Пробиотический штамм lactobacillus salivarius (варианты), пробиотический препарат на их основе и способ лечения или предупреждения с использованием штаммов lactobacillus salivarius
МАХОНИ Лайам (IE)
Штаммы Lactobacillus salivarius AH102, AH103, AH105, AH109 или AH110 обладают свойствами пробиотика, предназначены для приготовления пробиотического препарата, используемого, в частности, для применения в процедурах иммунизации и вакцинации. Штамм или штаммы при введении их субъекту являются полезными при профилактике или лечении воспалительной активности, особенно нежелательной воспалительной активности в желудочно-кишечном тракте, такой как воспалительное заболевание кишечника или синдром раздраженного кишечника, диарейного заболевания. 11 н. и 34 з.п. ф-лы, 6 ил., 9 табл.
Изобретение относится к штаммам Lactobacillus salivarius и их использованию в качестве пробиотических бактерий, в частности в качестве иммуномодулирующих биотерапевтических агентов.
Защитные механизмы для предохранения желудочно-кишечного тракта человека от колонизации кишечными бактериями являются очень сложными и включают в себя как иммунологические, так и неиммунологические аспекты (1). Врожденные защитные механизмы включают в себя низкий рН желудка, соли желчных кислот, перистальтику, муциновые слои и антимикробные соединения, такие как лизоцим (2). Иммунологические механизмы включают в себя специализированные лимфоидные агрегаты, расположенные под М-клетками, названные пейеровыми бляшками, которые распространены по всей тонкой кишке и ободочной кишке (3). Антигены просвета кишечника, присутствующие в этих участках, приводят к стимуляции соответствующих субпопуляций Т- и В-клеток с образованием сетей цитокинов и секреции антител в желудочно-кишечный тракт (4). Кроме того, представление антигенов внутриэпителиальным лимфоцитам и иммунным клеткам, расположенным под собственной пластинкой, может происходить посредством эпителиальных клеток (5). Поэтому организм-хозяин по существу вносит вклад в иммунологическую защиту желудочно-кишечного тракта. Однако, так как слизистая желудочно-кишечного тракта представляет собой самую большую поверхность, через которую организм-хозяин взаимодействует с внешней средой, должны присутствовать специфические контрольные механизмы для регулирования иммунной реактивности на 100 тонн пищи, которые обрабатывает желудочно-кишечный тракт на протяжении средней продолжительности жизни. Кроме того, кишечник колонизирован более чем 500 видами бактерий, насчитываемых в количестве 1011-1012/г в ободочной кишке. Таким образом, эти контрольные механизмы должны быть способны отличать непатогенные адгезивные бактерии от инвазивных патогенов, которые могли бы вызвать значительные повреждения в организме-хозяине. Фактически, кишечная флора способствует защите хозяина посредством конкуренции с вновь поглощенными потенциально патогенными микроорганизмами.
Бактерии, присутствующие в желудочно-кишечном тракте человека, могут способствовать воспалению. Аберрантные иммунные ответы на собственную микрофлору влекут за собой некоторые болезненные состояния, такие как воспалительное заболевание кишечника. Антигены, связанные с нормальной флорой, обычно приводят к иммунологической толерантности, а неспособность достичь этой толерантности является главным механизмом воспаления слизистой оболочки (6). Подтверждением этого нарушения толерантности служит повышение уровней антител против кишечной флоры у пациентов с ВЗК (воспалительным заболеванием кишечника).
Настоящее изобретение относится к штаммам Lactobacillus, которые, как было показано, обладают иммуномодулирующими эффектами посредством модулирования уровней цитокинов или посредством антагонистического воздействия и удаления провоспалительных микроорганизмов из желудочно-кишечного тракта.
Краткое описание изобретения
Согласно данному изобретению предложен штамм Lactobacillus salivarius, выбранный как один или более чем один из АН102, АН103, АН105, АН109 и АН110 и их мутантов или вариантов.
Мутант может представлять собой генетически модифицированный мутант. Вариант может представлять собой встречающийся в природе вариант Lactobacillus salivarius.
В одном воплощении изобретения штаммы Lactobacillus salivarius находятся в форме жизнеспособных клеток. Или же штаммы Lactobacillus salivarius находятся в форме нежизнеспособных клеток.
В одном аспекте изобретения штаммы находятся в форме биологически чистой культуры.
В одном аспекте изобретения штаммы Lactobacillus salivarius выделены из резецированного и промытого желудочно-кишечного тракта человека. Предпочтительно, штаммы Lactobacillus salivarius оказывают значительное иммуномодулирующее действие после перорального приема у людей.
Также, согласно данному изобретению предложен препарат, который содержит по меньшей мере один штамм Lactobacillus salivarius по данному изобретению. Такой препарат может содержать два или более штамма Lactobacillus.
В одном аспекте изобретения препарат содержит другой пробиотический материал.
В одном аспекте изобретения препарат содержит пребиотическое вещество.
Предпочтительно препарат содержит носитель, пригодный для приема внутрь. Носитель, пригодный для приема внутрь, может представлять собой фармацевтически приемлемый носитель, такой как капсула, таблетка или порошок. Предпочтительно носитель, пригодный для приема внутрь, представляет собой пищевой продукт, такой как подкисленное молоко, йогурт, замороженный йогурт, сухое молоко, концентрат молока, плавленые сыры, приправы или напитки.
В одном аспекте изобретения препарат по изобретению дополнительно содержит белок и/или пептид, в частности белки и/или пептиды, которые богаты глутамином/глутаматом, липид, углевод, витамин, минеральное вещество и/или микроэлемент.
В одном аспекте изобретения штаммы Lactobacillus salivarius присутствуют в препарате в количестве более 106 КОЕ (колониеобразующих единиц) на грамм системы доставки. Предпочтительно, препарат включает в себя один или более чем один адъювант, бактериальный компонент, лекарственное соединение или биологическое соединение.
В одном аспекте изобретения препарат предназначен для процедур иммунизации и вакцинации.
Далее, согласно данному изобретению предложены штаммы Lactobacillus salivarius или препарат по изобретению для применения в качестве пищевых продуктов, в качестве лекарственного средства, для применения при профилактике и/или лечении нежелательной воспалительной активности, для применения при профилактике и/или лечении нежелательной воспалительной активности в желудочно-кишечном тракте, как, например, воспалительного заболевания кишечника, например болезни Крона или неспецифического язвенного колита, синдрома раздраженного кишечника, резервуарного илеита или постинфекционного колита, для применения при профилактике и/или лечении рака желудочно-кишечного тракта, для применения при профилактике и/или лечении системного заболевания, такого как ревматоидный артрит, для применения при профилактике и/или лечении аутоиммунных расстройств, являющихся результатом нежелательной воспалительной активности, для применения при профилактике и/или лечении рака, являющегося результатом нежелательной воспалительной активности, для применения при профилактике рака, для применения при профилактике и/или лечении диареи вследствие нежелательной воспалительной активности, например диареи, вызванной Clostridium difficile, диареи, вызванной ротавирусом, или постинфекционной диареи, для применения при профилактике и/или лечении диареи, вызванной инфекционным агентом, таким как E.coli.
Также согласно данному изобретению предложены штаммы Lactobacillus salivarius или препарат по изобретению для применения в приготовлении противовоспалительного биотерапевтического агента для профилактики и/или лечения нежелательной воспалительной активности или для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для профилактики и/или лечения нежелательной воспалительной активности.
В одном аспекте изобретения штаммы по изобретению действуют путем антагонистического воздействия на провоспалительные микроорганизмы и удаления их из желудочно-кишечного тракта.
Также согласно данному изобретению предложены штаммы Lactobacillus salivarius или препарат по изобретению для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для снижения уровней провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-8.
Далее согласно данному изобретению предложены штаммы Lactobacillus salivarius для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для модулирования уровней цитокинов, таких как ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ФНО-α или γ-ИФН (γ-интерферона).
Далее, согласно данному изобретению предложены штаммы Lactobacillus salivarius для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для модификации уровней γ-ИФН. В этом случае штаммы предпочтительно выбраны из АН102, АН103 или АН105.
Далее, согласно данному изобретению предложены штаммы Lactobacillus salivarius для применения в приготовлении биотерапевтических агентов для модификации уровней ИЛ-10.
Далее, согласно данному изобретению предложены штаммы Lactobacillus salivarius для применения в приготовлении биотерапевтических агентов для модификации уровней ИЛ-12.
Далее, согласно данному изобретению предложены штаммы Lactobacillus salivarius для применения в приготовлении биотерапевтических агентов для модификации уровней ИЛ-8.
Далее, согласно данному изобретению предложен штамм Lactobacillus salivarius АН110 для применения в приготовлении биотерапевтических агентов для модификации уровней ФНО-α (фактора некроза опухоли α).
Также, согласно данному изобретению предложено применение штаммов Lactobacillus salivarius в качестве противоинфекционных пробиотических штаммов, обусловленное их способностью подавлять рост патогенных видов.
Авторами изобретения обнаружено, что определенные штаммы Lactobacillus проявляют иммуномодулирующие эффекты in vitro.
Таким образом, данное изобретение имеет потенциальное большое терапевтическое значение в профилактике или лечении нарушения регуляции иммунных ответов, такого как нежелательные воспалительные реакции, например воспалительного заболевания кишечника.
Указанные штаммы могут быть использованы в качестве набора биотерапевтических агентов, из которого их можно выбирать для модификации уровня γ-ИФН, ФНО-α (фактора некроза опухоли α), ИЛ-8, ИЛ-10 и/или ИЛ-12.
Штаммы или препараты по изобретению могут быть использованы для предупреждения и/или лечения воспалительных заболеваний, иммунодефицита, воспалительного заболевания кишечника, синдрома раздраженного кишечника, рака (в частности, желудочно-кишечной и иммунной систем), диареи, диареи, вызванной антибиотиком, диареи у детей, аппендицита, аутоиммунных расстройств, рассеянного склероза, болезни Альцгеймера, ревматоидного артрита, заболевания брюшной полости, сахарного диабета, при трансплантации органов, для лечения и/или предупреждения бактериальных инфекций, вирусных инфекций, грибковых инфекций, периодонтального заболевания, мочеполового заболевания, венерического заболевания, ВИЧ-инфекции, ВИЧ-репликации, диареи, связанной с ВИЧ, хирургической травмы, метастатического заболевания, вызванного хирургическим вмешательством, сепсиса, потери веса, анорексии, для контроля лихорадки, для лечения и/или предупреждения кахексии, при заживлении ран, для лечения или предупреждения язв, в функции кишечного барьера, для лечения и/или предупреждения аллергии, астмы, респираторных заболеваний, нарушений кровообращения, коронарной болезни сердца, анемии, нарушений системы свертывания крови, заболевания почек, расстройств центральной нервной системы, заболевания печени, ишемии, нарушения питания, остеопороза, эндокринных расстройств, эпидермальных заболеваний, псориаза и/или обыкновенных угрей.
Штаммы Lactobacillus являются симбиотическими микроорганизмами. Они были выделены из микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека. Иммунная система в желудочно-кишечном тракте не может давать сильно выраженную реакцию в отношении представителей этой флоры, так как проистекающая из этого воспалительная активность будет также повреждать клетки организма-хозяина и функцию ткани.
Следовательно, существует(ют) некоторый(е) механизм(ы), посредством которых иммунная система может распознавать симбиотических непатогенных представителей желудочно-кишечной флоры как отличающихся от патогенных организмов. Это обеспечивает то, что повреждение тканей организма-хозяина ограничено, а защитный барьер тем не менее поддерживается.
Штамм Lactobacillus salivarius АН102 был депонирован в Национальной коллекции промышленных и морских бактерий (National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited, NCIMB) 20 апреля 2000 года и получил регистрационный номер NCIMB 41044.
Штамм Lactobacillus salivarius АН103 был депонирован в NCIMB 20 апреля 2000 года и получил регистрационный номер NCIMB 41045.
Штамм Lactobacillus salivarius AH105 был депонирован в NCIMB 20 апреля 2000 года и получил регистрационный номер NCIMB 41047.
Штамм Lactobacillus salivarius AH109 был депонирован в NCIMB 22 марта 2001 года и получил регистрационный номер NCIMB 41093.
Штамм Lactobacillus salivarius AH110 был депонирован в NCIMB 22 марта 2001 года и получил регистрационный номер NCIMB 41094.
Lactobacillus salivarius может представлять собой генетически модифицированного мутанта или может представлять собой встречающийся в природе вариант этой бактерии.
Предпочтительно, Lactobacillus salivarius находится в форме жизнеспособных клеток. Или же Lactobacillus salivarius может находиться в форме нежизнеспособных клеток.
Следует понимать, что конкретный штамм Lactobacillus no изобретению можно вводить животным (включая человека) в форме, пригодной для перорального приема, в традиционном препарате, таком как капсулы, микрокапсулы, таблетки, гранулы, порошок, пастилки, пилюли, суппозитории, суспензии и сиропы. Подходящие препараты можно приготовить посредством обычно применяемых способов, используя традиционные органические и неорганические вспомогательные вещества. Количество активного ингредиента в медицинской композиции может находиться на уровне, который будет давать требуемый терапевтический эффект.
Препарат может также включать в себя бактериальный компонент, лекарственное вещество или биологическое соединение.
Кроме того, вакцина, содержащая один или более чем один штамм по изобретению, может быть приготовлена с использованием любого подходящего известного метода и может включать в себя фармацевтически приемлемый носитель или адъювант.
Во всем описании изобретения термины «мутант», «вариант» или «генетически модифицированный мутант» включают в себя штамм Lactobacillus salivarius, чьи генетические и/или фенотипические свойства изменены по сравнению с родительским штаммом. «Встречающиеся в природе варианты» Lactobacillus salivarius включают селективно выбранные спонтанные изменения заданных свойств, тогда как преднамеренное изменение свойств родительского штамма производят традиционными методами генной инженерии, таким как разрыв генов, перенос конъюгацией и так далее.
Краткое описание графических материалов
Фиг.1 представляет собой гистограмму, показывающую число адгезивных бактерий на 20 эпителиальных клеток, при использовании эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта человека, СаСо-2 и НТ-29;
Фиг.2 представляет собой гистограмму, показывающую уровни γ-ИФН, индуцированного РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови), после совместного инкубирования со штаммами Lactobacillus salivarius;
Фиг.3 представляет собой гистограмму, показывающую воздействие на уровни ИЛ-10 (пг/мл), индуцированного РВМС, после совместного инкубирования со штаммами Lactobacillus salivarius;
Фиг.4 представляет собой гистограмму, показывающую воздействие штаммов Lactobacillus salivarius на выработку ИЛ-12 (пг/мл) РВМС;
Фиг.5 представляет собой гистограмму, показывающую воздействие штаммов Lactobacillus salivarius на выработку ИЛ-8 (пг/мл) РВМС; и
Фиг.6 представляет собой гистограмму, показывающую способность штаммов Lactobacillus salivarius модулировать выработку провоспалительных цитокинов, измеряемую в пг/мл.
Подробное описание изобретения
Авторами изобретения обнаружено, что штаммы Lactobacillus salivarius АН102, АН103, АН105, АН109 и АН110 являются не только толерантными к кислотам и желчи и прилипают к клеткам кишечных клеточных линий человека, но, неожиданно, также оказывают иммуномодулирующие воздействия путем модулирования уровней цитокинов или путем антагонистического воздействия и удаления провоспалительных или иммуномодулирующих микроорганизмов из желудочно-кишечного тракта.
Пробиотические бактерии обычно используют в форме жизнеспособных клеток. Однако использованию также могут подлежать нежизнеспособные клетки, как, например, убитые культуры или композиции, содержащие полезные факторы, экспрессируемые пробиотическими бактериями. Это может включать в себя микроорганизмы, убитые посредством термического воздействия, или микроорганизмы, убитые посредством выдержки при измененном рН или путем воздействия давлением. Приготовление продуктов с нежизнеспособными клетками является более простым: клетки легко можно включить в состав в фармацевтических препаратов, а требования к хранению гораздо менее ограничивающие, чем для жизнеспособных клеток. Lactobacillus casei YIT 9018 является примером эффективного применения клеток, убитых посредством теплового воздействия, в средства для лечения и/или предупреждения роста опухоли, как описано в патенте США №4347240.
Неизвестно, требуются ли для оказания иммуномодулирующего действия интактные бактерии, или индивидуальные активные компоненты по изобретению могут применяться самостоятельно. Провоспалительные компоненты некоторых бактериальных штаммов были идентифицированы. Провоспалительные эффекты грамотрицательных бактерий опосредованы липополисахаридом (ЛПС). Свободный ЛПС индуцирует провоспалительную цепь, частично вследствие связывания ЛПС с CD14-рецептором на моноцитах. Предполагается, что компоненты пробиотических бактерий обладают иммуномодулирующей активностью благодаря воздействиям всей клетки. При выделении этих компонентов ожидается преобразование фармацевтического качества.
Интерлейкин-8 (ИЛ-8) является одним из цитокинов, составляющих семейство макрофагальных воспалительных белков (MIP). Семейства MIP-1 и -2 представляют группу белков, которые являются хемотактическими факторами для лейкоцитов и фибробластов. Это семейство белков также называют интеркринами (intercrines), так как их способны синтезировать клетки, отличные от макрофагов. Эти клетки включают Т- и В-клетки, фибробласты, эндотелиальные клетки, кератиноциты, гладкомышечные клетки, синовиальные клетки, нейтрофилы, хондроциты, гепатоциты, тромбоциты и клетки опухоли. М1Р-1α, -1β, белок, активирующий соединительную ткань (СТАР), фактор 4 тромбоцитов (PF4) и ИЛ-8 стимулируют хемотаксис нейтрофилов. Моноцитарный хемотаксический белок (МСР-1) и RANTES являются хемотактическими для моноцитов, ИЛ-8 - для нейтрофилов и лимфоцитов, тогда как PF4 и СТАР являются хемотактическими для фибробластов. Описано, что некоторые члены этого семейства выполняют роли, отличные от хемотаксиса. МСР-1 стимулирует цитостатическую активность моноцитов и высвобождение супероксидных анионов. СТАР и PF4 усиливают пролиферацию фибробластов, ИЛ-8 повышает проницаемость сосудов, тогда как MIP-1α и -1β являются пирогенными. ИЛ-8 глубоко вовлечен в воспалительные ответы в желудочно-кишечном тракте. Стимуляция ИЛ-8 (и других провоспалительных цитокинов) может способствовать развитию повреждений желудочно-кишечного тракта, поэтому важно, чтобы пробиотические бактерии не стимулировали выработку этого цитокина.
ИЛ-10 вырабатывается Т-клетками, В-клетками моноцитами и макрофагами. Этот цитокин усиливает пролиферацию и дифференцировку В-клеток в клетки, секретирующие антитела. ИЛ-10 проявляет главным образом противовоспалительную активность. Он осуществляет позитивную регуляцию экспрессии антагонистов рецепторов ИЛ-1 моноцитами и подавляет большинство воспалительных активностей моноцитов. ИЛ-10 подавляет выработку цитокинов моноцитами, активных промежуточных соединений кислорода и азота, экспрессию II класса МНС (главного комплекса гистосовместимости), уничтожение паразитов и выработку ИЛ-10 посредством механизма обратной связи (7). Также было показано, что этот цитокин блокирует выработку моноцитами кишечной коллагеназы и коллагеназы IV типа посредством вмешательства в простагландин Е2 (ПГЕ2)-цАМФ-зависимый путь и поэтому может являться важным регулятором деструкции соединительной ткани, наблюдаемой при хронических воспалительных заболеваниях.
ИЛ-12 представляет собой гетеродимерный белок массой 70 кДа, состоящий из двух ковалентно связанных цепей массой 35 кДа и 40 кДа. Он вырабатывается главным образом антигенпредставляющими клетками, такими как макрофаги, в начале воспалительного каскада. Внутриклеточные бактерии стимулируют выработку высоких уровней ИЛ-12. Он является мощным индуктором выработки γ-ИФН и активатором естественных клеток-киллеров. ИЛ-12 является одним из ключевых цитокинов, необходимых для клеточно-опосредованных, или Th1 (Т-хэлперные клетки 1 класса), иммунных ответов, главным образом вследствие его способности стимулировать клетки к высокой выработке γ-ИФН (8). ИЛ-12 индуцирует выработку ИЛ-10, который подавляет по принципу обратной связи выработку ИЛ-12, таким образом ограничивая неконтролируемую выработку цитокина. TGF-β (трансформирующий фактор роста бета) также осуществляет понижающую регуляцию выработки ИЛ-12. ИЛ-4 и ИЛ-13 могут оказывать стимулирующее или подавляющее воздействия на выработку ИЛ-12. Подавление ИЛ-12 in vivo может иметь некоторое терапевтическое значение при лечении воспалительных заболеваний, связанных с Th1, таких как рассеянный склероз (9).
Интерферон-гамма, γ-ИФН, главным образом является продуктом активированных Т-лимфоцитов и вследствие изменчивого гликозилирования может иметь размер в пределах от 20 до 25 кДа. Этот цитокин проявляет синергизм с другими цитокинами, приводя к более мощной стимуляции моноцитов, макрофагов, нейтрофилов и эндотелиальных клеток. γ-ИФН также усиливает липополисахаридную (ЛПС) индукцию моноцитов и макрофагов посредством усиления выработки цитокинов (10), повышенное высвобождение активных промежуточных соединений, фагоцитоз и цитотоксичность. γ-ИФН вызывает или усиливает экспрессию антигенов главного комплекса гистосовместимости класса II (МНС класса II) на моноцитарных клетках и клетках эпителиального, эндотелиального происхождения и происхождения из соединительной ткани. Это предусматривает большее представление антигена из клеток в воспаленных тканях иммунной системы. γ-ИФН также может обладать противовоспалительными действиями. Этот цитокин подавляет фосфолипазу A2, таким образом снижая выработку моноцитами ПГЕ2 и коллагеназы (11). γ-ИФН также может модулировать экспрессию рецепторов моноцитов и макрофагов для TGF-β, ФНО-α и С5а (11), таким образом внося вклад с противовоспалительную природу этого цитокина. Пробиотическая стимуляция этого цитокина будет иметь различные эффекты in vivo в зависимости от текущего воспалительного состояния организма-хозяина, стимуляции других цитокинов и пути введения.
ФНО-α является провоспалительным цитокином, который опосредует многие из местных и системных эффектов, наблюдаемых при воспалительной реакции. Этот цитокин является, главным образом, продуктом моноцитов и макрофагов, но и другие виды клеток, включая лимфоциты, нейтрофилы, NK-клетки (естественные клетки-киллеры), тучные клетки, астроциты, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки и гладкомышечные клетки, также могут синтезировать ФНО-α. ФНО-α синтезируется в виде прогормона, и может наблюдаться последующий процессинг до зрелых видов массой 17,5 кДа. Очищенный ФНО-α наблюдали в виде димеров, тримеров и пентамеров, при этом считается, что тримерная форма является активной формой in vivo. Для ФНО-α установлены три рецептора. Растворимый рецептор, по-видимому, функционирует как ингибитор ФНО-α (12); в то же время установлены две мембранно-связанные формы с молекулярной массой 60 и 80 кДа соответственно. Локальная выработка ФНО-α в воспалительных участках может быть вызвана эндотоксином, а глюкокортикоид дексаметазон подавляет выработку цитокина (13). Выработка ФНО-α приводит к стимуляции многих типов клеток. Значительные противовирусные эффекты можно было наблюдать в клеточных линиях, обработанных ФНО-α (14), а интерфероны проявляют синергизм с ФНО-α, усиливая этот эффект. Эндотелиальные клетки стимулируют для получения прокоагулирующей активности, экспрессии молекул адгезии, ИЛ-1, гемопоэтических факторов роста, фактора активации тромбоцитов (ФАТ) и метаболитов арахидоновой кислоты. ФНО-α стимулирует адгезию нейтрофилов, фагоцитоз, дегрануляцию (15), выработку активных промежуточных соединений кислорода и может влиять на миграцию клеток. Синтез GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора), TGF-β, ИЛ-1, ИЛ-6, ПГЕ2 и самого ФНО-α лейкоцитами может быть стимулирован при введении ФНО-α (16, 17). Запрограммированная гибель клеток (апоптоз) может быть замедлена у моноцитов (18), в то время как эффекты на фибробласты включают в себя активацию хемоткасиса и синтез ИЛ-6, ПГЕ2 и коллагеназы. В то время как локальная выработка ФНО-α активизирует заживление ран и иммунные ответы, нерегулируемое системное высвобождение ФНО-α может быть сильно токсичным, при этом наблюдаются такие эффекты как кахексия, лихорадка и выработка белков острой фазы (19).
Изобретение будет более понятно из следующих примеров.
Пример 1: Характеристика бактерий, выделенных из резецированного и промытого желудочно-кишечного тракта человека. Демонстрация пробиотических свойств
Выделение пробиотических бактерий
Проводили скрининг пробиотических бактериальных штаммов из аппендиксов и участков толстой и тонкой кишки желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) человека, полученных при реконструктивных операциях. Все образцы непосредственно после операции закладывали на хранение при -80°С в стерильных контейнерах.
Замороженные ткани размораживали, взвешивали и помещали в раствор Рингера с четырехкратным разведением, содержащий цистеин (0,05%). Образец осторожно встряхивали для удаления слабо прилипающих микроорганизмов (называется: промывка, "W" (wash)). После переноса во вторую порцию раствора Рингера образец встряхивали в течение 7 минут для удаления плотно прилипающих бактерий (называется: образец, "S" (sample)). Для того чтобы выделить бактерии, внедренные в ткани, образцы 356, 176 и А также гомогенизировали в измельчителе Braun (называется: гомогенат, "Н" (honogenate)). Растворы серийно разводили и рассевали на чашки (100 мкл) на следующие агаризованные среды: RCM (усиленные среды для выращивания клостридий, reinforced clostridia media) и RCM с рН, доведенным до 5,5 уксусной кислотой; TPY (триптиказа, пептон и дрожжевой экстракт); MRS (среда де Манн, Рогоза и Шарпа (deMann, Rogosa и Sharpe)); ROG (ацетатная среда (SL) Rogosa); LLA (печеночно-лактозный агар Лапьера (Lapiere)); BHI (агар с инфузией сердечно-мозгового экстракта); LBS (агар, селективный для Bifidobacterium) и TSAYE (триптон, соя, сахароза с добавлением 0,6% дрожжевого экстракта). TPY- и MRS-агар с добавлением пропионовой кислоты также использовали. Все агаризованные среды, за исключением TPY-агара, были предоставлены Oxoid Chemicals. Чашки инкубировали в анаэростатах (BBL, Oxoid) с использованием комплектов, генерирующих CO2 (Anaerocult A, Merck), в течение 2-5 дней при 37°С.
Грамположительные, каталазоотрицательные палочковидные или разветвленные/плеоморфные бактериальные изоляты засевали штриховкой для достижения чистоты на комплексные неселективные среды (MRS и TPY). Если не оговорено особо, изоляты культивировали в стандартным способом на среде MRS или TPY при 37°С в анаэробных условиях. Презумптивные Lactobacillus помещали в 40% глицерин и хранили при -20°С и -80°С.
Проводили скрининг среди семи участков тканей, взятых из ЖКТ, на наличие штаммов, принадлежащих к роду Lactobacillus. Между образцами тканей имелись некоторые различия. Таблица 1, приведенная ниже, показывает число бактерий в образцах тканей, выраженную в колониеобразующих единицах на грамм ткани (КОЕ/мл) (ND - не определяли).
| Таблица 1 | |||||||
| №образца ткани | |||||||
| Среда для выделения | A | 176 | 356 | 312 | 316 | 423 | 433 |
| Раствор «промывки» | |||||||
| MRS | 57×102 | >9,0×103 | 3,3×103 | >3,0×104 | 0 | 3,2×103 | 8,0×102 |
| TPYP | 0 | >9,0×103 | >6,0×103 | >3,0×104 | 0 | 1,9×102 | 2,8×102 |
| RCM 5,5 | 0 | 0 | 3,1×102 | 1,8×104 | ND | 3,0×101 | 8,0×102 |
| ROG | 0 | >9,0×103 | >6,0×103 | 7,7×102 | 3,8×102 | 9,7×101 | 4,0×101 |
| TSAYE | 3,9×102 | >9,0×103 | >6,0×103 | ND | ND | ND | ND |
| LLA | 2,5×102 | >9,0×103 | >6,0×103 | ND | 5,3×102 | ND | ND |
| RCM | ND | ND | ND | >3,0×104 | ND | 4,8×103 | 4,6×103 |
| Раствор «образца» | |||||||
| MRS | 1,35×103 | >9,0×103 | >6,0×103 | 1,66×104 | 2,3×102 | >1,0×104 | 9,6×102 |
| TPYP | 0 | >9,0×103 | >6,0×103 | >3,0×104 | 4,6×102 | 0 | 8,0×103 |
| RCM 5,5 | 0 | >9,0×103 | >6,0×103 | 1,7×103 | ND | 1,1×103 | 1,5×103 |
| ROG | 1,37×102 | >9,0×103 | >6,0×103 | 4,4×102 | 4,5×103 | 1,7×103 | 6,1×103 |
| TSAYE | 1,4×103 | >9,0×103 | ND | ND | ND | ND | ND |
| LLA | 6,3×102 | >9,0×103 | >6,0×103 | ND | 3,0×102 | ND | ND |
| RCM | ND | ND | ND | >3,0×104 | ND | >1,0×104 | ND |
| Раствор «гомогената» | |||||||
| MRS | 0 | 0 | >6,0×103 | ||||
| TPYP | 0 | 0 | >6,0×103 | ||||
| RCM 5,5 | 0 | 0 | 2,5 ×102 | ||||
| ROG | 0 | 0 | >6,0×103 | ||||
| TSAYE | 3,9×101 | 0 | >6,0×103 | ||||
| LLA | 1,9×101 | 6,57×102 | >6,0×103 | ||||
| RCM | 0 | 0 | ND |
Образцы А (подвздошная кишка) и 316 (аппендикс) обладали самой низкой численностью клеток, приблизительно 102 выделенных клеток на грамм ткани. Для сравнения, более 103 КОЕ/г ткани выделили из других образцов. Сходное число бактерий выделили во время этапов "промывка" и "образец", причем несколько большая численность была в растворах "образец" 433 (подвздошная кишка-слепая кишка).
Характеристики брожения и роста
Метаболизм углевода глюкозы и получающихся в качестве конечных продуктов органических кислот исследовали, используя колонку для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) Aminex HPX-87H, LKB Bromma. Колонку поддерживали в рабочем состоянии при 60°С со скоростью протока 0,6 мл/мин (постоянное давление). Используемый для ВЭЖХ буферный раствор представлял собой 0,01 н. H2SO4. Перед анализом колонку калибровали, используя 10 мМ цитрат, 10 мМ глюкозу, 20 мМ лактат и 10 мМ ацетат в качестве стандартов. Культуры размножали питательной среде MRS в течение 1-2 дней при 37°С в анаэробных условиях. После центрифугирования в течение 10 минут при 14000g супернатант разбавляли 1:5 буферным раствором для ВЭЖХ и 200 мкл анализировали с помощью ВЭЖХ. Все супернатанты анализировали в двукратной повторности.
Для облегчения идентификации определяли биохимические и физиологические свойства бактериальных изолятов. Анализировали восстановление нитратов, образование индола и экспрессию β-галактозидазы. Определяли рост как при 15°С, так и при 45°С, рост в присутствии концентраций NaCl, повышающихся до 5,0%, и протеазную активность в отношении желатина. Также оценивали характеристики роста штаммов на бактериологической среде с индикатором рН.
Приблизительно полторы тысячи каталазоотрицательных бактериальных изолятов из различных образцов было отобрано и охарактеризовано в отношении их реакции по Граму, размера клеток и морфологии, роста при 15°С и 45°С и конечных продуктов сбраживания глюкозы (данные не показаны). Более 60 процентов протестированных изолятов были грамположительными, гомоферментативными кокками (ГОМО-), сгруппированных тетрадами, цепочками или гроздями. 18 процентов изолятов были грамотрицательными палочками и гетероферментативными коккобациллами (ГЕТЕРО-). Остальные изоляты (22 процента) были в основном гомоферментативными коккобациллами. 38 штаммов были охарактеризованы более подробно: 13 изолятов из 433; 4 из 423; 8 из 312; 9 из 356; 3 из 176 и 1 из 316. Все 38 изолятов, которые были протестированы, были отрицательными как в отношении восстановления нитратов, так и в отношении образования индола из триптофана. Рост при разных температурах, концентрациях NaCl и гидролиз желатина представлены ниже в Таблице 2.
| Таблица 2 | ||||||||
| Штамм | Источник | Характер брожения | Температурные профили | % NaCl* | Гидролиз желатина | Реакция в бактериологич. среде с индикатором рН | ||
| 15°С | 45°С | рН** | REDn | |||||
| АН102 | S1 ROG | ГОМО- | +(s) | - | 3,0 | - | 6,3 | NR |
| АН103 | S1 RCM 5,5 | ГЕТЕРО- | - | - | 3,0 | - | 5,2 | RpCp |
| АН105 | S1 MRSP | ГОМО- | - | - | 0,8 | - | 4,9 | RpCp |
| АН109 | S1 TPY | ГОМО- | - | - | 5,0 | - | 6,0 | NR |
| АН110 | S1 ROG | ГОМО- | - | - | 5,0 | - | 4,9 | RpCp |
ГОМО- - гомоферментативный; ГЕТЕРО- - гетероферментативный;
- - негативные в отношении реакции/роста; + - положительная реакция/рост; +(s) - медленный рост; REDn - восстановление; NR - отсутствие реакции; Rp - частичное восстановление; Ср - частичное свертывание;
* Максимальная концентрация NaCl, в которой штамм будет расти;
** рН после 24 часов инкубирования в бактериологической среде с индикатором рН при 37°С.
Идентификация видов
Систему API 50CHL (BioMerieux SA, Франция) использовали для предварительной идентификации видов Lactobacillus по их профилям сбраживания углеводов. Культуры, выращенные в течение ночи на среде MRS собирали посредством центрифугирования и ресуспендировали в суспензионной среде, предусмотренной в наборе. Наносили на полоски API и анализировали их (через 24 и 48 часов) согласно инструкциям производителя. Затем проверяли идентичность Lactobacillus sp. посредством электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) общего клеточного белка (Бруно Пот, Университет Гента, Бельгия, личные контакты). Наконец, использовали анализ 16s РНК и риботипирование для подтверждения идентичности штаммов.
API 50CHL позволила провести быструю идентификацию изолятов Lactobacillus. Анализ общего клеточного белка Lactobacillus sp. (Бруно Пот, личный контакт) посредством ДСН-ПААГ, анализ 16s РНК и риботипирование дали дополнительную информацию о конкретных видах. Таблица 3, приведенная ниже, показывает идентификацию 5 штаммов Lactobacillus посредством четырех различных методик.
| Таблица 3 | ||||
| Штамм | Профили сбраживания сахаров | Общий клеточный белок (ДСН-ПААГ)* | Идентификация 16s PHK | Риботипирование |
| АН102 | L. salivarius | L. salivarius subsp. salivarius | L. salivarius | L. salivarius subsp. salicinius |
| АН103 | L. salivarius | L. salivarius subsp. salivarius | L salivarius | L. salivarius subsp. salicinius |
| АН105 | L. salivarius | L. paracasei subsp. paracasei | L. salivarius | L. salivarius |
| АН109 | L. salivarius | L. salivarius subsp. salivarius | L. salivarius | L. salivarius subsp. salicinius |
| АН110 | L. salivarius | L. salivarius subsp. salivarius | L salivarius | L. salivarius subsp. salicinius |
Профили активности ферментов
Систему API ZYM (BioMerieux, Франция) использовали для полуколичественного измерения конститутивных ферментов, вырабатываемых изолятами Lactobacillus. Бактериальные клетки в поздней фазе логарифмического роста собирали посредством центрифугирования при 14000 g в течение 10 минут. Осажденные центрифугированием клетки промывали и ресуспендировали в 50 мМ фосфатного буфера с рН 6,8 до одинаковой оптической плотности. Наносили на полоски API согласно инструкциям производителя, инкубировали их в течение 4 часов при 37°С и регистрировали изменение цвета.
Профили активности ферментов 5 штаммов: АН102, АН103, АН105, АН109, АН110 представлены ниже в Таблице 4. Ни один из штаммов не проявил активности липазы, трипсина, α-химотрипсина, α-глюкуронидазы, α-маннозидазы или α-фукозидазы.
| Таблица 4 | |||||
| АН102 | АН103 | АН105 | АН109 | АН110 | |
| Щелочной фосфат | 3 | 3 | 4 | 3 | 3 |
| Эстераза | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Эстераза-Липаза | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Липаза | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Лейцин-ариламидаза | 4 | 3 | 4 | 3 | 3 |
| Валин-ариламидаза | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Цистин-ариламидаза | 5 | 5 | 4 | 4 | 5 |
| Трипсин | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| α-Химотрипсин | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Кислый фосфат | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| Фосфогидролаза | 5 | 5 | 4 | 4 | 5 |
| α-Галактозидаза | 0 | 3 | 4 | 3 | 3 |
| β-Галактозидаза | 3 | 4 | 4 | 5 | 4 |
| β-Глюкуронидаза | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| α-Глюкозидаза | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| β-Глюкозидаза | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| α-Глюкозаминидаза | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| α-Маннозидаза | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| α-Фукозидаза | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Профили чувствительности к антибиотикам
Профили чувствительности изолятов к антибиотикам определяли, используя анализ "чувствительности к дискам". Культуры выращивали на соответствующей питательной среде в течение 24-48 часов, рассевали газоном на чашки (100 мкл) с агаризованными средами и на агар помещали диски, содержащие известные концентрации антибиотиков. Штаммы изучали на чувствительность к антибиотикам после 1-2 дней инкубирования при 37°С в анаэробных условиях. Штаммы считали чувствительными, если наблюдали зоны подавления роста 1 мм и более.
Использовали клинически важные для человека антибиотики для установления профилей чувствительности каждого из 5 штаммов Lactobacillus. Каждая из протестированных лактобацилл была чувствительной к ампициллину, амоксациллину, цефтаксиму (ceftaxime), цефтриаксону, ципрофлоксацину, цефрадину, рифампицину и хлорамфениколу. Чувствительность к антибиотикам (мкг/мл (ug/ml)) Lactobacillus salivarius АН102, АН103, АН105, АН109 и АН110 дана в Таблице 5, приведенной ниже.
| Таблица 5 | |||||
| АН102 | АН103 | АН105 | AH109 | AH110 | |
| NET 10 | R | R | R | R | S |
| AMP 25 | S | S | S | S | S |
| АМС 30 | S | S | S | S | S |
| АК 30 | R | R | R | R | S |
| W 1,25 | R | R | R | R | R |
| TEC 30 | R | S | S | R | R |
| СХМ 30 | S | S | S | S | S |
| СТХ 30 | S | S | S | S | S |
| ZOX 30 | S | S | S | S | R |
| CRO 30 | S | S | S | S | S |
| CIP 5 | S | S | S | S | S |
| CN 10 | R | R | R | R | S |
| MTZ 5 | R | R | R | R | R |
| СЕ 30 | S | S | S | S | S |
| RD 5 | S | S | S | S | S |
| V 5 | R | ND | S | R | R |
| C 10 | S | ND | S | S | S |
| ТЕ 10 | S | ND | S | S | S |
| Е 5 | S | ND | S | S | S |
| NA 30 | R | R | R | R | R |
| R - устойчивые; S - чувствительные; ND - не определяли. |
Рост лактобацилл при низком рН
Желудочный сок человека получали от здоровых субъектов посредством аспирации через назогастральную трубку (Mercy Hospital, Cork, Ирландия). Его сразу же центрифугировали при 13000 g в течение 30 минут для удаления всех твердых частиц, стерилизовали через фильтры с размером пор 0,45 мкм и 0,2 мкм и разделяли на аликвоты по 40 мл, которые хранили при 4°С и -20°С.
рН и активность пепсина в образцах измеряли перед экспериментальным использованием. Активность пепсина измеряли, используя количественный анализ гемоглобина. Вкратце, аликвоты желудочного сока (1 мл) добавляли к 5 мл субстрата (0,7 М мочевина, 0,4% (мас./об.) бычьего гемоглобина (Sigma Chemical Co.), 0,25 М KCl-HCl буфер, рН 2,0) и инкубировали при 25°С. Образцы отбирали через интервалы 0, 2, 4, 6, 8, 10, 20 и 30 минут. Реакции заканчивали посредством добавления 5% трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и давали отстояться в течение 30 минут без перемешивания. Смеси для анализа затем фильтровали (Whatman, №113), центрифугировали при 14000 g в течение 15 минут и измеряли оптическую плотность при 280 нм. За одну единицу ферментативной активности пепсина брали количество фермента, необходимое, чтобы вызвать увеличение на 0,001 единиц А280 нм в минуту при рН 2,0, измеренное в виде растворимых в ТХУ продуктов с использованием гемоглобина в качестве субстрата.
Для того чтобы определить, эквивалентен ли рост штаммов Lactobacillus при низких значениях рН, росту, обнаруженному в желудке, культуры, выращенные в течение ночи, засевали (1%) в свежую питательную среду MRS с рН, доведенным до 4,0; 3,0; 2,0 и 1,0 с помощью 1 н. HCl. Через одинаковые промежутки времени отбирали аликвоты (1,5 мл), измеряли оптическую плотность при 600 нм (OD600) и подсчитывали число колониеобразующих единиц на мл (КОЕ/мл), используя чашечный метод подсчета. Рост проверяли через 24-48-часовой период.
Выживание штаммов при низком рН in vitro изучали, используя два анализа:
а) Клетки собирали из свежих культур, выращенных в течение ночи, дважды промывали фосфатным буфером (рН 6,5) и ресуспендировали в питательной среде MRS с рН, доведенным до 3,5; 3,0; 2,5 и 2,0 (при помощи 1 н. HCI) до конечной концентрации лактобацилл приблизительно 108 КОЕ/мл. Клетки инкубировали при 37°С и выживание оценивали через интервалы 5, 30, 60 и 120 минут, используя чашечный метод подсчета.
б) Штаммы Lactobacillus ежедневно размножали на забуференной питательной среде MRS (рН 6,0) в течение 5 дней. Клетки отделяли, промывали и ресуспендировали в питательной среде MRS с доведенным рН, и выживание оценивали в течение 2 часов, используя чашечный метод подсчета.
Для того чтобы определить способность лактобацилл выживать при проходе через желудок, проводили исследование ex-vivo, используя желудочный сок человека. Получали клетки из свежих культур, выращенных в течение ночи, дважды промывали буфером (рН 6,5) и ресуспендировали в желудочном соке человека до конечной концентрации 106-108 КОЕ/мл, в зависимости от штамма. Выживание оценивали в течение периода инкубирования 30-60 минут при 37°С. Эксперимент проводили, используя желудочный сок с рН˜1,2 (без доведения) и с рН=2,0 и 2,5.
Каждый из протестированных штаммов Lactobacillus нормально рос при рН 6,8 и рН 4,5, достигая стационарной фазы через 8 часов, со временем удвоения 80-100 минут. При рН 3,5 рост был ограничен, со временем удвоения, возросшим до 6-8 часов. Не наблюдали роста при рН 2,5 и ниже, поэтому изучали выживание штаммов при низких рН.
Каждый из штаммов, как правило, был устойчив к значениям рН 3,5; 3,0 и 2,5, а штаммы Lactobacillus salivarius AH102 и АН105 также проявляли устойчивость при рН 2,0 (данные не показаны).
Для того чтобы определить способность штаммов Lactobacillus выживать в условиях, соответствующих условиям в желудке человека, проверяли жизнеспособность каждого из 5 штаммов в желудочном соке человека при рН 1,2 и рН 2,5, как показано ниже в Таблице 6. Жизнеспособность выражена в log10 КОЕ/мл (nd - не определяли).
| Таблица 6 | |||||
| Штамм Lactobacillus sp. | рН | Время (мин) | |||
| 0 | 5 | 30 | 60 | ||
| AH102 | 1,2 | 9,16 | 8,84 | 6,81 | nd |
| 2,5 | 9,49 | 9,34 | 9,53 | 9,25 | |
| АН 103 | 1,2 | 9,17 | 8,77 | 3,30 | nd |
| 2,5 | 9,73 | 9,71 | 9,50 | 9,44 | |
| АН105 | 1,2 | 9,38 | 9,00 | 5,87 | nd |
| 2,5 | 9,69 | 9,49 | 9,62 | 9,51 | |
| АН 109 | 1,2 | 9,79 | 8,71 | 4,20 | nd |
| 2,5 | 9,76 | 9,59 | 9,68 | 9,72 | |
| АН110 | 1,2 | 9,49 | 8,84 | 6,81 | nd |
| 2,5 | 9,77 | 9,65 | 9,39 | 9,59 |
Рост культур в присутствии желчи
Свежие культуры рассевали штрихом на чашки с MRS-агаром с добавлением бычьей желчи (В-8381, Sigma Chemical Co. Ltd., Poole) в концентрациях 0,3; 1,0; 1,5; 5,0 и 7,5% (мас./об.) и свиной желчи (В-8631, Sigma Chemical Co. Ltd., Poole) в концентрациях 0,3; 0,5; 1,0; 1,5; 5,0 и 7,5% (мас./об.). Чашки инкубировали при 37°С в анаэробных условиях и регистрировали рост через 24-48 часов.
Образцы желчи, полученные из нескольких желчных пузырей людей, хранили при -80°С до использования. Для экспериментальной работы образцы желчи размораживали, объединяли и стерилизовали при 80°С в течение 10 минут. Состав желчных кислот желчи человека определяли, используя высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) с обращенной фазой в сочетании с импульсным амперометрическим детектором по способу, описанному Dekker et al. (21). Желчь человека добавляли к агаризованной среде MRS/TPY в концентрации 0,3% (об./об.). Изучали рост свежепосеянных штрихом культур через 24 и 48 часов.
Желчь из желчного пузыря человека имеет концентрацию желчных кислот 50-100 мМ, а разбавление в тонкой кишке снижает эту концентрацию до 5-10 мМ. Кроме того, в физиологических условиях желчные кислоты обнаружены в виде солей натрия, следовательно, проводили скрининг культур, способных расти на чашках с MRS-агаром, содержащих натриевую соль каждой из следующих желчных кислот (Sigma Chemical Co. Ltd., Poole):
а) конъюгированная форма: таурохолевая кислота (ТСА); гликохолевая кислота (GCA); тауродезоксихолевая кислота (TDCA); гликодезоксихолевая кислота (GDCA); таурохенодезоксихолевая кислота (TCDCA) и гликохенодезоксихолевая кислота (GCDCA);
б) неконъюгированная форма: литохолевая кислота (LCA); хенодезоксихолевая кислота (CDCA); дезоксихолевая кислота (DCA) и холевая кислота (СА). Использовали концентрации каждой желчной кислоты 1, 3 и 5 мМ. Рост регистрировали через 24 и 48 часов инкубирования в анаэробных условиях.
Использовали как качественный (агаровые чашки), так и количественный (ВЭЖХ) анализ для определения активности деконъюгации.
Анализ чашек: Все культуры рассевали штрихом на чашки с MRS-агаром с добавлением: а) 0,3% (мас./об.) свиной желчи, б) 3 мМ TDCA или в) 3 мМ GDCA. Деконъюгацию наблюдали в виде непрозрачного осадка, окружающего колонии.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ): Анализ деконъюгации желчи человека in vitro проводили, используя ВЭЖХ. Вкратце, культуры, выращенные в течение ночи, засевали (5%) в питательную среду MRS с добавлением 0,3% (об./об.) желчи человека и инкубировали в анаэробных условиях при 37°С. В различные интервалы времени в течение 24-часового периода образцы (1 мл) отбирали и центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 минут. Неразбавленный, освобожденный от клеток супернатант (30 мкл) анализировали затем посредством ВЭЖХ.
Lactobacillus salivarius АН102, АН103, АН105, АН109 и АН110 были способны расти (устойчивые к желчным кислотам) на трех использованных источниках желчи. Наблюдали, что устойчивость к бычьей желчи была выше, чем к свиной желчи. Каждый из протестированных штаммов Lactobacillus был устойчив к концентрациям бычьей желчи вплоть до 5,0% включительно (данные не показаны).
Свиная желчь в большей степени подавляла рост, как показано ниже в Таблице 7.
| Таблица 7 | |||||||
| Штамм Lactobacillus sp. | % (мас./об.) свиной желчи | ||||||
| 0,0 | 0,3 | 0,5 | 1,0 | 1,5 | 5,0 | 7,5 | |
| АН102 | + | + | - | - | - | - | - |
| АН103 | + | + | + | - | - | - | - |
| АН105 | + | + | - | - | - | - | - |
| АН109 | + | + | - | - | - | - | - |
| АН110 | + | + | - | - | - | - | - |
Несмотря на профили устойчивости к желчи в присутствии бычьей и свиной желчи, каждый из штаммов Lactobacillus salivarius давал сплошной рост при физиологических концентрациях 0,3% (об./об.) желчи человека (данные не показаны).
При анализе на устойчивость конкретно к индивидуальным желчным кислотам каждый из штаммов Lactobacillus хорошо рос в присутствии желчных кислот, конъюгированных с таурином. Изоляты из каждого штамма Lactobacillus давали сплошной рост на агаризованной среде, содержащей вплоть до 5 мМ, включительно, тауриновых конъюгатов ТСА, TDCA и TCDCA. Из протестированных глициновых конъюгатов GCDCA оказывала наибольшее подавляющее воздействие. GDCA оказывала меньшее подавляющее воздействие, a GCA оказывала наименьшее подавляющее воздействие из трех глициновых конъюгатов. Каждый из штаммов Lactobacillus рос на агаризованной среде с добавлением 5 мМ GCA. Это показано в Таблице 8, приведенной ниже.
| Таблица 8 | ||||||||||||
| Штамм Lactobacillus sp. | Желчные кислоты (мМ) | |||||||||||
| GCDCA | GDCA | GCA | ||||||||||
| 0 | 1 | 3 | 5 | 0 | 1 | 3 | 5 | 0 | 1 | 3 | 5 | |
| АН102 | + | + | - | - | + | + | - | - | + | + | + | + |
| АН103 | + | + | - | - | + | + | - | - | + | + | + | + |
| АН105 | + | + | - | - | + | + | + | - | + | + | + | + |
| АН109 | + | + | - | - | + | + | - | - | + | + | + | + |
| АН110 | + | + | - | - | + | + | - | - | + | + | + | + |
- - нет роста; + - сплошной рост.
Также тестировали рост в присутствии неконъюгированных желчных кислот. Каждый штамм Lactobacillus был устойчив к концентрациям 5 мМ LCA. Также тестировали рост в присутствии СА. Как показано в Таблице 9, приведенной ниже, три из пяти штаммов, АН102, АН105 и АН109, росли в присутствии 1 мМ СА. Ни один из штаммов не рос в присутствии 1 мМ CDCA (данные не показаны).
| Таблица 9 | ||||
| Штамм | Холевая кислота (мМ) | |||
| 0 | 1 | 3 | 5 | |
| Lactobacillus sp. АН102 | + | + | - | - |
| АН103 | + | - | - | - |
| АН105 | + | + | - | - |
| АН109 | + | + | - | - |
| АН110 | + | - | - | - |
Исследование противомикробной активности
Противомикробную активность определяли, используя замедленный способ (21). Индикаторами, использованными в начальном скрининге, являлись L. innocua, L. fermentum KLD, P. fluorescens и E.coli V157. Вкратце, лактобациллы (MRS) инкубировали в течение 12-16 часов и 36-48 часов, соответственно. Десятикратные серийные разведения рассевали газоном на пластинки (100 мкл) на агаризованную среду MRS/TPY. После инкубирования в течение ночи на пластинки с отдельными колониями вносили сверху слой индикаторных бактерий. Индикаторный газон получали посредством инокуляции 2% (об./об.) индикаторной культуры, выращенной в течение ночи, в расплавленный слой для покрытия, и этот газон выливали на поверхность засеянных пластинок MRS. Пластинки повторно инкубировали в течение ночи в условиях, подходящих для роста индикаторных бактерий. Индикаторные культуры с зонами подавления роста с радиусом больше чем 1 мм считали чувствительными к тест-бактерии.
Исключали ингибирование из-за активности бактериофага посредством переворачивания засеянных пластинок MRS/TPY-агара вверх дном и покрытием сверху слоем индикатора. Бактериофаг не может диффундировать через агар.
Скрининг штаммов Lactobacillus salivarius AH102, АН103, АН105, АН109 и АН110 на ингибиторную активность проводили, используя Ls. innocua, L. fermentum KLD, P. fluorescens и E.coli в качестве индикаторных микроорганизмов. Когда тестируемые штаммы высевали на незабуференную MRS, наблюдали ингибирование указанных четырех индикаторов. Измеряли зоны с размерами в пределах от 1 мм до 5 мм. Ингибирование Ls. innocua каждой из лактобацилл давало наибольшие зоны.
Пример 2: Адгезия пробиотических бактерий на эпителиальных клетках желудочно-кишечного тракта
Адгезию пробиотических штаммов проводили, применяя модифицированную версию ранее описанного способа (22). Монослои клеток НТ-29 и Сасо-2 готовили на стерильных покровных стеклах размером 22 мм2, которые помещали на чашки для культивирования ткани Корнинга в концентрации 4×104 клеток/мл. Клетки подпитывали свежей средой каждые 2 дня. Примерно через 10 дней и после того как происходила дифференцировка монослоя, монослои дважды промывали фосфатным буферным раствором (PBS). DMEM (модифицированную по способу Дульбекко среду Игла), не содержащую антибиотик (2 мл), и 2 мл примерно 18-часовой суспензии Lb., содержащей ˜109 КОЕ/мл, добавляли к каждой чашке и клетки инкубировали в течение 2 часов при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2. После инкубирования монослои 5 раз промывали PBS, фиксировали в метаноле (BDH Laboratory Supplies, Poole, Великобритания) в течение 3 минут, окрашивали по Граму (Gram Stain Set, Merck) и исследовали под микроскопом под имерсионным маслом. Для каждого монослоя на покровном стекле подсчитывали количество прилипающих бактерий на 20 эпителиальных клеток в 10 полях зрения микроскопа. Рассчитывали среднее значение и среднеквадратическую ошибку для прилипающих бактерий на 20 эпителиальных клеток. Анализ каждой адгезии проводили в двукратной повторности.
Во втором способе после пятикратного промывания в PBS прилипшие бактерии отделяли посредством энергичного перемешивания монослоев в холодной стерильной Н2О. Бактериальные клетки подсчитывали посредством серийного разведения в растворе Рингера с четырехкратным разведением (Oxoid) и инкубирования на MRS (лактобациллы).
Каждый из 5 штаммов Lactobacillus AH102, АН103, АН105, АН109 и АН110 прилипал к эпителиальным клеткам желудочно-кишечного тракта (Фигура 1). Эти пробиотические штаммы можно применять в качестве носителей для доставки вакцины/лекарственного средства, поскольку они прилипают к эпителию желудочно-кишечного тракта и, таким образом, взаимодействуют с соответствующими тканями организма-хозяина.
Пример 3: Определение воздействия каждого из штаммов Lactobacillus на выработку цитокинов РВМС
Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) получали от здоровых доноров (n=19) посредством центрифугирования в градиенте плотности. РВМС стимулировали указанными пробиотическими бактериальными штаммами в течение 72 часов при 37°С. В это время супернатанты культур собирали, центрифугировали, делили на аликвоты и хранили при -70°С до оценки уровней ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12 и γ-ИФН с помощью иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA) (Boehringer Mannheim).
АН102, АН103 и АН105 стимулировали выработку γ-ИФН клетками РВМС (Фиг.2).
Совместное инкубирование АН102, АН103, АН109 и АН110 не изменяло значительно уровни ИЛ-10 (Фиг.3). Стимуляция АН105 значительно снижала секрецию ИЛ-10 клетками РВМС.
Совместное инкубирование АН102, АН105, АН109 и АН110 приводило к значительной повышающей регуляции выработки ИЛ-12 РВМС (Фиг.4). АН103 не оказывал значительного воздействия на выработку ИЛ-12.
Ни один из 5 штаммов Lactobacillus не стимулировал выработку ИЛ-8 in vitro клетками РВМС, полученными от здоровых доноров. Действительно, в каждом случае уровни ИЛ-8 снижались (Фиг.5).
Пример 4: Определение уровней цитокинов в модели совместных культур эпителиальных/ РВМС клеток после инкубирования с АН103 и АН110
Подходящая in vitro модель с физиологическим соответствием кишечному тракту представляет собой систему культур, объединяющую эпителиальные клетки, Т-клетки, В-клетки, моноциты и бактериальные штаммы. С этой целью эпителиальные клетки человека Сасо-2 высевали в концентрации 5×105 клеток/мл на верхушечную поверхность 25 миллиметровых вставок Transwell с размером пор 3 мкм (Costar). Эти клетки культивировали в течение четырех недель в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, глутамина, пенициллина и стрептомицина при 37°С в атмосфере, содержащей 5% CO2. Культуральные среды заменяли каждые 3 дня. Когда эпителиальные клетки были полностью дифференцированы, периферические мононуклеарные клетки крови человека (РВМС) выделяли посредством центрифугирования в градиенте плотности. 1×106 промытых РВМС инкубировали базолатерально к эпителиальным клеткам и культивировали с 1×107 пробиотических бактерий. Контроли содержали только среды. Никакие прямые контакты клетка-клетка между РВМС и эпителиальными клетками невозможны в этой модельной системе, и сообщение между клетками было опосредовано исключительно растворимыми факторами.
После 72 часов инкубирования с АН103 или АН110 супернатанты культур клеток отделяли, делили на аликвоты и хранили при -70°С. Уровни внеклеточного цитокина ФНО-α и ИЛ-8 измеряли, используя стандартные наборы для ELISA (R&D Systems). Уровни ФНО-α измеряли в двукратной повторности, используя РВМС от 3 здоровых добровольцев.
После инкубирования совместных культур эпителиальных клеток-РВМС с пробиотическими бактериями изучали уровни цитокинов ФНО-α и ИЛ-8 при помощи ELISA (Фиг.6). АН103 значительно снижал уровень ИЛ-8, высвобождаемого этими клетками. АН110 снижал уровни ФНО-α и ИЛ-8, высвобождаемых этими клетками.
Иммуномодуляция
Иммунная система человека играет значительную роль в этиологии и патологии широкого ряда заболеваний человека. Гипер- и гипоиммунная реактивность приводит к большинству болезненных состояний или является их составной частью. Одно семейство биологических веществ, называемое цитокинами, является особенно важным для контроля иммунных процессов. Возмущения этих чувствительных цитокиновых сетей все больше связывают со многими заболеваниями. Эти заболевания включают воспалительные заболевания, иммунодефицит, воспалительное заболевание кишечника, синдром раздраженного кишечника, рак (в частности, рак желудочно-кишечной и иммунной систем), диарейное заболевание, диарею, вызванную антибиотиком, диарею у детей, аппендицит, аутоиммунные расстройства, рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, ревматоидный артрит, заболевание брюшной полости, сахарный диабет, трансплантацию органов, бактериальные инфекции, вирусные инфекции, грибковые инфекции, периодонтальное заболевание, заболевание мочеполовых органов, венерическое заболевание, ВИЧ-инфекцию, репликацию ВИЧ, диарею, связанную с ВИЧ, хирургическую травму, метастатическую опухоль, вызванную хирургическим вмешательством, сепсис, потерю веса, анорексию, контроль лихорадки, кахексию, заживление ран, язвы, функцию кишечного барьера, аллергию, астму, респираторные заболевания, нарушения кровообращения, коронарную болезнь сердца, анемию, нарушения системы свертывания крови, заболевание почек, расстройства центральной нервной системы, заболевание печени, ишемию, пищевые расстройства, остеопороз, эндокринные расстройства, эпидермальные заболевания, псориаз и обыкновенные угри, но не ограничиваются ими. Воздействия на выработку цитокинов являются специфичными для каждого из исследованных пробиотических штаммов. Таким образом, для нормализации особого дисбаланса цитокинов, характерного для конкретного типа заболеваний, можно подобрать конкретные пробиотические штаммы. Подбор терапии, специфичной для заболевания, можно осуществлять путем выбора пробиотических штаммов, перечисленных выше.
Иммунное "обучение"
Кишечная флора является важной для развития и правильного функционирования кишечной иммунной системы. В отсутствие кишечной флоры кишечная иммунная система неразвита, как показано в экспериментальных животных моделях, свободных от микроорганизмов, и ухудшаются некоторые функциональные параметры, такие как способность макрофагов к фагоцитозу и выработка иммуноглобулина (24). Важность кишечной флоры при стимулировании неповреждающих иммунных ответов становится все более очевидной. Возрастание случаев возникновения и тяжести аллергии в западном мире связано с повышением гигиены и санитарного контроля, сопровождающихся снижением числа и диапазона инфекционных стимулов, которым подвергается организм-хозяин. Это отсутствие иммунной стимуляции может приводить организм-хозяин к реагированию на непатогенные, но антигенные агенты, давая аллергию или аутоиммунитет. Преднамеренное употребление ряда непатогенных иммуномодулирующих бактерий обеспечивало бы организм-хозяин необходимыми и подходящими «обучающими» стимулами для правильного развития и контроля иммунной функции.
Воспаление
Воспаление - это термин, используемый для описания локального скопления жидкости, белков плазмы и лейкоцитов в месте, которое переносит физическое повреждение, инфекцию или где в настоящее время имеет место иммунный ответ. Контроль воспалительных реакций проявляется на множестве уровней (24). Контролирующие факторы включают цитокины, гормоны (например, гидрокортизон), простагландины, активные промежуточные соединения и лейкотриены. Цитокины представляют собой низкомолекулярные биологически активные белки, которые вовлечены в генерирование и контроль иммунологических и воспалительных реакций, при этом также регулируя развитие, заживление тканей и гемопоэз. Они обеспечивают взаимодействие лейкоцитов друг с другом, а также с другими типами клеток. Большинство лейкоцитов является плейотропным и проявляет разнообразные биологически перекрывающиеся виды активности. Цитокиновые каскады и сети контролируют воспалительную реакцию, а не действие конкретного цитокина на конкретный тип клеток (25). Ослабевание воспалительной реакции имеет в результате понижение концентрации соответствующих активирующих сигналов и других воспалительных медиаторов, приводя к прекращению воспалительной реакции. ФНО-α представляет собой центральный провоспалительный цитокин, так как он инициирует каскад цитокинов и биологические эффекты, приводящие к воспалительному состоянию. Поэтому агенты, которые подавляют ФНО-α, например инфликсимаб (infliximab), в настоящее время используют для лечения воспалительных заболеваний.
Полагают, что провоспалительные цитокины играют главную роль в патогенезе многих воспалительных заболеваний, включая воспалительное заболевание кишечника (ВЗК). Современная терапия для лечения ВЗК нацелена на снижение уровней этих провоспалительных цитокинов, включая ИЛ-8 и ФНО-α. Такая терапия может также играть значительную роль в лечении системных воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит.
Синдром раздраженного кишечника (СРК) является распространенным расстройством желудочно-кишечного тракта, поражающим до 15-20% населения на какой-либо стадии в течение жизни. Наиболее частые симптомы включают боль в животе, расстройство нормальной работы кишечника, выражающееся в диарее или запоре, метеоризм и абдоминальное растяжение. Не существует простых тестов для подтверждения диагноза, и, если при этих симптомах не найти никаких других органических расстройств, обычно ставят диагноз СРК. Пациенты, страдающие СРК, составляют 25-50% пациентов, осматриваемых гастроэнтерологами.
Полагают, что многие факторы вовлечены в появление симптомов, включая, например, приступ гастроэнтерита, абдоминальную или тазовую хирургическую операцию, нарушения в кишечной бактериальной флоре, возможно, в результате приема антибиотиков и эмоциональный стресс. По сравнению с основным населением люди, страдающие СРК, могут иметь значительно более низкий уровень жизни, более вероятно, что они являются безработными и они больше пользуются возможностями здравоохранения. Не существует эффективного медицинского лечения, и до настоящего времени рекомендуемая терапия включала в себя спазмолитические агенты, антидиарейные агенты, пищевые добавки с клетчаткой, лекарственные средства, которые изменяют порог чувствительности висцеральных рецепторов ободочной кишки, анальгетики и антидепрессанты.
Так как каждый из штаммов по изобретению обладает уникальными свойствами в отношении модулирования цитокинов и профилями антагонизации в отношении микробов, следует ожидать, что для применения при специфических болезненных состояниях могут быть выбраны специфичные штаммы на основании этих свойств. Также следует ожидать, что комбинации штаммов из этой панели с соответствующими цитокинмодулирующими свойствами и противомикробными свойствами будут повышать терапевтическую эффективность.
Штаммы по настоящему изобретению могут иметь потенциальное применение при лечении ряда воспалительных заболеваний, особенно при использовании в сочетании с другой противовоспалительной терапией, такой как нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (НСПЛС) или инфликсимаб.
Цитокины и рак
Выработка многофункциональных цитокинов широким спектром типов опухолей означает, что у пациентов с раковой опухолью имеются протекающие значительные воспалительные реакции. В настоящее время неясно, каким защитным действием обладает эта реакция против роста и развития клеток опухоли in vivo. Однако эти воспалительные реакции могут неблагоприятно воздействовать на организм-хозяин, несущий в себе опухоль. Комплексные взаимодействия цитокинов вовлечены в регуляцию выработки цитокинов и пролиферации клеток в опухолевых и нормальных тканях (26, 27). Давно считается, что потеря веса (кахексия) является единственной наиболее распространенной причиной смерти у пациентов с раковой опухолью, и начинающееся недостаточное питание указывает на плохой прогноз. Для того чтобы опухоль росла и распространялась, она должна вызывать образование новых кровеносных сосудов и разрушать внеклеточный матрикс. Воспалительная реакция может играть значительную роль в вышеуказанных механизмах, таким образом способствуя ухудшению состояния организма-хозяина и прогрессированию опухоли. Благодаря своим противовоспалительным свойствам бактериальные штаммы Lactobacillus salivarius могут снижать скорость трансформации злокачественных клеток. Кроме того, кишечные бактерии могут вырабатывать из пищевых соединений вещества с генотоксичной, канцерогенной и стимулирующей опухоль активностью, и кишечные бактерии могут активировать превращение проканцерогенов в активных в отношении ДНК агентов (28). В целом, виды Lactobacillus имеют низкую активность ферментов, метаболизирующих ксенобиотики, по сравнению с другими популяциями в кишечнике, такими как бактероиды, эубактерии и клостридии. Поэтому увеличение числа бактерий рода Lactobacillus в кишечнике может благоприятно изменять уровни этих ферментов.
Доставка вакцин/лекарственных средств
Большинство патогенных организмов поступает внутрь через слизистые поверхности. Эффективная вакцинация этих участков защищает от инвазии конкретным инфекционным агентом. Методика пероральной вакцинации до настоящего времени была сосредоточена на применении ослабленных живых патогенных организмов или очищенных инкапсулированных антигенов (29). Пробиотические бактерии, сконструированные для выработки антигенов инфекционного агента in vivo, могут предоставлять заманчивую альтернативу, так как считается, что эти бактерии являются безопасными для употребления человеком (GRAS-статус (всеобще признаны как безопасные)).
Исследования на мышах продемонстрировали, что употребление пробиотических бактерий, экспрессирующих чужеродные антигены, может вызывать защитные иммунные реакции. Ген, кодирующий С-фрагмент столбнячного токсина (TTFC), экспрессировался у Lactococcus lactis, и мышей иммунизировали посредством перорального пути введения. Эта система была способна индуцировать титры антител достаточно высокие для того, чтобы защитить мышей от летальной стимуляции токсином. Кроме представления антигенов, живые бактериальные векторы могут вырабатывать in vivo биологически активные соединения, такие как иммуностимулирующие цитокины. L. lactis, секретирующий биологически активный человеческий ИЛ-2 или ИЛ-6 и TTFC, вызывал 10-15-кратное увеличение титров сывороточного IgG у мышей, иммунизированных интраназально (30). Однако с этим конкретным бактериальным штаммом общий уровень IgA не был повышен путем совместной экспрессии с этими цитокинами. Другие бактериальные штаммы, такие как Streptococcus gordonii также изучали на пригодность в качестве мукозальных вакцин. Рекомбинантный S.gordonii, колонизирующий ротовую и вагинальную полости у мышей, вызывал как реакцию в слизистой оболочке, так и системную реакцию антител на антигены, экспрессированные этой бактерией (31). Таким образом, пероральная иммунизация с использованием пробиотических бактерий в качестве векторов будет не только защищать организм-хозяин от инфекции, но также может заменять иммунологические стимулы, которые в норме вызывал бы патоген, таким образом способствуя иммунологическому "обучению" организма-хозяина.
Пребиотики
Введение пробиотических организмов осуществляется путем приема внутрь микроорганизма в подходящем носителе. Было бы полезно обеспечить среду, которая бы стимулировала рост этих пробиотических штаммов в толстой кишке. Добавление одного или более чем одного олигосахарида, полисахарида или другого пребиотика усиливает рост молочно-кислых бактерий в желудочно-кишечном тракте. Пребиотиком называют любой нежизнеспособный компонент пищи, который специфически сбраживается в ободочной кишке местными бактериями, которые, как полагают, имеют положительное значение, например бифидобактериями, лактобациллами. Типы пребиотиков могут включать такие, которые содержат фруктозу, ксилозу, сою, галактозу, глюкозу и маннозу. Совместное введение пробиотического штамма с одним или более чем одним пребиотическим соединением может усиливать рост введенного пробиотика in vivo, приводя к ярко выраженной пользе для здоровья, и называется симбиотическим.
Другие активные ингредиенты
Следует принимать во внимание, что пробиотические штаммы могут быть введены профилактически или как способ лечения либо сами по себе, либо с другими пробиотическими и/или пребиотическими материалами, как описано выше. Кроме того, бактерии могут быть использованы как часть профилактического или лечебного режима при использовании других активных материалов, таких, которые применяют для лечения воспаления или других расстройств, особенно с участием иммунологических факторов. Такие комбинации могут быть введены в одном препарате или в виде отдельных препаратов, вводимых одновременно или в разное время, и с использованием одного и того же или разных путей введения.
Изобретение не ограничивается воплощениями, описанными выше, которые могут различаться в деталях.
Ссылки
1. McCracken VJ. and Gaskins H.R. Probiotics and the immune system. In: Probiotics a critical review, Tannock, GW (ed), Horizon Scientific Press, UK. 1999, p.85-113.
2. Savage D.C. Interaction between the host and its microbes. In: Microbial Ecology of the Gut, dark and Bauchop (eds), Academic Press, London. 1977, p.277-310.
3. Kagnoff M.F. Immunology of the intestinal tract. Gastroenterol. 1993; 105(5):1275-80.
4. Lamm M.E. Interaction of antigens and antibodies at mucosal surfaces. Ann. Rev. Microbiol. 1997; 51: 311-40.
5. Raychaudhuri S., Rock KL. Fully mobilizing host defense: building better vaccines. Nat biotechnol., 1998; 16:1025-31.
6. Stallmach A., Strober W., MacDonald TT., Lochs H., Zeitz M. Induction and modulation of gastrointestinal inflammation. Immunol. Today, 1998; 19 (10): 438-41.
7. de Waal Malefyt R, Haanen J, Spits H, Roncarolo MG, te Velde A, Figdor C, Johnson K, Kastelein R, Yssei H, de Vries JE. Interleukin 10 (IL-10) and viral IL-10 strongly reduce antigen-specific human T cell proliferation by diminishing the antigen-presenting capacity of monocytes via downregulation of class II major histocompatibility complex expression. J Exp Med 1991 Oct l; 174(4):915-24.
8. Schmitt E, Rude E, Germann T. The immunostimulatory function of IL-12 in T-helper cell development and its regulation by TGF-beta, IFN-gamma and IL-4. Chem Immunol 1997; 68:70-85.
9. Leonard JP, Waldburger KE, Schaub RG, Smith T, Hewson AK, Cuzner ML, Goldman SJ. Regulation of the inflammatory response in animal models of multiple sclerosis by interleukin-12. Grit Rev Immunol 1997; 17(5-6):545-53.
10. Donnelly RP, Fenton MJ, Finbloom DS, Gerrard TL. Differential regulation of IL - production in human monocytes by IFN-gamma and IL- 4. J Immunol 1990 Jul 15; 145(2):569-75.
11. Wahl SM, Allen JB, Ohura K, Chenoweth DE, Hand AR, IFN-gamma inhibits inflammatory cell recruitment and the evolution of bacterial; cell wall-induced arthritis. J Immunol 1991 Jan 1; 146 (1):95-100.
12. Gatanaga T, Hwang CD, Kohr W, Cappuccini F, Lucci JA 3d, Jeffes EW, Lentz R, Tomich J, Yamamoto RS, Granger GA. Purification and characterization of an inhibitor (soluble tumor necrosis factor receptor) for tumor necrosis factor and lymphotoxin obtained from the serum ultrafiltrates of human cancer patients. Proc Natl Acad Sci USA 1990 Nov; 87(22):8781-4.
13. Kawakami M, lhara I, Ihara S, Suzuki A, Fukui K. A group of bactericidal factors conserved by vertebrates for more than 300 million years. J immunol 1984 May; 132(5):2578-81.
14. Mestan J, Digel W, Mittnacht S, Hillen H, Blohm D, MollerA, Jacobsen H, Kirchner H. Antiviral effects of recombinant tumour necrosis factor in vitro. Nature 1986 Oct 30-Nov 5; 323(6091):816-9.
15. Ferrante A, Nandoskar M, Walz A, Goh DH, Kowanko IC. Effects of tumour necrosis factor alpha and interleukin-1 alpha and beta on human neutrophil migration, respiratory burst and degranulation. Int Arch Allergy AppI Immunol 1988; 86(1):82-91.
16. Bachwich PR, Chensue SW, Larrick JW, Kunkel SL. Tumor necrosis factor stimulates interleukin-1 and prostaglandin E2 production in resting macrophages. Biochem Biophys Res Commun 1986 Apr 14; 136(1):94-101.
17. Cicco NA, Lindemann A, Content J, Vandenbussche P, Lubbert M, Gauss J, Mertelsmann R, Herrmann F. Inducible production of interleukin-6 by human polymorphonuclear neutrophils: role of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and tumor necrosis factor-alpha. Blood 1990 May 15; 75(10):2049-52.
18. Mangan DF, Welch GR, Wahl SM. Lipopolysaccharide, tumor necrosis factor-alpha, and IL-1 beta prevent programmed cell death (apoptosis) in human peripheral blood monocytes. J Immunol 1991 Mar 1; 146(5):1541-6.
19. Dinarello CA, Cannon JG, Wolff SM. New concepts on the pathogenesis of fever. Rev Infect Dis 1988 Jan-Feb; 10(I):168-89.
20. Dekker R, van der Meer R, Olieman C. Sensitive pulsed amperometric detection of free and conjugated bile acids in combination with gradient reversed-phase HPLC. Chromatographia 1991; 31(11/12): 549-553.
21. Tagg JR, Dajani AS, Wannamaker LW. Bacteriocins of Gram positive bacteria. Bactenol Rev. 1976; 40: 722-756.
22. Chauviere G., M.H. Cocconier S. Kerneis J. Foumiat and A.L. Servin. Adherence of human Lactobacillus acidophilus strains LB to human enterocyte-like Caco-2 cells. J. Gen. Microbiol 1992; 138:1689-1696.
23. Crabbe P.A., H. Bazin, H. Eyssen, and J.F. Heremans. The normal microbial flora as a major stimulus for proliferation of plasma cells synthesizing IgA in the gut. The germ free intestinal tract. Into. Arch. Allergy Appl Immunol, 1968; 34: 362-75.
24. Henderson B., Poole S and Wilson M. 1998. In "Bacteria-Cytokine interactions in health and disease". Portland Press, 79-130.
25. Arai KI, Lee F, Miyajima A, Miyatake S, Arai N, Yokota T. Cytokines: coordinators of immune and inflammatory responses. Annu Rev Biochem 1990; 59:783-836.
26. McGee DW, Bamberg T, Vitkus SJ, McGhee JR. A synergistic relationship between TNF-alpha, IL-1 beta, and TGF-beta 1 on IL-6 secretion by the IEC-6 intestinal epithelial cell line. Immunology 1995 Sep; 86(1):6-11.
27. Wu S, Meeker WA, Wiener JR, Berchuck A, Bast RC Jr, Boyer CM. Transfection of ovarian cancer ceils with tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) antisense mRNA abolishes the proliferative response to interleukin-1 (IL-1) but not TNF-alpha. Gynecol Oncol 1994 Apr; 53(I):59-63.
28. Rowland I.R. Toxicology of the colon: role of the intestinal microflora. In: Gibson G.R. (ed). Human colonic bacteria: role in nutrition, physiology and pathology, 1995, pp 155-174. Boca Raton CRC Press.
29. Walker, R.I. New strategies for using mucosal vaccination to achieve more effective immunization. Vaccine, 1994; 12: 387-400.
30. Steidler L., K. Robinson, L Chamberlain, K.M Scholfield, E. Remaut, R.W.K Le Page and J.M. Wells. Mucosal delivery of murine interleukin-2 (IL-2) and IL-6 by recombinant strains of Lactococcus lactis coexpressing antigen and cytokine. Infect. Immun., 1998; 66:3183-9.
31. Medaglini D., G.Pozzi, T.P. King and V.A.Fischetti. Mucosal and systemic immune responses to a recombinant protein expressed on the surface of the oral commensal bacterium Streptococcus gordonii after oral colonization. Proc. Nail. Acad. Sci. USA, 1995; 92:6868-72.
1. Штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41044, обладающий свойствами пробиотика.
2. Штамм Lactobacillus salivarius по п.1, отличающийся тем, что представлен в виде жизнеспособных клеток.
3. Штамм Lactobacillus salivarius по п.1, отличающийся тем, что представлен в виде нежизнеспособных клеток.
4. Штамм Lactobacillus salivarius по п.1, отличающийся тем, что выделен из резецированного и промытого желудочно-кишечного тракта человека.
5. Штамм Lactobacillus salivarius по п.1, отличающийся тем, что оказывает иммуномодулирующее действие после перорального приема у людей.
6. Штамм Lactobacillus salivarius по п.1, отличающийся тем, что предназначен для применения в пищевых продуктах, для применения в качестве лекарства, для применения в профилактике и/или лечении нежелательной воспалительной активности, для применения в профилактике и/или лечении нежелательной воспалительной активности в желудочно-кишечном тракте, такой как воспалительное заболевание кишечника, например болезни Крона или неспецифического язвенного колита, синдрома раздраженного кишечника, резервуарного илеита или постинфекционного колита; для применения в профилактике и/или лечении рака желудочно-кишечного тракта; для применения в профилактике и/или лечении системного заболевания, такого как ревматоидный артрит; для применения в профилактике и/или лечении аутоиммунных расстройств, являющихся следствием нежелательной воспалительной активности; для применения в профилактике и/или лечении рака, являющегося следствием нежелательной воспалительной активности; для применения в профилактике рака; для применения в профилактике и/или лечении диарейного заболевания, являющегося следствием нежелательной воспалительной активности, например диареи, вызванной Clostridium difficile, диареи, вызванной ротавирусом, или постинфекционной диареи, вызванной инфекционным агентом, таким как E.coli; для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для профилактики и/или лечения нежелательной воспалительной активности, где штаммы действуют путем антагонистического воздействия на провоспалительные микроорганизмы и удаления их из желудочно-кишечного тракта; для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для снижения уровней провоспалительных цитокинов и/или для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для снижения уровней интерлейкина-8 (ИЛ-8).
7. Штамм Lactobacillus salivarius по п.1, отличающийся тем, что предназначен для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для модификации уровней интерферона -γ (γ-ИФН).
8. Штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41045, обладающий свойствами пробиотика.
9. Штамм Lactobacillus salivarius no п.8, отличающийся тем, что представлен в виде жизнеспособных клеток.
10. Штамм Lactobacillus salivarius по п.8, отличающийся тем, что представлен в виде нежизнеспособных клеток.
11. Штамм Lactobacillus salivarius по п.8, отличающийся тем, что выделен из резецированного и промытого желудочно-кишечного тракта человека.
12. Штамм Lactobacillus salivarius no п.8, отличающийся тем, что оказывает иммуномодулирующее действие после перорального приема у людей.
13. Штамм Lactobacillus salivarius no п.8, отличающийся тем, что предназначен для применения в пищевых продуктах, для применения в качестве лекарства, для применения в профилактике и/или лечении нежелательной воспалительной активности, для применения в профилактике и/или лечении нежелательной воспалительной активности в желудочно-кишечном тракте, такой как воспалительное заболевание кишечника, например болезни Крона или неспецифического язвенного колита, синдрома раздраженного кишечника, резервуарного илеита или постинфекционного колита; для применения в профилактике и/или лечении рака желудочно-кишечного тракта; для применения в профилактике и/или лечении системного заболевания, такого как ревматоидный артрит; для применения в профилактике и/или лечении аутоиммунных расстройств, являющихся следствием нежелательной воспалительной активности; для применения в профилактике и/или лечении рака, являющегося следствием нежелательной воспалительной активности; для применения в профилактике рака; для применения в профилактике и/или лечении диарейного заболевания, являющегося следствием нежелательной воспалительной активности, например диареи, вызванной Clostridium difficile, диареи, вызванной ротавирусом, или постинфекционной диареи, или диареи, вызванной инфекционным агентом, таким как Е.coli; для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для профилактики и/или лечения нежелательной воспалительной активности, где штаммы действуют путем антагонистического воздействия на провоспалительные микроорганизмы и удаления их из желудочно-кишечного тракта; для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для снижения уровней провоспалительных цитокинов и/или для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для снижения уровней ИЛ-8.
14. Штамм Lactobacillus salivarius по п.8, отличающийся тем, что предназначен для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для модификации уровней γ-ИФН.
15. Штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41047, обладающий свойствами пробиотика.
16. Штамм Lactobacillus salivarius по п.15, отличающийся тем, что представлен в виде жизнеспособных клеток.
17. Штамм Lactobacillus salivarius по п.15, отличающийся тем, что представлен в виде нежизнеспособных клеток.
18. Штамм Lactobacillus salivarius по п.15, отличающийся тем, что выделен из резецированного и промытого желудочно-кишечного тракта человека.
19. Штамм Lactobacillus salivarius по п.15, отличающийся тем, что оказывает иммуномодулирующее действие после перорального приема у людей.
20. Штамм Lactobacillus salivarius по п.15, отличающийся тем, что предназначен для применения в пищевых продуктах, для применения в качестве лекарства, для применения в профилактике и/или лечении нежелательной воспалительной активности, для применения в профилактике и/или лечении нежелательной воспалительной активности в желудочно-кишечном тракте, такой как воспалительное заболевание кишечника, например болезни Крона или неспецифического язвенного колита, синдрома раздраженного кишечника, резервуарного илеита или постинфекционного колита; для применения в профилактике и/или лечении рака желудочно-кишечного тракта; для применения в профилактике и/или лечении системного заболевания, такого как ревматоидный артрит; для применения в профилактике и/или лечении аутоиммунных расстройств, являющихся следствием нежелательной воспалительной активности; для применения в профилактике и/или лечении рака, являющегося следствием нежелательной воспалительной активности; для применения в профилактике рака; для применения в профилактике и/или лечении диарейного заболевания, являющегося следствием нежелательной воспалительной активности, например диареи, вызванной Clostridium difficile, диареи, вызванной ротавирусом, или постинфекционной диареи, или диареи, вызванной инфекционным агентом, таким как E.coli; для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для профилактики и/или лечения нежелательной воспалительной активности, где штаммы действуют путем антагонистического воздействия на провоспалительные микроорганизмы и удаления их из желудочно-кишечного тракта; для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для снижения уровней провоспалительных цитокинов и/или для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для снижения уровней ИЛ-8.
21. Штамм Lactobacillus salivarius по п.15, отличающийся тем, что предназначен для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для модификации уровней γ-ИФН.
22. Штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41093, обладающий свойствами пробиотика.
23. Штамм Lactobacillus salivarius по п.22, отличающийся тем, что представлен в виде жизнеспособных клеток.
24. Штамм Lactobacillus salivarius по п.22, отличающийся тем, что представлен в виде нежизнеспособных клеток.
25. Штамм Lactobacillus salivarius по п.22, отличающийся тем, что выделен из резецированного и промытого желудочно-кишечного тракта человека.
26. Штамм Lactobacillus salivarius по п.22, отличающийся тем, что оказывает иммуномодулирующее действие после перорального приема у людей.
27. Штамм Lactobacillus salivarius по п.22, отличающийся тем, что предназначен для применения в пищевых продуктах, для применения в качестве лекарства, для применения в профилактике и/или лечении нежелательной воспалительной активности, для применения в профилактике и/или лечении нежелательной воспалительной активности в желудочно-кишечном тракте, такой как воспалительное заболевание кишечника, например болезни Крона или неспецифического язвенного колита, синдрома раздраженного кишечника, резервуарного илеита или постинфекционного колита; для применения в профилактике и/или лечении рака желудочно-кишечного тракта; для применения в профилактике и/или лечении системного заболевания, такого как ревматоидный артрит; для применения в профилактике и/или лечении аутоиммунных расстройств, являющихся следствием нежелательной воспалительной активности; для применения в профилактике и/или лечении рака, являющегося следствием нежелательной воспалительной активности; для применения в профилактике рака; для применения в профилактике и/или лечении диарейного заболевания, являющегося следствием нежелательной воспалительной активности, например диареи, вызванной Clostridium difficile, диареи, вызванной ротавирусом, или постинфекционной диареи, или диареи, вызванной инфекционным агентом, таким как E.coli; для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для профилактики и/или лечения нежелательной воспалительной активности, где штаммы действуют путем антагонистического воздействия на провоспалительные микроорганизмы и удаления их из желудочно-кишечного тракта; для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для снижения уровней провоспалительных цитокинов и/или для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для снижения уровней ИЛ-8.
28. Штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41094, обладающий свойствами пробиотика.
29. Штамм Lactobacillus salivarius по п.28, отличающийся тем, что представлен в виде жизнеспособных клеток.
30. Штамм Lactobacillus salivarius по п.28, отличающийся тем, что представлен в виде нежизнеспособных клеток.
31. Штамм Lactobacillus salivarius по п.28, отличающийся тем, что выделен и резецированного и промытого желудочно-кишечного тракта человека.
32. Штамм Lactobacillus salivarius по п.28, отличающийся тем, что оказывает иммуномодулирующее действие после перорального приема у людей.
33. Штамм Lactobacillus salivarius по п.22, отличающийся тем, что предназначен для применения в пищевых продуктах, для применения в качестве лекарства, для применения в профилактике и/или лечении нежелательной воспалительной активности, для применения в профилактике и/или лечении нежелательной воспалительной активности в желудочно-кишечном тракте, такой как воспалительное заболевание кишечника, например болезни Крона или неспецифического язвенного колита, синдрома раздраженного кишечника, резервуарного илеита или постинфекционного колита; для применения в профилактике и/или лечении рака желудочно-кишечного тракта; для применения в профилактике и/или лечении системного заболевания, такого как ревматоидный артрит; для применения в профилактике и/или лечении аутоиммунных расстройств, являющихся следствием нежелательной воспалительной активности; для применения в профилактике и/или лечении рака, являющегося следствием нежелательной воспалительной активности; для применения в профилактике рака; для применения в профилактике и/или лечении диарейного заболевания, являющегося следствием нежелательной воспалительной активности, например диареи, вызванной Clostridium difficile, диареи, вызванной ротавирусом, или постинфекционной диареи, или диареи, вызванной инфекционным агентом, таким как E.coli; для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для профилактики и/или лечения нежелательной воспалительной активности, где штаммы действуют путем антагонистического воздействия на провоспалительные микроорганизмы и удаления их из желудочно-кишечного тракта; для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для снижения уровней провоспалительных цитокинов и/или для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для снижения уровней ИЛ-8.
34. Штамм Lactobacillus salivarius по п.28, отличающийся тем, что предназначен для применения в приготовлении противовоспалительных биотерапевтических агентов для модификации уровней фактора некроза опухоли α (ФНО-α).
35. Пробиотический препарат, содержащий по меньшей мере один штамм Lactobacillus salivarius, выбранный из любого из штаммов Lactobacillus salivarius NCIMB 41044, NCIMB 41045, NCIMB 41047, NCIMB 41093 или NCIMB 41094.
36. Препарат по п.35, отличающийся тем, что он содержит другое пробиотическое вещество, пребиотическое вещество и/или носитель, пригодный для приема внутрь, такой как фармацевтически приемлемый носитель, в форме капсулы, таблетки или порошка, или в форме пищевого продукта, такого как подкисленное молоко, йогурт, замороженный йогурт, сухое молоко, концентрат молока, плавленые сыры, приправы или напитки.
37. Препарат по п.35 или 36, отличающийся тем, что дополнительно содержит белок и/или пептид, в частности белки и/или пептиды, которые богаты глутамином/глутаматом, липид, углевод, витамин, минеральное вещество и/или микроэлемент.
38. Препарат по п.35, отличающийся тем, что штамм Lactobacillus salivarius присутствует в препарате в количестве более 106 КОЕ на грамм препарата.
39. Препарат по п.35, отличающийся тем, что содержит адъювант, бактериальный компонент, лекарственное вещество и/или биологическое соединение.
40. Препарат по п.35, отличающийся тем, что предназначен для применения в процедурах иммунизации и вакцинации.
41. Способ лечения или предупреждения нежелательной воспалительной активности или воспалительного заболевания у субъекта, при котором субъекту вводят штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41044, или штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41045, или штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41047, или штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41093, или штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41094, причем нежелательной воспалительной активностью является воспалительная активность в желудочно-кишечном тракте, воспалительное заболевание кишечника, такое как болезнь Крона или неспецифический язвенный колит; синдром раздраженного кишечника; резервуарный илеит; и/или постинфекционный колит.
42. Способ лечения или предупреждения рака у субъекта, при котором субъекту вводят штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41044, или штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41045, или штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41047, или штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41093, или штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41094, причем рак представляет собой рак желудочно-кишечного тракта или рак, являющийся следствием воспаления.
43. Способ лечения или предупреждения системного заболевания, связанного с воспалением у субъекта, при котором субъекту вводят штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41044, или штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41045, или штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41047, или штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41093, или штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41094, причем системное заболевание представляет собой ревматоидный артрит.
44. Способ лечения или предупреждения аутоиммунного расстройства, вызванного воспалением у субъекта, при котором субъекту вводят штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41044, или штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41045, или штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41047, или штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41093, или штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41094.
45. Способ лечения или предупреждения диарейного заболевания у субъекта, при котором субъекту вводят штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41044, или штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41045, или штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41047, или штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41093, или штамм Lactobacillus salivarius NCIMB 41094, причем диарейное заболевание представляет собой диарею, вызванную Clostridium difficile, диарею, вызванную ротавирусом, постинфекционную диарею или диарейное заболевание, вызванное инфекционным агентом, таким как E.coli.
