Способ получения нуклеотидов или олитонуклеотидов

 

О П И С А Н И Е 239!47

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ

Зависимый от патента ¹ ——

Заявлено 02.XI I.1966 (№ 1116530/23-4) 1 .7, 12р, 4/01

Приоритет 02.XII.1965, ¹ ПВ 7240-65. ЧССР

Комитет оо делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

Опубликовано 10.111.1969. Бюллетень ¹ 10

УД1 547.963.32 (OS8.8) Дата опубликования описания ЗОЛ 11,1969

Авторы изобретения

Иностранцы

Йозеф Моравек и Ян Шкода (Чехословацкая Социалистическая Республика) Иностранное предприятие «Ч ескословенска Академие вед.» (Чехословацкая Социалистическая Республика) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕОТИДОВ ИЛИ

ОЛ И ГОНУКЛ ЕОТ ИДОВ

Известен спосоо получения уридилил- (3 -— 5 )-уриди|па, закл1очающийся в том, что уридин-5 -фосфат подвергают взаимодействию с диUиклогексилкарбодиимидом; полученный

1:ри этом уридин-3 -5 -фос(рат циклическо1 о строения обрабатывают дигидропропаном в среде диоксана, образующийся 2 -О-тетрагидропираниловый эфир гидролизуют при,натресвании .в тидроокиси бария. Полученную смесь

3 - и 5 -фосфатов обрабатывают трифенил-метилхлоридом в пиридине, при этом выделяется только 3 -фосфорное производное, которое ксндснсируют затем с 2,3 -ди-О-ацетилуридином, после чего полученный продукт обрабатываюг щелочью или кислотой.

С целью упрощения и удешевления технологии процесса предложен способ получения нуклеотидов или олигонуклеотидов на основе природных II аномальных нуклеозидов, состояший в том, что нуклеозид или смесь нуклеозидов подвергают взаимодействию с фосфатом щелочного металла в соотношении 1: 1 — 10, преиму1цсствснно 1: 5, при температуре 155—

165 С с последующей хроматографией полу .енной смеси и выделением отдельных нуклеотидов или олитонуклеотидов в чистом виде.

Р качестве аномальных нуклеозидов применяют б-азауридин, б-азацитидин, 5-оксиуридин, урацилксилозид, туберцидин.

П р и il с р 1. 3.6 г уридина и 11,7 " N3112ÐÎ, растворяют в дис1и,7.7ированной воде и сушат по м стодм выз1сраживтlния в колос. Iyo 7 оу до гор:lышка погрх жают В 03н10, Ооогрсвасз1т 10 при температуре 160" С. После нагревания реакционной смеси в течение 1 Mc ее охл;1ждают и растворяют в воде. Зятем отфильтровывают незначительное количес гво иерастворившихся продуктов 11 разделяют смесь с помощью ко10 лонки, заполненной слаоокислой анионообменhОИ СХ10ЛОИ, ПО фСР М113ТНС 1У Цlll . 7 s Г. ОСР СДСТвом градиентного элюирования по станд3ðòèзированной градиентной системе (муравьиная кислота: муравьиная кис.7ота+форм713т), 15 Фракции собирают в автоматически дейст вующий сборник, после чего находят состав вещсства путем определения ультр11фиолстоваго поглощения при 260 1ьттк. Далее обьгдиняют соответствующие фракции по графику из20 влечения, концснтриру1от их, Отдельные вещества осаждают в виде бариевых со- å é "при

ОХ 73ждснии .7 ьдом, Обр 103TBIB I IOT lloC, 10 1083тельно охлажденными спиртом, смесью этилового спирта с эф.ipoil, эфиром. а затоil ci25 IUaT прод к l н;1д п11тиок11С1 10 фос1110ра (фосфорным ангидридом).

1 Iдегlтификацию Отдельны веществ ОсуUIcc7B,7ÿI0ò с помощью бумажной хроматотрафии.

30 При этом получают следующие вещества:

239147

Уридили„((2 —: 5 ) - ридиli 1(61)иди„ (ил-(37. —:.5 ) -урндпн (7% )

Уридин-3 -фосфят (15%)

Уридин-5 -фосфят (15% )

Кро«!е того, по",ó÷àþò 35% уридина В ви.(< чистой фракции.

0()п(ий Вы«сд !Зсс«фссфОР11.71((30(3(JHH(-г(В(.щс-ст.в 62 ого.

П р и м с р 2. 500 3яг б-азауридин-4,5-!!С и

620 лгг МаН РО(21-1 0 растворя(от в 2 !(л дистиллированной воды и сушат в небольшой пробирке по методу В(!«!Ора)кивания. - го этой (Ip06HpJcH ((0(p);(.я!От В бян(0, Оосгревя«3!у lo при Tc3(ï«ðàòóðå 160" С и нагревают 0,5 гас.

После охлаждения реакционную смесь растo0ряют в 0,5 !(л воды и наносят на лист бумаги, применяемой для хроматографирования. Осуществляют нисходящее хроматографировяние с использова|нием смеси — изомасляная кислота:аммиак:вода (бб:32,5:1,5) .

Далее удаляют растворитель из бумаги, обдувая ее воздухом, имеющим температуру лабораторного помещения.

Для обнаружения веществ используют автоматически действующую аппаратуру для определения распределения активности на .полосках «ромятсграммы. После опреде7«HHH зон отдельные полоски «роматограмм(я непрерывно элюируют водой, и э|кстрякты, выделенные из адсорбента, повторно хроматографирук)т, применяя смесь изопропанол: аммиак: ВОда (7: 1: 2). Очищенные указанным путем ве-! цествя элюируют водой и лиофизируют. При этом получают следующие вещества.

6-Азауридилил- (2 — 5 ) -6-азауридин

6-Лзауридилил- (3 — -5 ) -б-азауридин

6-Лзауридин-3 -фосфа r б-Лзауридин-5 -фосфат

Кроме того, полу-(aJOT 6-азауридии

П р и м 0 р 3. 3 !(г б-азауридин-4,5-!4С и 3 гиг б-азацитидина смешивают с 20 )иг KaI4PO< р<,2Н20 и нагревают в пробирке при температуре 160 С в течение 15 !гиц причем в баню для обогрева погружают - гз пробирки. По окончании реакции смесь наносят ня хроматографичеокую бумагу и проводят хроматографирование с применением смеси изспропиловый спирт: аммиак: вода (7:1:2) с таким расчетом, чтобы фронт растворителя достигал края оумати. После высуши вани(1 хроматограмму дополнительно проявляют (в общей сложности три раза). Нуклеозид H нуклсотид,,находящиеся в нижней части хроматограммы, регенерируют путем изв,7ечения из бумаги.

Олигонуклеотиды, сконцентрированные в вор«ней части хроматсграммы, элюируют, и элюат (выпаривают методом вымораживания (18ого).

Получают следующие вещества:

6-Азауридин-монофосфат

6-Лзацитидин-монофосфят, Лзауридилилазауридин

Азауридилазацитидип

Азя<цитидилилазацитидин

Эти Вещества имеют 2.5- и 3,5-ингсрнукл 0тидные связи.

П р и м ер 4. 0,3 г 5-гидроксиуридина и 1 г

Хя П2РО(° 2Н20 обрабатывают аналогично примеру 1, но с тем отли !и«м, JTO нуклеотиды !

; и (олирсвянном виде в!.1.((ляют Ilo методу бум,l ж н )1! «pn«(aтсгр а()) пи на lп(J JJ;(!(era ««ро.,I:17ТÎ! p(J <)) J(lc с ко!1 б i 3(3 (H. П зол и рова нные H), клсотидные фракции выделяют с 82%-ным выкодом. IIолучают следующие вещества:

Гидрсксиуридплил- (2 — 5 ) -тидроксиуридин

Гидроксиуридпл-(3 - 5 ) -гидроксиуридин

1 пдроксиуридин-3 -<))осфат

I J J;l рокси) ридин-5 -фосф (1 т

Гидроксиуридин

Пример 5. 2,44 3яг уридин-2-!4С растворяют в 0,1 !(л воды и к полученному раствору добавляют 0,1 !гл воднOr0 раствора, содержаще(о 3,24 лг нерадиоактивной уридиловой кислоты. После тщательного.перемешивания воду удаляют методом вымораживания. Смесь нагрева!от при температуре 160= С в течение

5 лггн, причем в сосуде для проведения реакJiJIH поддерживают вакуум. Продукт реакции

Вь(дс, l(1107 В чисто«! Видс Ilo пр!!31«р1 3. Г10.7 1— (ают радиоактивный уридилил- (3 - "5 ) -уридин (Яо/о), УРицилил-(2 - .5 )-УРидин (8 j<) ) и 30 го уридин-2 (3 )-фосфат. I-Iс вошедший в реакцию ((c«07J3i (- С-уридин регенерируют.

Пример 6. 360 .!(г язацитидина и 1,17 г

ХаН2РО., 2Н)О обрабатыва!от, как указано в примере 1, но с тем отличием, что нуклеотиды выделяют по методу бумажной хроматографии

1;я шести листа««роматографичеакой бумаги.

Выход нуклеотидов 65%. Получают следуюшие вещества:

Лза цитидилил- (3 -5 ) -азацитиди(н

Лзацитидилил-(2 -5 )-азацитидин

Лзацитидин-2 (3 ) -фосфат

Азацитидин

Пример 7. 350 лг урацилксилозида и 1,2 г

МаН,РО, 2Н О обрабатывают, как указано !

3 примере 1, но с тем отличием, что нуклеоти"1,(I (выход 26%) выделяют по методу бумажной хроматографии на шести листах хроматографичсской бумаги. Получают урацилксило)ид-монофосфат.

Пример 8. 3 лг туберцидина и 16 !гг

Хг!Н2РО1 2Н20 обрабатывают, как указано

В примере 1, по с тем отличием, что нуклеозиды выделяют по методу бумажной хроматографии на одном листе «роматсграфической бумаги. Выход:нуклестидов 25%. Получают туберцидин-монсфосфат.

Предмет изобретения

1. С!(особ получения нуклсотидов или олигонуклеотидов на основе природ ных и аномальных нуклеозидсв, отлггчагогц(гася тем, что, с целью упрощения техноло гии процесса, нук, «озид или смесь нуклеозидов подвергают об,работке <))осфатом щелочного металла в соотношении 1:1 — 10 при температуре 155 — 165 С с по ледующей хроматографией полученной

239147

Составите1l С. Б. IloJIAkOR I

Редактор Л. К. Ушакова Техред А. А. Камышникова Корректор Н. И. Шапошникова

Заказ о!9, 3 Тираж 480 Подписное

1!1-!ИИП1.! Комитета по делам изобретени11 и открыоп! при Совете Министров ССС)

Москва, Центр, пр. Серова, д. 4! ипографпя, ир. Сап! иова, 9 смеси и выдс IcI!IIcii отдельнык нуклсотидов и

ОЛIIÃOÍ "Ê. IСОТИДОВ Б IИСТОМ ВИДС.

2. Способ по п. 1, отличп ощийс» тем, что смесь нуклсозидов и фосфат ьцелочнотэ металла берут в соотноше11ии 1:„>.

3. Споспо по и. 1, отлипспоп1ийс.ч тем, 1то в ка пссгвс аномал1нык нуклеозидов применя-!

От б-азауридин, 6-азацитидин. 5-оксиурнднн, урацилксилозид и туборцидин.