диссоциацию по реакции тсрмопрсципитации и агглютинации с трипафлавином. При обнаружении признаков диссоциации необходимо произвести рассев и проводить дальнейшую работу с культурами, находящимися только в $- или в R-форме, но не в смешанной (SR)

Принцип метода основан на изменении в

10 щелочную сторону рН среды в процессе роста культур бруцелл, наблюдаемом под контролем фенолового красного индикатора. Чтобы избежать подщелачивания за счет мочевины в мясной воде и,поченочном экстракте, пос15 ледние выдерживают 15 — 20 час с кристаллической уреазой.

Приготовление среды. Отмеривают 1 л мясной воды (1: 2); 0,3 л печеночного экстракта (1: 1), приготовленных из мяса и печени мо20 лодой говядины, 10 г сухого пептона, 65 г кристаллической уреазы и 13 мг фенолового красного индикатора. Смесь тщательно перемешивают до полного растворения всех ингредиентов и оставляют на 15 — 20 час при 5—

25 8 С.

После выдержки к смеси прибавляют 5 г поваренной соли.и устанавливают рН 7,6 — 7,8.

Затем добавляют 30 г сухого агар-агара, и всю смесь автоклавируют при 1 атм (120 C)

30 в течение 45 мин, после чего оставляют в ав231064

5. Вг. abortus

25 гоклаве для декантирования. Когда среда остынет, осадок срезают и удаляют.

После растапливания среды текучим паром к ней добавлЯют 1в/> ггллююккооззыы, 2о/о глицеРина и устанавливают рН 7,1 — 7,2. Затем среду разливают по 5 мл в пробирки с ватными пробками и стерилизуют 30 мин под давлением 0,5 — 0,7 атм (110 — 115 С). Пробирки должны быть подобраны одного диаметра и сорта стекла.

Готовая среда в толстом слое должна иметь оранжевый цвет, а в одной пробирке — желтый, с конечной рН б,8 — б,9.

Пробирки со средой скашивают так, чтобы среда покрывала только дно пробирок и оставляют в горизонтальном положении на двоетрое суток при комнатной температуре для подсушивания.

На подсушенные среды производят обильный посев штаммов бруцелл. Для этой цели берут полную петлю (Д = 2 мм) бактериальной массы бруцелл с двухсуточной агаровой культуры и равномерно распределяют по всей поверхности МППГГА с индикатором. Каждый штамм бруцелл засевают, параллельно на две пробирки. Культуры выращивают в течение двух суток в термостате при 37,5 — 38 С во влажной атмосфере (в термостат ставят сосуд с водой). При этом нужно следить, чтобы в помещении не находились летучие кислоты и основания.

Выращенные 48-часовые агаровые культуры бруцелл выдерживают в течение 1 — 2 час в холодильнике при 5 — 8 С, после чего производят учет степени подщелачивания среды.

У штаммов бруцелл, давших плохой рост на

МПIIITA с индикатором (менее б млрд. микробных тел на 1 мл среды), степень подщелачивания не учитывают, и они вновь пересеваются.

Оценка активности дезаминаз основана на способности каждого штамма бруцелл к максимальному подщелачиванию МППГГА и ведется по пятибалльной системе:

0 — нет изменения цвета среды,по сравнению с незасеянной пробиркой;

+ — слабо-оранжевый цвет среды;

++ — оранжевый цвет среды;

+ + + — красный цвет среды;

++++ — малиновый цвет среды с фиолетовым оттенком.

К о н т р о л и. Для проверки правильности приготовления данной серии среды перед массовым исследованием штаммов бруцелл ставят ее контроль. С этой целью засевают пять жтаммов бруцелл на две-три пробирки каждый, обладающих различной активностью дезаминаз и не изменяющих своих свойств при многократных пересевах:

1. Вг. abortus «Лента» (виру- 0 лентный КазахНИВИ)

2. Br. suis 1330 (эталон- + ный) 30

19 (вакцин- +.+ ный)

4. Br. melitensis — 1 (вакцин- + + +

Rev ный Эльберга)

544 (эталон-,+ + + + ный) и две пробирки со средой оставляют при тех же условиях не засеянными.

П р и м е ч а н и е. При отсутствии в лаборатории названных штаммов можно подобрать штаммы из числа имеющихся с нужной активностью дезаминаз, которая не меняется при многократных пересевах.

Если на данной серии среды контрольные шта IMbl хорошо растут и получены четкие ко нтрольные результаты, на нее засеваюг исследуемые штаммы бруцелл. При этом двухсуточные культуры контрольных штаммов принимают за колориметрические эталоны при оценке активности лезаминаз у исследуемых

lllTBMMoB бруцелл. Причем данные колориметрические эталоны относят только к данной серии среды.

Для получения более достоверных результатов активность дезаминаз у всей, партии исследуемых штаммов бруцелл следует определять не менее трех раз и на одной серии среды.

Определение уреазной активности у бруцелл

Принцип метода основан на изменении рН среды в процессе гидролиза мочевины под действием уреазы бруцелл на аммиак и углекислоту. Скорость подщелачивания среды за счет аммиака служит мерой активности уреазы штаммов бруцелл. Учет скорости подщелачивания среды ведут под контролем фенолового красного индикатора до полного измене. ния цвета среды от лимонно-желтого до малинового.

Определение активности уреазы у бруцелл производят на жидкой желатиновой среде, содержащей только один ферментируемый бруцеллами субстрат — мочевину.

Приготовление среды. В колбе на кипящей водяной бане в 1 л дистиллированной воды растворяют 20 мг фенолрота и 10 г желатины.

После того как вся желатина растворится, колбу ставят непосредственно на огонь, доводят до кипения, затем снимают с огня и плотно закрывают пробкой.

В отдельной колбе из однозамещенного фосфорнокислого калия и двузамещенного фосфорнокислого натрия приготовляют 1/15 М буфер с рН б,8.

Для,приготовления 1 л среды к 950 мл раствора желатины с фенолрот (температура комнатная) прибавляют 50 мл 1/15 М фосфатного буфера, доводят до кипения и кипятят на очень слабом огне 2 мин. После этого колбу снимают с огня и, не давая остыть жидкости, быстоо растворяют в ней 20 г мочевины, всыпая последнюю небольшими порциями. Как только вся мочевина растворится, плотно закрытую корковой бробкой колбу со средой

231064

65 остужают под краном. По остывании среда готова для работы.

При комнатной темгературе готовую среду и раствор желатины с индикатором хранить нельзя. При темперагуре О+ 5 С готовая среда сохраняется до пятнадцати дней, раствор желатины с индикатором — до сорока пяти дней. Признаками непригодности среды служит изменение первоначального цвета индикатора н разжижение желатины.

Необходимое оборудование: стерильные пипетки на 2 ял. Для каждого штамма бруцелл заготавливается отдельная пипетка; стерильные пробирки (1,5 X 15 см) должны быть подобраны одного диаметра и сорта стекла. Особенно тщательно должны быть подобраны пробирки для приготовления одномиллиардных взвесей бруцелл, которыми следует пользоваться во всех последующих анализах; стсрильная бюретка на 50 — 100 мл.

Ход анализа.

На стерильном физиологическом растворе по бактерийному стандарту мутности для паратифозных бактерий готовят одномилличрдные взвеси штаммов бруцелл и разливают по

1 мл параллельно в две пробирки. Затем во все пробирки добавляют из бюретки,по 5 мл желатиновой среды, содержимое пробирок перемешивают и пробирки ставят в термостат при температуре 37,5 — 38 С. Содержимое пробирок после смешивания взвеси бруцелл со средой должно быть лимонно-желтого цвета.

Учет реакции ведут в течение первых 3 час с момента смешивания взвеси бруцелл со средой и затем через 24 час выдерживания в термостате, Оценку уреазной активности производят по пятибалльной системе: полное изменение цвета среды в течение 1 час. полное изменение цвета среды в течение 2 час, полное изменение цвета среды в течение 3 час. полное изменение цвета среды б ол ее 3 час.

0 — нет изменения цвета среды через 3 час и не отличается от контроля через 24 час выдерживания в термостате.

Во избежание субъективизма в оценке конца реакции готовят колориметрический эталон: в пробирку с 1 — 2 г хлористого аммония добавляют 0,01 н. раствор едкого натра (калия) с 0,002 г о о фенолрота до появления стойкого малинового окрашивания с красным оттенком (раствор едкого патра с индикатором в такой же пробирке имеет фиолетовый оттенок); 6 мл готового раствора отмеривают в пробирку и запаивают. Цвет приготовленного таким образом эталона очень стоек и не меняется при длительном хранении.

Определение активности уреазы ведут па5

55 раллельно с определением активности дезаминаз, Контроли. При проведении каждой серии анализов рекомендуется ставить следующие контроли.

Для проверки правильности приготовления среды следуе брать эталонные штаммы бруцелл с заведомо известной активностью уреазы: Вг. suis ¹ 1330, полностью изменяющий цвет среды в среднем за 25 мин (++++), и Бг. abottus № 544, не обладающий уреазой и не изменяющий цвета среды на протяжении всего срока наблюдения (О).

Для контроля стерильности компонентов к

1 мл физиологического раствора, на котором готовились взвеси бруцелл, добавляют 5 мл среды, При этом в течение 24 час выдерживания в термостате не должно наблюдаться ,покраснения среды.

У высокоактивных штаммов бруцелл активность уреазы может колебаться при повторных определениях в пределах 10 мин, у слабоактивных — в пределах 20 мин.

Определение вирулентности у бруцелл

Величину степени вирулентности штаммов бруцелл определяют по разности между величиной активности уреазы и величиной активности дезаминаз, выраженных в одинаковых условных единицах:

Вирулентность = + (уреаза — дезаминазы), Чем больше разность между активностью уреазы и дезаминаз, тем выше вирулентность штамма бруцелл. При положительной разности между активностью ферментов вирулентность штамма бруцелл зависит от активности уреазы, при отрицательной — от активности дезаминаз.

Пример 1. Например, у эталонного штамма Вг. suis № 1330 активность уреазы составляет + + 4- +, активность дезаминаз +, следовательно его вирул ентность =- (+ + + + ) — (+ ) = +++.

Пример 2, У вакцинного штамма Вг.

abortus № 19 и активность уреазы и активность дезаминаз составляет ++, следовательно его вирулентность = (++) — (++) = О.

Пример 3. У эталонного штамма Вг.

abortus № 544 активность уреазы составляет

О, а активность дезаминаз ++++, следовательно его вирулентность = (О) — (++++) =

= — (++++) Описанный способ позволяет быстро и с достаточной достоверностью о,пределять вирулентность штаммов бруцелл, например, при дифференциации эпизоотических штаммов ог вакцинных, при отборе и подборе вакцинных штаммов, при изучении направленной изменчивости у возбудителя бруцеллезной инфекции в медицинских и вегеринарных учреждениях, 231064

Предмет изобретения

Составитель А. Леонов

Текред Л. Я. Левина Корректор С. Ф. Гоптаренко

Редактор В, Торопова

Заказ 287/8 Тираж 530 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Центр, пр. Серова, д. 4

Типография, пр. Сапунова, 2

1. Способ определения вирулентности штаммов бруцелл, отличающийся тем, что, с целью быстрого определения вирулентности без использования лабораторных животных, вирулентность штаммов бруцелл определяют путем сравнения активности их ферментов — уреазы и дезаминаз.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что активность уреазы определяют,при оптимальных условиях на желатиновой среде, содержащей только один субстрат, ферментируемый бруцеллами, а именно — мочевину.

3 Способ по п. 1, отличающийся тем, что активность дезаминаз определяют по степени подщелачивания питательной среды, не содержащей мочевину.