Биопрепарат для очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов

Биопрепарат включает консорциум аэробных бактериальных культур, Acidovorax delafieldii ВКПМ В-8358 (НТ-1), Burkholderia caryophylli ВКПМ В-8359 (НТ-4), Pseudomonas fluorescens biovar ВКПМ В-8360 (II НТ-6), Citobacter amalonaticus ВКПМ В-8361 (Ян-3-2), Pseudomonas fluorescens ВКПМ В-8362 (Ян-8-2), Serratia marcescens ВКПМ В-8363 (Ян-10-2) с титром живых клеток не менее 10¹⁰. Биопрепарат обладает высокой деструктивной способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. 1 табл.

 

Изобретение относится к средствам борьбы с загрязнениями объектов окружающей среды нефтью и нефтепродуктами и может быть использовано, например, при ликвидации нефтяных загрязнений.

Поскольку на территории России эксплуатируется более 200 тыс. км магистральных нефтепроводов и 350 тыс. км промысловых нефтепроводов, ежегодно на внутрипромысловых нефтепроводах происходит до 40 тыс. аварий. По мнению специалистов "Гринпис", аварийные потери нефти в России достигают 25 млн. т ежегодно. В нефтезагрязненных почвах подавлена жизнедеятельность биоты, нарушены трофические связи, физико-химические и биологические свойства.

Разлившаяся нефть адсорбируется почвой и в основной массе локализуется в ее верхнем слое. Легколетучие фракции нефти удаляются с поверхности за счет испарения, а тяжелые нефти, смолы и асфальтены практически не выветриваются и медленно просачиваются в глубь почвы. В связи с этим стоит задача разработки высокоэффективных технологий очистки и восстановления окружающей среды, загрязненной нефтью и нефтепродуктами.

Современные нефтеокисляющие препараты представляют собой, как правило, лиофильно высушенную биомассу активных штаммов микроорганизмов, главным образом, бактерий в смеси с азотно-фосфорными соединениями. Иногда в препарат включают нейтральный сорбент.

Часто в качестве нефтеокисляющего препарата используют бактерии рода Pseudomonas (Muracami A., Suzuki К., - J. Oceanogr. Soc. Jap., 1985, v.41, №5, p.p.337-344; Балашова Н.В., Кошелева И.А., Филонов А.Е. и др. Штамм Pseudomonas putida BS 3701 - деструктор фенантрена и нафталина. - Микробиология, 1997, т.66, №4, стр.488-493). Используется также смешанная культура микроорганизмов, например, Flavobacterium и Pseudomonas (Horowitz A., Atlas R.M. - Biodeterior. Ргос. 4^th Int. Bioterior. Symp., Berlin, Londjn, - 1980, p.15-30). Анализ литературных источников свидетельствует о целесообразности использования групп микроорганизмов для утилизации нефти и нефтепродуктов. Американская фирма "Polybac Corporation" выпускает препараты "Фенобак" и "Петробак" (Stoff С.В. - Chemical proceeding, 1982, №12 (Dec.), p.11). Препараты содержат мутантные штаммы бактерий. Известен также препарат "Гидробак" (там же).

Наиболее близким аналогом к заявляемому биопрепарату является биопрепарат фирмы "Полиинформ" (патент РФ №2138451, С02F 3/34, 1997 г.). Биопрепарат включает аэробные нефтеокисляющие бактерии, минеральные добавки и наполнитель. В качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий содержится консорциум мезофильных бактериальных штаммов Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus species ПИ Ку-1 и консорциум психрофильных бактериальных штаммов Pseudomonas fluorescens ПИ ЛБХ-3, Pseudomonas putida ПИ ЛБХ-8, Xanthomonas species ПИ ЛБХ-7. В качестве минеральных добавок используют источники азота, фосфора, калия. В качестве наполнителя используют стерильный торф. Недостатком биопрепарата является сложный (мезофильные и психрофильные штаммы бактерий) состав микроорганизмов.

Основной задачей авторов настоящего изобретения было получение биопрепарата, обладающего высокой деструктивной способностью к утилизации трудноокисляемых фракций нефти и нефтепродуктов, стойкого при хранении, нетоксичного, неканцерогенного, не образующего при контакте с воздухом и водой токсичных и пожароопасных соединений.

Чистые культуры, входящие в заявляемый биопрепарат, выделены из нефтезагрязненных почв. Штаммы задепонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП ГосНИИгенетики.

Штамм Acidovorax delafieldii НТ-1 (ВКПМ В-8358) - подвижные с полярным жгутикованием прямые палочки размером 0,6-0,8×2,0 мкм, расположенные одиночно и попарно. Окраска по Граму - отрицательная. На стандартных питательных средах образует круглые колонии 2 мм в диаметре. Выпуклые, гладкие, блестящие, края ровные, бесцветные, непрозрачные. Аэроб, хемоорганотроф. Не нуждается в факторах роста. Оксидазный тест положительный. Каталазный тест положительный. Не образует флуоресцирующий пигмент. Растет при 4°С, не растет при 41°С. Не обладает способностью к денитрификации. Желатин не гидролизует. Крахмал не гидролизует. Использует в качестве единственного источника углерода глюкозу, глутамат, ксилозу, рибозу, малонат, углеводороды. Не использует трегалозу, инозит, рамнозу и сахарозу.

Штамм Burkholderia caryophylli НТ-4 (ВКПМ В-8359) - подвижные прямые палочки размером 0,8-0,9×0,9-2,0; 1,5×1,5 мкм, расположенные одиночно и скоплениями. Окраска по Граму - отрицательная. На стандартных питательных средах образует круглые колонии 2 мм в диаметре. Выпуклые, гладкие, блестящие, края ровные, белые, непрозрачные. Аэроб, хемоорганотроф. Не нуждается в факторах роста. Оксидазный тест положительный. Каталазный тест положительный. Не образует флуоресцирующий пигмент. Не растет при 4°С, растет при 41°С. Обладает способностью к денитрификации с образованием азота. Желатин не гидролизует. Крахмал не гидролизует. Использует в качестве единственного источника углерода глюкозу, глутамат, этанол, сукцинат, ксилозу, маннит, углеводороды.

Штамм Pseudomonas fluorescens biovar II НТ-6 (ВКПМ В-8360) - палочки прямые, мелкие, одиночные, слегка изогнутые, имеют полярные жгутики, споры не образует, размеры 0,8-0,9×1,1-3,0 мкм. Окраска по Граму - отрицательная. На стандартных средах образует круглые колонии диаметром 2 мм и более, выпуклые, гладкие, блестящие, края ровные, бесцветные, непрозрачные. Аэроб, способен расти в анаэробных условиях в присутствии в среде нитратов. Хемоорганотроф. Окислительный тип метаболизма. Растет при 4°С, не растет при 41°С. Штамм каталазо-положителен, оксидазо-положителен. Образует флуоресцирующий пигмент. Образует аргинин дегидролазу. Гидролизует желатину. Образует леван из сахарозы. Не гидролизует крахмал. Способен к денитрификации. Использует в качестве источника роста глюкозу, трегалозу, аргинин, инозит, углеводороды.

Штамм Cifrobacter amalonaticus Ян-3-2 (ВКПМ В-8361) - палочки прямые с закругленными концами, одиночно- и парнолежащие, размер 0,7-0,8×1,2-2,0 мкм. Окраска по Граму - отрицательная. Колонии на питательном агаре круглые, выпуклые с возвышением в центре, 3-5 мм в диаметре, гладкие, блестящие, края ровные, полупрозрачные, непигментированные. Метаболизм ферментативный. Штамм каталазо-положительный, оксидазо-отрицательный. Факультативный анаэроб. Обладает орнитин дегидролазой, но не лизин и аргинин. Не утилизирует цитрат и мочевину. Не образует сероводород. Образует индол. Реакция Фогес-Проскауера отрицательная. Не разжижает желатин. Образует кислоту из глюкозы, маннита, сорбита, рамнозы, амигдалина, арабинозы. Не образует кислоту из инозита, сахарозы и мелибиозы.

Штамм Pseudomonas fluorescens Ян-8-2 (ВКПМ В-8362) - палочки подвижные прямые с закругленными концами, одиночно и парно лежащие, размер 0,7-0,8×2,5-3,5 мкм. Окраска по Граму - отрицательная. Колонии на питательном агаре круглые, выпуклые 2-3 мм в диаметре, гладкие, блестящие, край мелкозубчатый, полупрозрачные, непигментированные. Метаболизм окислительный. Штамм каталазо-положительный, оксидазо-положительный. Аэроб, способен расти в анаэробных условиях, используя в качестве конечного акцептора электронов нитрат. Обладает денитрификацией, не нуждается в факторах роста. Растет при 4°С, не растет при 41°С. Обладает орнитин дегидролазой, но не лизин и аргинин. Утилизирует цитрат. Не разрушает мочевину. Не образует сероводород. Образует индол. Реакция Фогес-Проскауера отрицательная. Не разжижает желатин. Образует кислоту из глюкозы, маннита, сорбита, рамнозы, амигдалина, арабинозы. Не образует кислоту из инозита, сахарозы и мелибиозы.

Штамм Serratia marcescens Ян-10-2 (ВКПМ В-8363) - палочки прямые, размер 0,8-0,9×1,2-2,4 мкм. Окраска по Граму - отрицательная. Колонии на питательном агаре круглые, выпуклые, 3-5 мм в диаметре, гладкие, блестящие, края изрезанные, непрозрачные, красного цвета. Метаболизм ферментативный. Штамм каталазо-положительный, оксидазо-отрицательный. Факультативный анаэроб. Обладает орнитин и лизин, но не аргинин дегидролазой. Утилизирует цитрат. Не разрушает мочевину. Не образует сероводород. Реакция Фогес-Проскауера положительная. Обладает желатиназой. Образует кислоту из глюкозы, сахарозы, маннита, инозита, сорбита, амигдалина. Не образует из мелибиозы, рамнозы. Обладает нитрат редукцией.

Для получения препарата проводили раздельное культивирование штаммов по стандартной методике.

Полученные препараты после добавления консервантов хранили в холодильнике при температуре 4-6°С.

Непосредственно перед проведением испытаний шесть препаратов, каждый из которых содержал по одному штамму микроорганизма-деструктора, смешивали в одинаковых количествах.

Биопрепарат проходил испытания на модельных установках и производственных условиях.

Результаты проведения опытов на модельных установках с целью определения деструктивной способности биопрепарата приведены в таблице 1.

В первом опыте в пластмассовые сосуды объемом 1 л поместили по 500 г почвы, загрязненной мазутом. По данным хроматомасс-спектрометрического анализа содержание трудноокисляемых тяжелых фракций составляло 78%. В почву внесли по 10 мл лабораторного образца биопрепарата, предварительно разведенного водопроводной водой в 10 раз. В качестве источников азота, фосфора и калия внесли расчетное количество мочевины, двойного суперфосфата и хлорида калия; в качестве ПАВ использовали ТВИН-80. Почву в сосудах периодически увлажняли, не допуская пересыхания, перемешивая через день. В контрольных сосудах почву ничем не обрабатывали. Не увлажняли, не перемешивали.

Во втором опыте (условия аналогичны условиям опыта 1) использовали почву, загрязненную углеводородами с содержанием легких фракций 70-90%, а также тяжелыми металлами в концентрациях, в 10-50 раз превышающих предельно допустимые концентрации. Исходная концентрация углеводородов - 21,5 г/кг.

Таблица 1
Вариант опыта	Образец	Концентрация углеводородов, г/кг	Средняя концентрация углеводородов, г/кг	Снижение концентрации углеводородов, %
1	Даты	09.01	29.01	13.02	02.03	23.03	09.01	29.01	13.02	02.03	23.03	09.01	29.01	13.02	02.03	23.03
	Исходная почва	29,9	30.0
	30,0
	Контроль	28,8	27,2	30,4	22,0	24,8
		26,4	23,2	19,6	21,6	16,4	27,6	25,2	25,0	21,8	20,6	8,0	16,0	16,7	27,3	31,3
		27,8	27,8	25,1	21,9	20,7
	Биопрепарат	12,0	9,2	7,2	6,8	5,6	14,6	10,0	7,0	6,4	5,4	51,3	66,0	76,7	87,7	82,0
		17,2	11,2	6,8	6,0	5,2
2	Даты	31.01	13.02	02.03	23.03	25.04	31.01	13.02	02.03	23.03	25.04	31.01	13.02	02.03	23.03	25.04
	Исходная почва	18,8	21,5
	25,0
	Контроль	18,8	14,4	10,0	10,4	10,2	19,2	15,6	12,0	10,3	10,0	10,7	27,4	44,2	52,1	50,0
		19,6	16,8	14,0	10,2	9,8
	Биопрепарат	7,6	10,0	10,0	8,4	3,1	8,2	9,6	10,8	8,0	2,8	61,9	55,3	49,8	62,8	86,0
		8,8	9,2	11,6	7,6	2,5

Биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, включающий консорциум аэробных бактериальных культур, отличающийся тем, что в качестве консорциума бактериальных культур используют Acidovorax delafieldii ВКПМ В-8358 (НТ-1), Burkholderia caryophylli ВКПМ В-8359 (НТ-4), Pseudomonas fluorescens biovar ВКПМ В-8360 (II НТ-6), Citrobacter amalonaticus ВКПМ В-8361 (Ян-3-2), Pseudomonas fluorescens ВКПМ В-8362 (Ян-8-2), Serratia marcescens ВКПМ В-8363 (Ян-10-2) с титром живых клеток не менее 10¹⁰.