Пептиды латарцины, проявляющие антимикробную активность

Изобретение относится к биохимии, в частности к биологически активным пептидам, обладающим антимикробным действием, которые могут найти применение в биотехнологии и медицине. Латарцины 3а и 3b получают из яда среднеазиатского паука Lachesana tarabaevi. Латарцины состоят из 24 аминокислотных остатков каждый, представляют собой линейные пептиды и не содержат остатков цистеина. Полученные химическим синтезом латарцины проявляют идентичные природным пептидам биологические свойства. Латарцины проявляют антимикробную активность в отношении ряда Гр - и Гр + бактерий и дрожжевых грибов. Пептид латарцина имеет следующую аминокислотную последовательность: H₂N-Ser¹-Trp²-X³-Ser⁴-Met⁵-Ala⁶-Lys⁷-Lys⁸-Leu⁹-Lys¹⁰-Glu¹¹-Tyr¹²-Met¹³-Glu¹⁴-Lys¹⁵-Leu¹⁶-Lys¹⁷-Gln¹⁸-Arg¹⁹-Ala²⁰-NH₂, где Х - остаток лизина Lys³ (латарцин-3а, LtAMP-3а) или аланина Ala³ (латарцин-3b, LtAMP-3b). Латарцины обладают высокой антимикробной активностью, цитотоксичностью в отношении некоторых опухолевых клеток и низкой токсичностью к нормальным клеткам крови, что может обеспечить высокий терапевтический потенциал лекарственных средств, в частности антибиотиков на основе латарцинов. 4 ил., 3 табл.

 

Изобретение относится к биохимии, конкретно к биологически активным пептидам, обладающим антимикробным действием, которые могут найти применение в биотехнологии и медицине.

Целый ряд антибиотиков являются незаменимыми лечебными препаратами, применяющимися при инфекциях, ранее считавшихся неизлечимыми. Однако ввиду возрастания числа микроорганизмов, вызывающих инфекционные заболевания, а также ввиду изменения этиологической структуры инфекционных заболеваний актуальна проблема поиска новых антибиотиков.

Подавляющее большинство используемых антибиотиков относятся к одному из структурных классов соединений, среди которых только один является относительно новым, а остальные были введены в клиническую практику более 40 лет назад [Walsh, С. 2003. Where will new antibiotics come from? Nat. Rev. Microbiol. 1: 65-70].

При широком применении антибиотиков в качестве лечебных препаратов происходит быстрое накопление форм микроорганизмов, устойчивых к этим соединениям, клинически существенная резистентность возникает за период от нескольких месяцев до нескольких лет. Известны случаи устойчивости распространенных патогенов человека, таких как Enterococcus faecalis, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae и многих других, практически к любому из применяемых препаратов [Walsh, С. 2000. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance. Nature 406: 775-781].

В ходе исследований механизмов, лежащих в основе защитных реакций организма хозяина на появление патогена, открыт новый класс природных антибиотиков, продуцируемых животными и высшими растениями. Показано, что большую роль в отражении атаки патогенов иммунной системой хозяина играют т.н. антимикробные пептиды. Благодаря накопленным экспериментальным данным сформировано представление об этих молекулах как универсальном и эволюционно древнем механизме защиты растительных и животных организмов от патогенов [Finlay, B.B., Hancock, R.E.W. 2004. Can innate immunity be enhanced to treat microbial infections? Nat. Rev. Microbiol. 2: 497-504]. Для большинства антимикробных пептидов мишенью действия, по-видимому, являются мембраны клеток патогенных организмов, а механизмом действия - нарушение нормальной проницаемости этих мембран.

Несмотря на существование более сильных антибиотиков, антимикробные пептиды обладают рядом преимуществ. Способность быстро убивать клетки-мишени, широкий спектр действия, активность в отношении штаммов, резистентных к другим антибиотикам, а также трудность в селекции устойчивых мутантов in vitro, позволяют рассматривать эти вещества в качестве основы для создания эффективных лекарств [Hancock, R.E.W., Lehrer, R. 1998. Cationic peptides: a new source of antibiotics. Trends Biotechnol. 16: 82-88].

Известно несколько сотен антимикробных пептидов [Brahmachary, M. et al. 2004. ANTIMIC: a database of antimicrobial sequences. Nucleic Acids Res. 32: D586-D589]. Особое место занимают антимикробные пептиды, не содержащие в своем составе остатков цистеина, поскольку такая структурная особенность значительно облегчает их производство химическим или биотехнологическим путем и снижает себестоимость. Много внимания уделяется линейным пептидам, склонным к организации в амфипатическую α-спираль при контакте с мембранами, обсуждаются подходы к оптимизации их свойств с целью повышения терапевтического потенциала [Tossi, A., Sandri, L., Giangaspero, A. 2000. Amphipathic, α-helical antimicrobial peptides. Biopolymers 55: 4-30].

В числе свойств, которые необходимо контролировать у потенциальных антибиотиков, - токсическое действие на клетки макроорганизма. Наличие подобной активности у целого ряда антимикробных пептидов является серьезным недостатком и ограничивает возможность их применения в качестве лекарственных средств.

Наиболее близким к заявляемым пептидам по структуре и биологическим свойствам является фрагмент антимикробного пептида из гранулоцитов мыши, названный CRAMP-18 [Kang, S.-W. et al. 2002. CRAMP analog having potent antibiotic activity without hemolytic activity Protein Pept. Lett. 9: 275-282]. Фрагмент состоит из 18 аминокислотных остатков, полностью ингибирует рост некоторых бактерий в концентрациях 0,5-64 мкМ и не проявляет гемолитической активности при 50 мкМ. Полноразмерный антимикробный пептид CRAMP из гранулоцитов мыши [Gallo, R.L. et al. 1997. Identification of CRAMP, a cathelin-related antimicrobial peptide expressed in the embryonic and adult mouse. J. Biol. Chem. 272: 13088-13093] содержит 38 аминокислотных остатков, относится к группе кателицидинов и также активен в отношении ряда бактерий в концентрациях 0,5-64 мкМ.

Изобретение решает задачу расширения ассортимента антимикробных пептидов.

Поставленная задача решается за счет структуры пептида латарцина, имеющего следующую аминокислотную последовательность:

H₂N-Ser¹-Trp²-X³-Ser⁴-Met⁵-Ala⁶-Lys⁷-Lys⁸-Leu⁹-Lys¹⁰-Glu¹¹-Tyr¹²-Met¹³-Glu¹⁴-Lys¹⁵-Leu¹⁶-Lys¹⁷-Gln¹⁸-Arg¹⁹-Ala²⁰-NH₂,

где Х - остаток лизина Lys³ (латарцин-3а, LtAMP-3a) или аланина Ala³ (латарцин-3b, LtAMP-3b).

Заявляемые пептиды латарцины проявляют антимикробную активность в отношении ряда грамположительных (Arthrobacter globiformis. Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Rhodococcus equi) и грамотрицательных (Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens) бактерий, а также дрожжевых грибов (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris). Минимальные концентрации пептидов, необходимые для полного ингабирования роста перечисленных организмов in vitro (минимальные ингибирующие концентрации), составляют 0,3-60 мкМ. При этом латарцины LtAMP-3а и LtAMP-3b не проявляют гемолитической активности при концентрации пептидов до 80 мкМ, не токсичны по отношению к лейкоцитам человека при концентрации до 40 мкМ. Заявляемые пептиды обладают также цитотоксическим действием в отношении клеток эритролейкемии человека (при концентрации 20-35 мкМ вызывают гибель 100% опухолевых клеток). Таким образом, техническим результатом предлагаемого изобретения является высокая антимикробная активность пептидов LtAMP-3а и LtAMP-3b, а также цитотоксичность в отношении некоторых опухолевых клеток, сочетаемые с низкой токсичностью по отношению к нормальным клеткам крови, а значит высокий терапевтический потенциал предполагаемых лекарственных средств. Заявляемые пептиды рассматриваются в качестве основы для создания новых эффективных антибиотиков.

Пептиды LtAMP-3а и LtAMP-3b состоят из 20 аминокислотных остатков каждый, т.е. являются небольшими молекулами, что упрощает их получение химическим синтезом. Кроме того, латарцины являются линейными пептидами и не содержат остатков цистеина, что также упрощает их получение химическим синтезом или биотехнологически, поскольку исключает риск образования неактивных форм за счет некорректного замыкания дисульфидов.

Латарцины LtAMP-3а и LtAMP-3b получают из природного источника - яда среднеазиатского паука Lachesana tarabaevi Zonstein et Ovtchinnikov, 1999, который относится к семейству Zodariidae, отряду Araneae, классу Arachnida, типу Arthropoda. Латарцины, полученные химическим синтезом, демонстрируют идентичные природным пептидам биологические свойства.

Заявляемые пептиды представляют собой новые соединения и не являются близкими гомологами уже известных белков или пептидов.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Выделение антимикробных пептидов латарцина-3а (LtAMP-3а) и латарцина-3b (LtAMP-3b) из яда паука Lachesana tarabaevi.

Цельный яд паука Lachesana tarabaevi подвергают разделению по методу ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой Jupiter С₅ (2×150 мм, размер пор 300 Å, диаметр частиц 5 мкм, Phenomenex, США). Фракционирование проводят в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 0 до 70% (v/v) в 0,1%-ной (v/v) трифторуксусной кислоте в течение 35 минут со скоростью элюции 0,3 мл/мин. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 210 нм. Полученные фракции тестируют на способность ингибировать рост Escherichia coli DH5α. Пептиды LtAMP-3а и LtAMP-3b элюируются с колонки в составе фракции со временем удерживания 23,7 минут (фиг.1).

Фракцию, содержащую LtAMP-3а и LtAMP-3b, далее разделяют по методу ВЭЖХ на колонке Ascentis RP-Amide (2,1×100 мм, диаметр частиц 3 мкм, Supelco, США). Фракционирование проводят в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 20 до 55% (v/v) в 0,1%-ной (v/v) трифторуксусной кислоте в течение 30 минут со скоростью элюции 0,3 мл/мин. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 210 нм. Полученные фракции тестируют на способность ингибировать рост Escherichia coli DH5α. Пептид LtAMP-3а элюируется с колонки со временем удерживания 26 минут, а пептид LtAMP-3b - со временем удерживания 26,5 минут (фиг.2).

Содержание примесей в очищенных фракциях составляет 5%, что подтверждается разделением по методу ВЭЖХ на аналитической колонке Luna C₁₈ (1×150 мм, размер пор 100 Å, диаметр частиц 3 мкм, Phenomenex, США) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 20 до 60% (v/v) в 0,1%-ной (v/v) трифторуксусной кислоте в течение 40 минут со скоростью элюции 50 мкл/мин, детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 210 нм.

Пример 2.

Установление аминокислотных последовательностей латарцинов LtAMP-3а и LtAMP-3b.

Определение N-концевой аминокислотной последовательности очищенных пептидов проводят методом ступенчатой деградации по Эдману на автоматическом секвенаторе Procise 492 (Applied Biosystems, США).

В результате устанавливают полные аминокислотные последовательности очищенных пептидов.

Латарцин-3а содержит 20 аминокислотных остатков:

H₂N-Ser¹-Trp²-Lys³-Ser⁴-Met⁵-Ala⁶-Lys⁷-Lys⁸-Leu⁹-Lys¹⁰-Glu¹¹-Tyr¹²-Met¹³-Glu¹⁴-Lys¹⁵-Leu¹⁶-Lys¹⁷-Gln¹⁸-Arg¹⁹-Ala²⁰

Латарцин-3b также содержит 20 аминокислотных остатков:

H₂N-Ser¹-Trp²-Ala³-Ser⁴-Met⁵-Ala⁶-Lys⁷-Lys⁸-Leu⁹-Lys¹⁰-Glu¹¹-Tyr¹²-Met¹³-Glu¹⁴-Lys¹⁵-Leu¹⁶-Lys¹⁷-Gln¹⁸-Arg¹⁹-Ala²⁰

Таким образом, латарцин-3а и латарцин-3b являются гомологичными пептидами, аминокислотные последовательности которых различаются только по одному остатку (у латарцина-3а в положении 3 присутствует остаток лизина, а у латарцина-3b - остаток аланина).

Анализ аминокислотной последовательности латарцинов LtAMP-3а и LtAMP-3b (распределение гидрофобных и гидрофильных остатков, общий заряд молекул) позволяет предположить склонность этих пептидов к образованию амфипатической α-спирали при взаимодействии с мембранами.

Пример 3.

Определение относительной молекулярной массы латарцинов LtAMP-3а и LtAMP-3b.

Индивидуальность очищенных веществ подтверждают масс-спектрометрическим анализом. Масс-спектры получают на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре ultraflex II TOF/TOF (Bruker Daltonik, Германия), с идентификацией положительных ионов в рефлекторном режиме. В качестве матрицы используют α-циано-4-гидроксикоричную кислоту (10 мг/мл) в 50%-ном (v/v) ацетонитриле, содержащем 0,1%-ную (v/v) трифторуксусную кислоту. Для калибровки прибора используют стандартную смесь пептидов с диапазоном молекулярных масс 700-3500 Да (Bruker Daltonik, Германия).

Измеренные моноизотопные молекулярные массы природных пептидов LtAMP-3а и LtAMP-3b, а также соответствующие значения масс, рассчитанные по установленным аминокислотным последовательностям, приведены в таблице 1.

Таблица 1 Значения расчетных и измеренных моноизотопных молекулярных масс латарцинов LtAMP-3а и LtAMP-3b, а также разница этих значений
пептид	расчетная масса, Да	измеренная масса, Да	разница, Да
LtAMP-3а	2482,4	2481,6	0,8
LtAMP-3b	2425,3	2424,5	0,8

Из приведенных данных видно, что реальные измеренные молекулярные массы пептидов отличаются от соответствующих расчетных значений на ˜1 Да. С учетом точности метода определения масс выносится заключение о наличии особой посттрансляционной модификации у данных пептидов - С-концевого амидирования.

Таким образом, латарцины LtAMP-3а и LtAMP-3b вместо свободной α-карбоксильной группы у Ala²⁰ содержат амидную группу:

H₂N-Ser¹-Trp²-X³-Ser⁴-Met⁵-Ala⁶-Lys⁷-Lys⁸-Leu⁹-Lys¹⁰-Glu¹¹-Tyr¹²-Met¹³-Glu¹⁴-Lys¹⁵-Leu¹⁶-Lys¹⁷-Gln¹⁸-Arg¹⁹-Ala²⁰-NH₂,

где X - остаток лизина Lys³ (латарцин-3а) или аланина Ala³ (латарцин-3b).

Пример 4.

Химический синтез латарцинов LtAMP-3а и LtAMP-3b.

Пептиды синтезируют твердофазным методом в ручном варианте путем наращивания цепи с С-концевого остатка на 4-(2',4'-диметоксифенил-Fmoc-аминометил)-фенокси (Ринк-амидной) смоле (PepChem, Германия) с нагрузкой 0,51 ммоль/г, для временной защиты α-NH₂-групп используют флуоренилметоксикарбонильную группу (Fmoc) [Chan, W.C., White, P.D. 2000. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. University Press, Oxford]. Защиту боковых групп аминокислотных остатков выбирают с расчетом на конечное деблокирование трифторуксусной кислотой: для защиты боковых групп остатков Glu используют O-третбутильную группу, для Ser - третбутильную группу, для Trp - третбутилоксикарбонильную группу, для Gln - тритильную группу.

Аминокислотные остатки присоединяют к пептидил-полимеру с образованием гидроксибензотриазолового эфира в присутствии 1,3-диизопропилкарбодиимида, для активации 1 экв аминокислоты используют 1,2 экв N-гидроксибензотриазола и 1 экв 1,3-диизопропилкарбодиимида. Для наращивания полипептидной цепи в ходе каждого синтетического цикла проводят конденсацию пептидил-полимера с 5 экв активированной Fmoc-аминокислоты при 37°С, содержание непрореагировавших аминогрупп контролируют визуально по окрашиванию pH-зависимого индикатора бромфенолового синего.

Отщепление продукта от полимера с одновременным деблокированием боковых групп проводят смесью трифторуксусной кислоты, воды и этандитиола (95:2,5:2,5, v/v/v) из расчета 1 мл смеси на 50 мг смолы. Суспензию перемешивают в течение 2 часов, затем раствор пептида в трифторуксусной кислоте отфильтровывают от полимера. Продукт высаживают 10-кратным избытком (по объему) охлажденного диэтилового эфира, отфильтровывают, дважды промывают эфиром, после чего высушивают лиофильно. Восстановление окисленных остатков метионина проводят обработкой раствора пептида (2 мг/мл) в 10%-ной (v/v) уксусной кислоте метилмеркаптоацетамидом (10 экв на 1 экв остатков метионина) в течение 36 часов при 37°С.

Синтезированные пептиды подвергают очистке по методу ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой Luna C₁₈ (10×250 мм, размер пор 100 Å, диаметр частиц 10 мкм, Phenomenex, США). Фракционирование проводят в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 0 до 50% (v/v) в 0,1%-ной (v/v) трифторуксусной кислоте в течение 60 минут со скоростью элюции 2 мл/мин. Детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 210 нм.

Содержание примесей в синтетических препаратах LtAMP-3а и LtAMP-3b составляет 1%, что подтверждается разделением по методу ВЭЖХ на аналитической колонке Luna C₁₈ (1×150 мм, размер пор 100 Å, диаметр частиц 3 мкм, Phenomenex, США) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 20 до 60% (v/v) в 0,1%-ной (v/v) трифторуксусной кислоте в течение 40 минут со скоростью элюции 50 мкл/мин, детекцию осуществляют по оптическому поглощению при 210 нм.

Идентичность синтезированных LtAMP-3а и LtAMP-3b природным доказывают при помощи масс-спектрометрического анализа, сравнением хроматографических подвижностей при разделении на аналитической колонке Luna C₁₈ (1×150 мм, Phenomenex, США), а также сравнением их биологических свойств.

Пример 5.

Получение спектров кругового дихроизма пептидов LtAMP-3а и LtAMP-3b.

Спектры КД измеряют с помощью спектрополяриметра J-810 (Jasco, Япония) в кювете с длиной оптического пути 0,01 см в диапазоне длин волн 190-250 нм с шагом 1 нм. Исследуется конформация пептидов LtAMP-3а и LtAMP-3b в воде (рН˜5), в смеси воды (рН˜5) с трифторэтанолом в объемном соотношении 1:1 и в суспензии липосом, формируемых диолеилфосфатидилхолином (ДОФХ) или смесью диолеоилфосфатидилхолина и диолеоилфосфатидилглицерола (ДОФХ/ДОФГ), диаметром 100 нм. В суспензии липосом присутствует 40 мМ натрий-фосфатный буфер (рН 7,5) и 83 мМ NaCl.

Моноламеллярные ДОФХ и ДОФХ/ДОФГ липосомы готовят методом экструзии. К сухому липиду (10 мг; в случае ДОФХ/ДОФГ липосом - эквимолярная смесь липидов) добавляют 40 мМ натрий-фосфатный буфер (рН 7,5, 1 мл) и выдерживают взвесь при перемешивании в течение 60 мин при комнатной температуре. Затем проводят 10 циклов замораживания-оттаивания взвеси с использованием холодильника на основе жидкого азота. Полученную суспензию липида продавливают с помощью экструдера (Avanti, США) 20 раз через поликарбонатную мембрану с размером пор 100 нм при комнатной температуре. В результате получают суспензию больших (диаметр 100 нм) моноламеллярных липосом в концентрации по липиду 10 мг/мл.

Концентрация пептидов в воде составляет 0,16 мМ, в растворе вода-трифторэтанол - 0,08 мМ, в суспензии липосом - 0,1 мМ. Молярное соотношение липид/пептид составляет 50:1. Спектры КД приведены (фиг.3) в единицах молярной эллиптичности [Θ], рассчитанной по формуле: [Θ]=115×Θ_экспер/(10×С×l), где Θ_экспер - наблюдаемая эллиптичность в миллиградусах, С - концентрация пептида в мг/мл, l - длина оптического пути (толщина кюветы) в см, 115 - средний молекулярный вес одного аминокислотного остатка.

Оценку содержания элементов вторичной структуры (табл.2) проводят по программе CONTINLL [Provencher, S.W., Glockner, J., 1982. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism. Biochemistry. 20, 33-37] для глобулярных белков.

Таблица 2 Содержание элементов вторичной структуры для пептидов LtAMP-3a и LtAMP-3b по данным КД
пептид	раствор	α-спираль	β-структура	β-изгиб	неупорядоченная структура
LtAMP-3а	вода, pH 5,0	31%	16%	21%	32%
	трифторэтанол : вода, 1:1	87%	0	0	13%
	ДОФХ липосомы	56%	3%	15%	26%
ДОФХ/ДОФГ липосомы	90%	0	0	10%
LtAMP-3b	вода, pH 5,0	39%	11%	20%	30%
	трифторэтанол : вода, 1:1	85%	0	0	15%
	ДОФХ липосомы	53%	7%	13%	27%
ДОФХ/ДОФГ липосомы	84%	0	4%	12%

Анализ полученных спектров показывает, что (1) в водной среде латарцины LtAMP-3а и LtAMP-3b не склонны к образованию упорядоченной структуры, (2) в окружении, имитирующем мембраны (трифторэтанол), латарцины принимают α-спиральную конформацию, (3) LtAMP-3а и LtAMP-3b взаимодействуют с мембранами, по крайней мере, состоящими из диолеилфосфатидилхолина или смеси диолеоилфосфатидилхолина и диолеоилфосфатидилглицерола, (4) при взаимодействии с мембранами пептиды образуют упорядоченную структуру типа α-спирали, (5) взаимодействие с мембранами разного липидного состава различно, что в первом приближении объясняет селективность действия латарцинов в отношении бактерий (ДОФХ липосомы имитируют мембраны клеток эукариот, ДОФХ/ДОФГ липосомы - цитоплазматические мембраны бактериальных клеток).

Пример 6.

Антимикробные свойства латарцинов LtAMP-3а и LtAMP-3b.

Для определения антимикробной активности фракций, полученных в ходе хроматографического разделения компонентов яда паука Lachesana tarabaevi, очищенных латарцинов, а также синтетических LtAMP-3a и LtAMP-3b используют следующие штаммы микроорганизмов: Escherichia coli DH5α, Escherichia coli MH1, Pseudomonas fluorescens B-894, Arthrobacter globiformis BKM 348-10, Bacillus subtilis BKM B-504, Micrococcus luteus NCIMB 13267, Rhodococcus equi Ac-953, Saccharomyces cerevisiae Y190 ИБХ РАН, Pichia pastoris GS115 ИБХ РАН, антимикробная активность оценивается по методу ингибирования роста культуры в жидкой среде. Определение минимальных концентраций пептидов, необходимых для полного ингибирования роста микроорганизмов (минимальных ингибирующих концентраций), проводят методом серийных разведений.

Бактерии культивируют в жидкой низкосолевой среде LB (1% бакто-триптон, 0,5% бакто-дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl, pH 7) при 37°С и перемешивании со скоростью 220 об/мин, дрожжи - в жидкой среде YPD (1% бакто-дрожжевой экстракт, 2% бакто-пептон, 2% глюкоза, pH 5,3) при 30°С и перемешивании со скоростью 150 об/мин в течение 18 ч. Полученные культуры разбавляют в 200 раз, используя те же среды, и выращивают в тех же условиях в течение 4 ч до достижения экспоненциальной фазы роста (оптическая плотность культуры при 620 нм OD₆₂₀˜0,3-0,5), после чего снова разбавляют, используя исходные среды, до концентрации клеток порядка 10⁵ колоний образующих единиц (КОЕ) в 1 мл. Культуры помещают в стерильные 96-луночные планшеты, по 90 мкл в лунку, куда затем добавляют по 10 мкл растворов тестируемых веществ различных концентраций, получаемых серийными разведениями. Отрицательным контролем служит культура клеток с добавлением 10 мкл чистой воды, положительным - чистая среда для культивирования. Планшеты инкубируют в условиях, описанных выше, в течение 24 ч для бактериальных культур и 48 ч для дрожжевых, после чего измеряют OD₆₂₀, минимальные ингибирующие концентрации определяют как наименьшие концентрации веществ, полностью подавляющие рост микроорганизмов. Опыт проводят в трех независимых повторах.

Результаты определения минимальных ингибирующих концентраций для латарцинов LtAMP-3а и LtAMP-3b представлены в таблице 3. Биологическая активность синтетических пептидов идентична активности природных.

Таблица 3 Антимикробные свойства латарцинов LtAMP-3а и LtAMP-3b
штамм	минимальная ингибирующая концентрация, мкМ
	LtAMP-3a	LtAMP-3b
А. Грамотрицательные бактерии
Escherichia coli MH1	6	28
Escherichia coli DH5α	2,5	23
Pseudomonas fluorescens B-894	15	60
Б. Грамположительные бактерии
Arthrobacter globiformis BKM 348-10	0,3	0,7
Bacillus subtilis BKM B-504	1,2	2,9
Micrococcus luteus 2065	0,3	0,3
Rhodococcus equi Ac953	0,3	0,3
В. Дрожжевые грибы
Saccharomyces cerevisiae Y190 ИБХ РАН	20	23
Pichia pastoris GS 115 ИБХ РАН	20	23

Пример 7.

Тестирование латарцинов LtAMP-3а и LtAMP-3b на гемолитическую активность.

Гемолитическую активность пептидов определяют с использованием эритроцитов кролика. Свежую кровь получают из краевой вены уха кролика, 2 мл крови собирают в пробирку с 8 мл сбалансированного солевого раствора Хенкса, содержащего гепарин (10 ед/мл). Клетки осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 180-220 g, ресуспендируют в растворе Хенкса до концентрации 1-3×10⁷ кл/мл. Смешивают 10 мкл раствора пептида нужной концентрации с 1 мл полученной суспензии, в качестве отрицательного контроля к суспензии клеток добавляют 10 мкл чистого раствора Хенкса. Инкубируют при 37°С и перемешивании со скоростью 120 об/мин в течение 3 ч, после чего клетки осаждают центрифугированием в течение 3-5 мин при 4000 g. 100 мкл супернатанта отбирают в стерильные 96-луночные планшеты, выход гемоглобина из эритроцитов оценивают по оптической плотности при 414 нм. Гемолитическая активность образцов выражается в % от максимально возможного гемолиза, максимально возможный лизис эритроцитов (положительный контроль) получают за счет ресуспендирования клеток в чистой воде вместо раствора Хенкса также до концентрации 1-3×10⁷ кл/мл.

В результате получают, что латарцины LtAMP-3а и LtAMP-3b гемолитической активностью не обладают, в концентрации 80 мкМ гемолиз составляет 0%.

Пример 8.

Тестирование латарцинов LtAMP-3а и LtAMP-3b на цитотоксичность по отношению к лейкоцитам и клеткам эритролейкемии человека.

Оценку цитотоксических свойств пептидов LtAMP-3a и LtAMP-3b для лейкоцитов человека проводят на фракции крови здорового донора (группа В, Rh+), обогащенной лейкоцитами, которую получают отстаиванием гепаринизированной (10 ед/мл) крови в течение 2 ч. Отбирают фракцию выше эритроцитарного столба, соотношение лейкоцитов и эритроцитов в которой 1:10, клетки помещают в среду RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина и 8% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС), рассаживают в 96-луночные плоскодонные культуральные планшеты (0,3×10⁶ клеток/мл, 150 мкл среды RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-Gln и 8% ЭБС, на лунку).

Клетки эритролейкемии человека К562 культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина и 8% ЭБС при 37°С, 100%-ной влажности в атмосфере с 5%-ным содержанием СО₂. За день до эксперимента клетки рассаживают в 96-луночные планшеты (0,3×10⁶ клеток/мл).

В лунки вносят исследуемые пептиды в нужной концентрации, в качестве отрицательного контроля в лунки добавляют чистую воду. Клетки (К562 и лейкоциты) инкубируют с различными концентрациями пептидов в течение 3 ч при 37°С, затем в лунки вносят флуоресцентные красители Hoechst33342 (10 мкМ, окрашивает ядра всех клеток) и пропидиум иодид (10 мкМ, окрашивает ядра мертвых клеток) и через 10 мин регистрируют флуоресцентные изображения клеток с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 200 M (Zeiss, Германия) с цифровой камерой AxioCam MRc (Zeiss, Германия) в области флуоресценции Hoechst33342 (фильтры на возбуждение - ВР 365/12, на эмиссию - LP 397) и в области флуоресценции пропидиум иодида (фильтры на возбуждение - ВР 510-560, на эмиссию - LP 590). По этим изображениям для каждой концентрации пептида подсчитывают общее число клеток (от 500 до 1000 клеток на одно измерение) и число мертвых клеток среди них, а затем рассчитывают концентрацию пептида, вызывающую гибель 50% клеток, ИК₅₀. Результаты (см. фиг.4) усредняют по трем независимым экспериментам.

В результате получают, что латарцины LtAMP-3а и LtAMP-3b обладают выраженной цитотоксичностью в отношении клеток эритролейкемии человека, ИК₅₀=11 мкМ (LtAMP-3а) и 24 мкМ (LtAMP-3b). Вместе с тем пептиды слабо токсичны по отношению к нормальным лейкоцитам человека, ИК₅₀˜100 мкМ (LtAMP-3а) и 105 мкМ (LtAMP-3b). Кроме того, препараты лейкоцитов человека содержат эритроциты, токсический эффект по отношению к которым в исследуемых концентрациях пептидов не наблюдается. Таким образом, латарцины LtAMP-3а и LtAMP-3b могут служить основой для создания эффективных противоопухолевых препаратов.

Пептид латарцин, проявляющий антимикробную активность, имеющий следующую аминокислотную последовательность:

H₂N-Ser¹-Trp²-X³-Ser⁴-Met⁵-Ala⁶-Lys⁷-Lys⁸-Leu⁹-Lys¹⁰-Glu¹¹-Tyr¹²-Met¹³-Glu¹⁴-Lys¹⁵-Leu¹⁶-Lys¹⁷-Gln¹⁸-Arg¹⁹-Ala²⁰-NH₂,

где Х - остаток лизина Lys³ или аланина Ala³.