Применение эритропоэтина

Настоящее изобретение относится к использованию эритропоэтина и его аналогов (дарбепоэтин альфа, модифицированный эритропоэтин, гликозилированный эритропоэтин, конъюгированный с полиэтиленгликолем) для лечения нарушений распределения железа при диабете, к соответствующему способу лечения и к лекарственному средству того же назначения. Показано, что страдающие диабетом пациенты имеют высокую предрасположенность к нарушениям распределения железа при том, что общая концентрация железа в организме является нормальной. Подкожное введение эритропоэтина «Рекормон» в дозе 150 ед./кг подавляет это нарушение. 3 н. и 14 з.п. ф-лы, 2 ил.

 

Настоящее изобретение относится к новому применению эритропоэтина, в частности к лечению нарушений распределения железа при диабете.

Известны различные заболевания, при которых метаболизм железа выходит из нормы. При анемии может образовываться недостаточно крови вследствие общего недостатка железа в организме. Другим метаболическим состоянием, связанным с железом, является гемохроматоз, при котором общая концентрация железа в организме превышает норму, что приводит к различным состояниям, таким как, например, деструкция органов.

Нарушения распределения железа отличаются от вышеописанной анемии и гемохроматоза, поскольку общая концентрация железа в организме является нормальной. С одной стороны, железо накапливается в различных органах и может привести к повреждениям, и даже деструкции данных органов. С другой стороны, использование железа, которое присутствует в нормальных количествах при образовании крови, нарушается, приводя к вторичным эффектам, которые сравнимы с эффектами, связанными с анемией.

До настоящего времени не было известно, что пациенты, страдающие диабетом, имеют высокую вероятность предрасположенности к нарушениям распределения железа. Нарушения распределения железа могут быть диагностированы по различным параметрам, которые обычно используются при диагностике состояния железа. Основываясь на измерениях ферритина и растворимого трансферринового рецептора, можно оценить, является ли нормальной общая концентрация железа у диабетического больного. Если это наблюдается, то пониженная концентрация гемоглобина в ретикулоцитах является показателем нарушений распределения железа. Другой показатель представляет собой постоянно/длительно повышенную концентрацию С-реактивного белка (СРБ) у пациентов, страдающих диабетом и демонстрирующих нормальную общую концентрацию железа. Способ диагностики нарушений распределения железа описан в работе Р.Lehmann, М.Volkmann, J.Lotz, A.Baldauf, R.Roeddiger, постер, представленный на Ежегодном собрании AACC/CSCC, 29 июля - 2 августа 2001 г., Чикаго, Иллинойс.

До настоящего времени для диабетических пациентов, страдающих от нарушений распределения железа, все еще не предлагалось никакого лечения. Вследствие этого проблемой, лежащей в основе настоящего изобретения, является обеспечение лечения нарушений распределения железа при диабете с целью минимизации или подавления вышеуказанных неблагоприятных событий. Неожиданно было обнаружено, что эритропоэтин обладает положительным действием на нарушения распределения железа при диабете. Вследствие этого проблема решается согласно настоящему изобретению путем получения эритропоэтина для применения при лечении нарушений распределения железа при диабете.

Пока не указано иначе, для иллюстрации и определения значения и объема различных терминов, использованных для описания изобретения в данном контексте, приведены следующие определения.

Термин "низший алкил", как используют в данном контексте, означает линейную или разветвленную алкильную группу, имеющую от одного до шести атомов углерода. Примеры низших алкильных групп включают метил, этил и изопропил, предпочтительно метил.

Термин "низшая алкоксигруппа", как используют в данном контексте, означает группу R'-O-, где R' представляет собой низший алкил, как описано выше.

Термин "нарушения распределения железа при диабете" относится к нарушению распределения железа, которое происходит у пациентов, страдающих диабетом. Нарушение распределения железа может, например, быть охарактеризовано, как описано выше. В частности, нарушение распределения железа характеризуется следующими параметрами: концентрация растворимого трансферринового рецептора [мг/л], деленная на log (концентрации ферритина [мг/л]) меньше 3,5 и одновременно концентрация С-реактивного белка выше 5 мг/л.

Термин "эритропоэтин" или "белок эритропоэтина" относится к белку с биологической активностью in vivo, вызывающей повышение продукции ретикулоцитов и красных клеток крови в клетках костного мозга, и выбранному из группы, состоящей из человеческого эритропоэтина и аналогов, которые определены ниже.

Термин "пегилированный эритропоэтин (Пэг-ЭПО или ПЭГ-ЭПО) относится к белку эритропоэтина, который ковалентно связан с одним-тремя производными полиэтилена, как описано ниже.

Описание чертежей

Фигура 1: Первичная структура человеческого ЭПО (165 аминокислот) (SEQ ID NO:1).

Фигура 2: Первичная структура человеческого ЭПО (166 аминокислот) (SEQ ID NO:2).

Более детально настоящее изобретение относится к применению эритропоэтина для получения лекарственного средства для лечения нарушений распределения железа при диабете. В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к применению, как описано выше, когда диабет представляет собой неинсулинзависимый сахарный диабет.

Настоящее изобретение особенно эффективно в плане получения фармацевтических композиций, содержащих эритропоэтин в качестве активного ингредиента. Термин "эритропоэтин" или "белок эритропоэтина" или "ЭПО" представляют собой следующее: термины, в частности, относятся к гликопротеину, например, человеческому эритропоэтину, например, имеющему последовательность аминокислот, представленную в (SEQ ID NO:1) или (SEQ ID NO:2), или последовательность аминокислот, в значительной степени гомологичную указанным, биологические свойства которых связаны со стимуляцией продукции красных клеток крови и стимуляцией деления и дифференцировки коммитированных эритроидных предшественников в костном мозге. Как используют в данном контексте, данные термины включают такие белки, модифицированные определенным образом, как, например, путем сайт-направленного мутагенеза, или случайным образом посредством мутаций. Данные термины включают также аналоги, имеющие от 1 до 6 дополнительных центров гликозилирования, аналоги, имеющие по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту на карбокситерминальном конце гликопротеина, причем дополнительная аминокислота включает по меньшей мере один центр гликозилирования, и аналоги, имеющие последовательность аминокислот, которая включает реаранжировку по меньшей мере одного центра гликозилирования. Данные термины включают оба как природный, так и полученный рекомбинантным путем, человеческий эритропоэтин. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения белок эритропоэтина представляет собой человеческий эритропоэтин.

Как детально представлено ниже, получение и очистка ЭПО хорошо известны в области техники. Термином эритропоэтин обозначают природный или рекомбинантный белок, предпочтительно человеческий, например эпоэтин α или эпоэтин β, как получают из любого традиционного источника, такого как ткани, синтез белка, клеточная культура с природными или рекомбинантными клетками. Охватывается любой белок, обладающий активностью эритропоэтина, такой как мутеины или иным образом модифицированные белки. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения белок эритропоэтина представляет собой эпоэтин α или эпоэтин β. Рекомбинантный ЭПО может быть получен посредством экспрессии в клеточных линиях СНО, ВНК или HeLa при использовании технологии рекомбинантной ДНК или путем активации эндогенного гена. Экспрессия белков, включая активацию эндогенного гена, хорошо известна в области техники и описана, например, в Патентах США №№5733761, 5641670 и 5733746 и Международных патентных публикациях №№ WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 и WO 91/09955, содержание каждой из которых включено в данном контексте в виде ссылки. Предпочтительным является применение, как описано выше, когда белок эритропоэтина экспрессируется посредством активации эндогенного гена. Предпочтительные молекулы ЭПО для получения продуктов гликопротеина эритропоэтина представляют собой молекулы человеческого ЭПО. Более предпочтительно, когда молекулы ЭПО являются человеческим ЭПО, имеющим последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, более предпочтительно последовательность аминокислот SEQ ID NO:1. Вследствие этого предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению, как описано выше, причем белок эритропоэтина имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2.

Кроме того, эритропоэтин может быть гликопротеиновым аналогом, имеющим от 1 до 6 дополнительных центров гликозилирования. Вследствие этого настоящее изобретение относится также к применению, как описано выше, при котором белок эритропоэтина имеет последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированную введением от 1 до 6 центров гликозилирования. Гликозилирование белка одной или более олигосахаридных групп происходит в определенных положениях на протяжении полипептидного скелета и сильно влияет на физические свойства белка, такие как стабильность белка, секреция, субклеточная локализация и биологическая активность. Как правило, гликозилирование бывает двух типов. O-связанные олигосахариды присоединяются к остаткам серина или треонина, и N-связанные олигосахариды присоединяются к остаткам аспарагина. Один тип олигосахарида, обнаруженный на обоих, N-связанном и O-связанном, олигосахаридах, представляет собой N-ацетилнейраминовую кислоту (сиаловую кислоту), которая составляет семейство аминосахаров, содержащих 9 или более атомов углерода. Сиаловая кислота, как правило, является концевым остатком на обоих, N-связанном и O-связанном, олигосахаридах и, поскольку она несет отрицательный заряд, обусловливает кислотные свойства гликопротеина. Человеческий эритропоэтин, имеющий 165 аминокислот, включает три N-связанные и одну O-связанную олигосахаридные цепи, которые составляют приблизительно 40% общей молекулярной массы гликопротеина. N-связанное гликозилирование происходит по остаткам аспарагина, находящимся в положениях 24, 38 и 83, и O-связанное гликозилирование происходит по остатку серина, находящемуся в положении 126. Олигосахаридные цепи модифицируют концевыми остатками сиаловой кислоты. Ферментативное удаление всех остатков сиаловой кислоты из гликозилированного эритропоэтина приводит в результате к потере активности in vivo, но не in vitro, поскольку сиалилирование эритропоэтина препятствует его связыванию и последующему выведению связывающим белком печени.

Термин "эритропоэтин" включает аналоги человеческого эритропоэтина с одним или более изменений в последовательности аминокислот человеческого эритропоэтина, которые в результате приводят к увеличению числа центров присоединения сиаловой кислоты. Данные гликопротеиновые аналоги могут быть получены посредством сайт-направленного мутагенеза, включающего добавления, делеции или замены остатков аминокислот, которые увеличивают число или изменяют центры, которые доступны для гликозилирования. Гликопротеиновые аналоги, имеющие уровни сиаловой кислоты, превышающие таковые, обнаруженные в человеческом эритропоэтине, генерируют введением центров гликозилирования, которые не нарушают вторичную или третичную конформацию, необходимую для биологической активности. Гликопротеины, соответствующие настоящему изобретению, включают также аналоги, имеющие повышенный уровень присоединения углеводов в центре гликозилирования, которые обычно включают замену одной или более аминокислот в непосредственной близости к N-связанному или O-связанному центру. Гликопротеины, соответствующие настоящему изобретению, включают также аналоги, имеющие одну или более аминокислот, выходящих из карбокситерминального конца эритропоэтина и дающих по меньшей мере один дополнительный углеводный центр. Белки эритропоэтина настоящей композиции включают также аналоги, имеющие последовательность аминокислот, которая включает реаранжировку по меньшей мере одного центра гликозилирования. Такая реаранжировка центра гликозилирования включает делецию одного или более центров гликозилирования в человеческом эритропоэтине и введение одного или более неприродных центров гликозилирования. Увеличение числа углеводных цепей на эритропоэтине и, вследствие этого, числа сиаловых кислот/молекулы эритропоэтина может внести положительные свойства, такие как повышенная растворимость, более сильная устойчивость к протеолизу, пониженная иммуногенность, увеличенный период полувыведения из сыворотки и повышенная биологическая активность. Аналоги эритропоэтина с дополнительными центрами гликозилирования более подробно описаны в Европейской патентной заявке 640619, выданной Elliot, опубликованной 1 марта 1995 г.

В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция, соответствующая настоящему изобретению, включает белки эритропоэтина с последовательностью аминокислот, которая включает по меньшей мере один дополнительный центр гликозилирования, такие как, но без ограничения перечисленным, эритропоэтины, содержащие последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированную посредством модификации, выбранной из следующих:

Asn³⁰Thr³²;

Asn⁵¹Thr⁵³,

Asn⁵⁷Thr⁵⁹

Asn⁶⁹;

Asn⁶⁹Thr⁷¹;

Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹

Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²;

Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²;

Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;

Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹;

Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹;

Asn¹³⁶Thr¹³⁸;

Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰;

Thr¹²⁵ и

Pro¹²⁴Thr¹²⁵.

Условное изображение, используемое в данном контексте для модификации последовательности аминокислот, означает, что положение(я) соответствующего немодифицированного белка (например, чЭПО (человеческого ЭПО) SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2), указанное надстрочным числом(ами), заменено аминокислотой(ами), обозначение которой непосредственно предшествует соответствующему надстрочному числу(ам).

Белок эритропоэтина может также быть аналогом, имеющим по меньшей мере одну дополнительную аминокислоту на карбокситерминальном конце гликопротеина, причем дополнительная аминокислота включает по меньшей мере один центр гликозилирования. Дополнительная аминокислота может включать пептидный фрагмент, выделенный из карбокситерминального конца человеческого хорионического гонадотропина. Предпочтительно, когда аналог, выбран из группы, состоящей из (а) человеческого эритропоэтина, имеющего последовательность аминокислот Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro lle Leu Pro Gln, начиная от карбоксиконца, (б) аналога (а), далее содержащего Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ ЭПО, и (в) аналога (а), далее содержащего Asn³⁰ Thr³² Val⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ ЭПО.

Белок эритропоэтина может также быть аналогом, имеющим последовательность аминокислот, которая включает реаранжировку по меньшей мере одного центра гликозилирования. Реаранжировка может включать делецию любого из N-связанных углеводных центров в человеческом эритропоэтине и введение N-связанного углеводного центра в положение 88 последовательности аминокислот человеческого эритропоэтина. Предпочтительно, когда гликопротеин представляет собой аналог, выбранный из группы, состоящей из Gln²⁴ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ ЭПО, Gln³⁸ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ ЭПО и Gln⁸³ Ser⁸⁷ Asn⁸⁸ Thr⁹⁰ ЭПО. Следующий аналог представляет собой дарбепоэтин α. Предпочтительным эритропоэтином для вышеописанного применения является дарбепоэтин α.

В частности, белок эритропоэтина, соответствующий настоящей фармацевтической композиции, как описано выше, может также включать его пегилированные производные. Пегилированные производные эритропоэтина и их получение известны в области техники и описаны, например, в патентных заявках WO 01/02017, ЕР-А-1064951, ЕР-А-539167, ЕР-А-605963, WO 93/25212, WO 94/20069, WO 95/11924, патенте US №556, EP-A-584876, WO 92/16555, WO 94/28024, WO 97/04796, патентах США №№5359030 и 5681811, патенте US №4179337, японском патенте, WO 98/32466, патенте US №5,324,650. Предпочтительно, когда в вышеописанном применении белок эритропоэтина пегилирован. Предпочтительный вариант осуществления молекулы пегилированного эритропоэтина относится к производным, как описано ниже.

В соответствии с этим настоящее изобретение относится также к вышеописанному применению, при котором белок эритропоэтина представляет собой конъюгат, который включает вышеописанный белок эритропоэтина, имеющий по меньшей мере одну свободную аминогруппу и обладающий in vivo биологической активностью, вызывающей повышение продукции ретикулоцитов и красных клеток крови в клетках костного мозга, и выбранный из группы, состоящей из человеческого эритропоэтина и его аналогов, которые имеют последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированного введением от 1 до 6 центров гликозилирования или реаранжировкой по меньшей мере одного центра гликозилирования; указанный эритропоэтин ковалентно связан с n групп полиэтиленгликоля формулы -CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR, причем -СО (т.е. карбонил) каждой группы полиэтиленгликоля образует амидную связь с одной из указанных аминогрупп, где R означает низший алкил; х составляет 2 или 3; m составляет от приблизительно 450 до приблизительно 900; n составляет от 1 до 3; при этом n и m выбраны таким образом, что молекулярная масса конъюгата за исключением гликопротеина эритропоэтина составляет от 20 килодальтон до 100 килодальтон. Кроме того, данное изобретение представляет фармацевтические композиции, включающие конъюгаты, описанные в данном контексте, в которых доля конъюгатов, где n равно 1, составляет по меньшей мере девяносто процентов, предпочтительно по меньшей мере девяносто два процента, более предпочтительно девяносто шесть процентов от всех конъюгатов композиции.

В частности, вышеописанные конъюгаты могут быть представлены формулой (I)

в которой Р представляет собой остаток белка эритропоэтина, как описано в данном контексте (т.е. за исключением аминогруппы или аминогрупп, которые формируют амидную связь с карбонилом, представленным в формуле I), обладающий in vivo биологической активностью, вызывающей повышение продукции ретикулоцитов и красных клеток крови в клетках костного мозга, и в котором R означает низший алкил х составляет 2 или 3; m составляет от приблизительно 450 до приблизительно 900; n составляет от 1 до 3; при этом n и m выбраны таким образом, что молекулярная масса конъюгата за исключением гликопротеина эритропоэтина составляет от 20 килодальтон до 100 килодальтон. В соответствии с данным изобретением R представляет собой низший алкил. Предпочтительны конъюгаты, в которых R представляет собой метил.

Обозначение "m" представляет собой число этиленоксидных остатков (ОСН₂СН₂) в группе полиэтиленоксида. Одна этиленоксидная субъединица ПЭГ (полиэтиленгликоля) имеет молекулярную массу приблизительно 44 дальтона. Таким образом молекулярная масса конъюгата (за исключением молекулярной массы ЭПО) зависит от числа "m". В конъюгатах, соответствующих настоящему изобретению, "m" составляет от приблизительно 450 до приблизительно 900 (в соответствии с молекулярной массой от приблизительно 20 кД до приблизительно 40 кД), предпочтительно от приблизительно 650 до приблизительно 750 (в соответствии с молекулярной массой приблизительно 30 кД). Число m выбирают таким образом, чтобы полученный в результате конъюгат, соответствующий изобретению, имел физиологическую активность, сравнимую с немодифицированным ЭПО, причем данная активность может представлять собой такую же, превышающую или часть соответствующей активности немодифицированного ЭПО. Молекулярная масса "приблизительно" определенной величины означает, что она находится в приемлемом интервале данной величины, как определено с помощью принятых аналитических методик. Число "m" выбрано таким образом, что молекулярная масса каждой группы полиэтиленгликоля, ковалентно связанной с гликопротеином эритропоэтина, составляет от приблизительно 20 кД до приблизительно 40 кД и предпочтительно составляет приблизительно 30 кД.

В конъюгатах, соответствующих настоящему изобретению, число "n" представляет собой число групп полиэтиленгликоля, ковалентно связанных со свободными аминогруппами (включая ε-аминогруппы аминокислоты лизина и/или аминоконцевую аминогруппу) белка эритропоэтина посредством амидной связи(ей). Конъюгат, соответствующий изобретению, может иметь одну, две или три группы ПЭГ/молекулу ЭПО, "n" представляет собой целое число, лежащее в интервале от 1 до 3, предпочтительно, когда "n" составляет 1 или 2, и более предпочтительно, когда "n" означает 1. Предпочтительный конъюгат из вышеописанных конъюгатов содержит соединения, в которых х означает 2, m означает 650-750, n означает 1 и R означает метил.

Соединение формулы (I) может быть получено из известного полимерного материала:

в котором R и m такие, как описано выше, путем конденсации соединения формулы II с гликопротеином эритропоэтина. Соединения формулы (II), в которых х означает 3, представляют собой сукцинимидиловые сложные эфиры α-низший алкокси-масляной кислоты полиэтиленгликоля (низший алкокси-ПЭГ-СМК). Соединения формулы (II), в которых х означает 2, представляют собой сукцинимидиловые сложные эфиры α-низший алкокси-пропионовой кислоты полиэтиленгликоля (низший алкокси-ПЭГ-СПК). Для образования амида может быть использован любой известный способ реакции активированного сложного эфира с амином. В вышеописанной реакции приведенный в качестве примера сукцинимидиловый сложный эфир представляет собой отщепляемую группу, вызывающую образование амида. Использование сукцинимидиловых сложных эфиров, таких как соединения формулы II, для получения конъюгатов с белками раскрыто в патенте US №5672662, выданном 30 сентября 1997 г. (Harris, et al.).

Человеческий ЭПО содержит девять свободных аминогрупп, аминоконцевую аминогруппу и ε-аминогруппы 8 остатков лизина. При комбинировании пегилирующего реагента с соединением СМК формулы II было обнаружено, что при рН 7,5, соотношении белок: ПЭГ 1:3 и температуре реакции 20-25°С образуется смесь моно-, ди- и следовых количеств три-пегилированных молекул. Когда пегилирующим реагентом было соединение СПК формулы II, в аналогичных условиях за исключением того, что соотношение белок: ПЭГ составляло 1:2, образовывались в основном монопегилированные молекулы. Пегилированный ЭПО может быть использован в виде смеси или в виде различных пегилированных молекул, разделенных с помощью катионообменной хроматографии. Посредством манипулирования условиями реакции (например, соотношением реагентов, значением рН, температурой, концентрацией белка, временем реакции и т.п.) можно варьировать относительные количества различных пегилированных молекул.

Следующий предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению, как описано выше, в котором белок эритропоэтина представляет собой конъюгат, который включает белок эритропоэтина, как описано выше, имеющий по меньшей мере одну свободную аминогруппу и обладающий in vivo биологической активностью, вызывающей повышение продукции ретикулоцитов и красных клеток крови в клетках костного мозга, и выбранный из группы, состоящей из белка человеческого эритропоэтина и его аналогов, которые имеют первичную структуру белка человеческого эритропоэтина, модифицированного введением от 1 до 6 центров гликозилирования, указанный белок эритропоэтина ковалентно связан с одной-тремя группами низший алкил-полиэтиленгликоля, причем каждая группа полиэтиленгликоля ковалентно связана с белком эритропоэтина посредством линкера формулы -C(O)-X-S-Y-, где С(O) линкера формирует амидную связь с одной из указанных аминогрупп, Х представляет собой -(СН₂)_k- или -СН₂(O-CH₂-CH₂)_k-, k составляет от 1 до 10, Y представляет собой

средняя молекулярная масса каждой молекулы полиэтиленгликоля составляет от приблизительно 20 килодальтон до приблизительно 40 килодальтон и молекулярная масса конъюгата составляет от приблизительно 51 килодальтона до приблизительно 175 килодальтон.

Данная молекула эритропоэтина может быть также представлена формулой (III)

в которой R может представлять собой любой низший алкил. Предпочтительным низшим алкилом является метил. Х может представлять собой -(СН₂)_k- или -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-, где k составляет от 1 до приблизительно 10. Предпочтительно, когда k составляет от 1 до приблизительно 4, более предпочтительно, когда k составляет 1 или 2. Наиболее предпочтительно, когда Х представляет собой -(СН₂).

В формуле 1 Y представляет собой

предпочтительно

более предпочтительно

В формуле (III) число m выбирают таким образом, чтобы полученный в результате конъюгат формулы (III) обладал физиологической активностью, сравнимой с немодифицированным ЭПО, причем данная активность может представлять собой такую же, превышающую или часть соответствующей активности немодифицированного ЭПО. m означает число остатков этиленоксида в единице ПЭГ. Одна субъединица ПЭГ -(OCH₂CH₂)- имеет молекулярную массу приблизительно 44 дальтона. Таким образом молекулярная масса конъюгата (за исключением молекулярной массы ЭПО) зависит от числа m. Молекулярная масса "приблизительно" определенной величины означает, что она находится в приемлемом интервале данной величины, как определено с помощью принятых аналитических методик, m представляет собой целое число, лежащее в интервале от приблизительно 450 до приблизительно 900 (в соответствии с молекулярной массой от 20 кД до 40 кД), предпочтительно m составляет от приблизительно 550 до приблизительно 800 (приблизительно 24-35 кД) и наиболее предпочтительно m составляет от приблизительно 650 до приблизительно 700 (приблизительно от 29 до приблизительно 31 кД).

В формуле (III) число n означает число ε-аминогрупп аминокислоты лизина в белке эритропоэтина, ковалентно связанного с единицей ПЭГ посредством амидной связи. Конъюгат, соответствующий настоящему изобретению, может иметь одну, две или три единицы ПЭГ/молекулу ЭПО, n представляет собой целое число, лежащее в интервале от 1 до 3, предпочтительно, когда n составляет 1 или 2, и более предпочтительно, когда n представляет собой 1.

Предпочтительные белки эритропоэтина формулы (III) представлены формулами:

В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения конъюгат эритропоэтина представлен формулой:

где в вышеприведенной формуле n представляет собой целое число от 1 до 3, m представляет собой целое число от 450 до 900; R означает низший алкил; Х означает -(CH₂)_k- или -СН₂(О-СН₂-СН₂)_k-, и Р представляет собой остаток белка эритропоэтина без аминогруппы или групп, которые формируют амидную связь с Х.

Другие предпочтительные продукты гликопротеина эритропоэтина представлены формулами:

Более предпочтительные продукты гликопротеина эритропоэтина представлены формулой:

Данные продукты эритропоэтина могут быть получены путем

а) ковалентной реакции ε-аминогруппы аминокислоты лизина белка эритропоэтина, представленной формулой P-[NH₂]_n, с бифункциональным реагентом, представленным формулой Z-CO-X-S-Q, с образованием промежуточного продукта с амидной связью, представленным формулой:

P-[NH-CO-X-S-Q]_n,

в которой Р представляет собой белок эритропоэтина за исключением аминогруппы, которая образует амидную связь, n означает целое число, лежащее в интервале от 1 до 3; Z представляет собой реакционную группу, например, карбоновый-NHS сложный эфир; Х означает -(CH₂)_k- или -СН₂(О-СН₂-СН₂)_k-, где k составляет от 1 до приблизительно 10, и Q означает защитную группу, подобную алканоилу, например, ацетил.

(б) ковалентной реакции промежуточного продукта с амидной связью, полученного на стадии (а), с активированным производным пролиэтиленгликоля, представленного формулой W-[OCH₂CH₂]_m-OR с образованием продукта гликопротеина эритропоэтина, представленного формулой:

в которой W представляет собой сульфгидрильную реакционную форму Y; m представляет собой целое число, лежащее в интервале от приблизительно 450 до приблизительно 900; R означает низший алкил и Y, как определено выше.

В данном варианте осуществления бифункциональный реагент предпочтительно представляет собой N-сукцинимидил-S-ацетилтиопропионат или N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат, Z предпочтительно означает N-гидроксисукцинимид и активированное производное полиэтиленгликоля W-[OCH₂CH₂]_m-OR предпочтительно выбрано из группы, состоящей из йодацетилметокси-ПЭГ, метокси-ПЭГ-винилсульфона и метокси-ПЭГ-малеимида.

Более детально белки эритропоэтина формулы (III) могут быть получены посредством ковалентного связывания тиоловых групп с ЭПО ("активация") и связывания полученного в результате активированного ЭПО с производным полиэтиленгликоля (ПЭГ). Первая стадия получения пегилированного ЭПО в соответствии с настоящим изобретением включает ковалентное связывание тиоловых групп посредством NH₂-групп ЭПО. Данную активацию ЭПО проводят с использованием бифункциональных реагентов, которые несут защищенную тиоловую группу, и дополнительной реакционной группы, такой как активные сложные эфиры (например, сукцинимидиловый сложный эфир), ангидриды, сложные эфиры сульфоновых кислот, галогениды карбоновых кислот и сульфоновые кислоты, соответственно. Тиоловую группу защищают группами, известными в области техники, например, ацетильными группами. Данные бифункциональные агенты способны реагировать с ε-аминогруппами аминокислот лизина путем формирования амидной связи. Первая стадия реакции приведена ниже:

ЭПО, n и Х такие, как определено выше, и Z означает реакционную группу, известную в области техники, например, N-гидоксисукцинимидный (NГС) заместитель формулы

В предпочтительном варианте осуществления активацию ε-аминогрупп лизина осуществляют реакцией с бифункциональными реагентами, имеющими сукцинимидиловую структуру. Бифункциональные реагенты могут нести различные спейсерные группы, например, группы -(СН₂)_k- или -СН₂-(O-СН₂-CH₂-)_k-. в которых k составляет от 1 до приблизительно 10, предпочтительно от 1 до приблизительно 4 и более предпочтительно 1 или 2, и наиболее предпочтительно 1. Примерами данных реагентов являются N-сукцинимидил-S-ацетилтиопропионат (САТП) и N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат (САТА).

Получение бифункциональных реагентов известно в области техники. Предшественники 2-(ацетилтио)-(этокси)_k-уксусная кислота-NГС-сложных эфиров описаны в DE-3924705, тогда как дериватизация ацетилтиосоединения описана в статье March, J., Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375-376. САТА коммерчески доступен (Molecular Probes, Eugene, OR, USA и Pierce, Rockford, IL).

Число тиоловых групп, которые необходимо ввести в молекулу ЭПО, можно выбрать путем регуляции параметров реакции, т.е. концентрации белка (ЭПО) и соотношения белок/бифункциональный агент. Предпочтительно, когда ЭПО активируют ковалентным связыванием от 1 до 5 тиоловых групп/молекулу ЭПО, более предпочтительно от 1,5 до 3 тиоловых групп/молекулу ЭПО. Данные интервалы относятся к статистическому распределению тиоловой группы в популяции белка ЭПО.

Реакцию проводят, например, в водном буферном растворе при рН 6,5-8,0, например, в 10 мМ фосфата калия, 50 мМ NaCl, рН 7,3. Бифункциональный агент может быть введен в ДМСО (диметилсульфоксиде). После завершения реакции, предпочтительно через 30 мин, реакцию останавливают добавлением лизина. Избыток бифункционального агента можно отделить способом, известным в области техники, например, посредством диализа или колоночной фильтрации. Среднее число тиоловых групп, введенных в ЭПО, можно определить фотометрическими методами, описанными, например, в статье Grasetti, D.R. и Murray, J.F. в J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, 41-49 (1967).

После вышеуказанной реакции следует ковалентное связывание активированного производного полиэтиленгликоля (ПЭГ). Подходящие производные ПЭГ представляют собой активированные молекулы ПЭГ со средней молекулярной массой от приблизительно 20 до приблизительно 40 кД, более предпочтительно от приблизительно 24 до приблизительно 35 кД и наиболее предпочтительно приблизительно 30 кД.

Активированные производные ПЭГ известны в области техники и описаны, например, в статье Morpurgo, M. et al. J. Bioconj. Chem. (1996) 7, стр.363 ff для ПЭГ-винилсульфона. Молекулы ПЭГ с линейной цепью и разветвленной цепью подходят для получения соединений формулы I. Примеры реакционных реагентов ПЭГ включают йод-ацетилметокси-ПЭГ и метокси-ПЭГ-винилсульфон:

Применение данных йод-активированных субстанций известно в области техники и описано, например, в монографии Hermanson, G.Т. Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996), p.147-148.

Наиболее предпочтительно, когда молекулы ПЭГ активируют малеимидом при использовании низшего алкококси-ПЭГ-малеимида, например, метокси-ПЭГ-малеимида (молекулярная масса 30000; Shearwater Polymers, Inc.). Структура низший алкокоси-ПЭГ-малеимида является следующей:

при R и m, как описано выше, предпочтительно

Реакция связывания с низшим алкокси-ПЭГ-малеимидом проходит после расщепления in situ тиоловой защитной группы в водном буферном растворе, например, 10 мМ фосфат калия, 50 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), рН 6,2. Отщепление защитной группы может быть проведено, например, с помощью гидроксиламина в ДМСО при температуре 25°С, рН 6,2 в течение приблизительно 90 мин. Для ПЭГ-модификации молярное соотношение активированный ЭПО/низший алкокси-ПЭГ-малеимид должно составлять от приблизительно 1:3 до приблизительно 1:6 и предпочтительно 1:4. Реакцию можно остановить добавлением цистеина, и реакция оставшихся тиоловых (-SH) групп с N-метилмалеимидом или другими соответствующими соединениями способна формировать дисульфидные связи. Вследствие реакции любых оставшихся активных тиоловых групп с защитной группой, такой как N-метилмалеимид, или другой подходящей защитной группой гликопротеины ЭПО в конъюгатах, соответствующих изобретению, могут включать такие защитные группы. В основном процедура, описанная в данном контексте, будет приводить к образованию смеси молекул, имеющих различное число тиолов, защищенных различным числом защитных групп в зависимости от числа активированных тиоловых групп на гликопротеине, которые не конъюгированы с ПЭГ-малеимидом.

В то время как N-метилмалеимид образует один и тот же тип ковалентной связи при использовании для блокирования оставшихся тиоловых групп на пегилированном белке, дисульфидные соединения будут приводить в реакции межмолекулярного обмена сульфид/дисульфид к связыванию блокирующего реагента дисульфидным мостиком. Предпочтительными блокирующими реагентами для данного типа реакции блокирования являются окисленный глутатион (GSSG), цистеин и цистамин. В то время как вместе с цистеином в пегилированный белок не вводится дополнительный сетевой заряд, использование блокирующих реагентов GSSG или цистамина в результате дает дополнительный отрицательный или положительный заряд.

Дальнейшая очистка соединений формулы (III), включающая разделение моно-, ди- и трипегилированных молекул ЭПО, может быть осуществлена методами, известными в области техники, например, колоночной хроматографией.

Пегилированные производные эритропоэтина предпочтительно включают по меньшей мере девяносто процентов моно-ПЭГ конъюгатов. Как правило, требуются моно-ПЭГ конъюгаты гликопротеинов эритропоэтина, поскольку они имеют тенденцию к более высокой активности, чем ди-ПЭГ конъюгаты. Долю моно-ПЭГ конъюгатов, а также соотношение моно- и ди-ПЭГ молекул можно контролировать посредством объединения более широких фракций вокруг пика элюции для уменьшения доли моно-ПЭГ или более узких фракций для увеличения доли моно-ПЭГ в композиции. Приблизительно девяносто процентов моно-ПЭГ конъюгатов составляет хороший баланс выхода и активности. В некоторых случаях могут потребоваться композиции, в которых, например, по меньшей мере девяносто два процента или по меньшей мере девяносто шесть процентов конъюгатов представляют собой молекулы моно-ПЭГ (n равно 1). В варианте осуществления настоящего изобретения доля конъюгатов, в которых n означает 1, составляет от девяноста процентов до девяноста шести процентов.

Фармацевтические композиции, включающие пегилированный эритропоэтин, известны в области техники и описаны, например, в Международной патентной заявке WO 01/87329. Композиции могут включать 10-10000 мкг белка эритропоэтина/мл, как определено выше. Предпочтительно, когда композиции содержат 10-1000 мкг, например, 10, 50, 100, 400, 800 или 2500 мкг/мл. Кроме того, композиции могут включать от 10 мкг до 10000 мкг белка эритропоэтина/мл, 10-200 ммоль/л сульфата, 10-50 ммоль/л фосфата, рН 6,0-6,5. Данная композиция может также включать до 20 мМ метионин, 1-5% полиола (мас./об.), до 0,1% плуроник F68 (мас./об.) и необязательно до 1 мМ CaCl₂. Пример данной композиции включает от 10 мкг до 10000 мкг белка эритропоэтина/мл, 40 ммоль/л сульфата, 10 ммоль/л фосфата, 3% маннита (мас./об.), 10 мМ метионин, 0,01% плуроник F68 (мас./об.), рН 6,2. Альтернативно композиция может включать от 10 мкг до 10000 мкг белка эритропоэтина/мл, 10-100 ммоль/л NaCI, 10-50 ммоль/л фосфата рН 6,0-7,0, необязательно 1-5% (мас./об.) полиола. Кроме того, данная композиция может включать до 20 мМ метионин, до 0,1% плуроник F68 (мас./об.) и необязательно 7,5 мкмоль/л CaCl₂. В частности, данная композиция может включать от 10 мкг до 10000 мкг белка эритропоэтина/мл, 100 ммоль/л NaCl, 10 мМ метионин, 0,01% плуроник F68 (мас./об.) и 10 ммоль/л фосфата, рН 7,0.

Настоящее изобретение относится также к вышеописанной композиции, включающей от 10 мкг до 10000 мкг белка эритропоэтина/мл, 10-50 ммоль/л аргинина, рН 6 до рН 6,5, 10-100 ммоль/л сульфата натрия. Кроме того, данная композиция может включать до 20 мМ метионин, до 0,1% плуроник F68 (мас./об.), необязательно до 1 ммоль/л CaCl₂ и необязательно 1-5% (мас./об.) полиола. В частности, данная композиция может включать от 10 мкг до 10000 мкг белка эритропоэтина/мл, 40 ммоль/л аргинина, рН 6,2, 30 ммоль/л сульфата натрия, 3% маннита (мас./об.), 10 мМ метионин, 0,01% плуроник F68 (мас./об.) и необязательно 1 ммоль/л CaCl₂.

Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к композициям, включающим 10-10000 мкг/мл эритропоэтина, предпочтительно 25-2500 мкг/мл эритропоэтина, и

а) 10 мМ фосфат натрия/калия, 100 мМ NaCl, рН 7,0 или

б) 10 мМ фосфат натрия, 120 мМ сульфат натрия, рН 6,2 или

в) 10 мМ фосфат натрия, 40 мМ сульфат натрия, 3% маннита (мас./об.), рН 6,2 или

г) 10 мМ фосфат натрия, 40 мМ сульфат натрия, 3% маннита (мас./об.), 10 мМ метионин, 0,01% плуроник F68 (мас./об.), рН 6,2 или

д) 40 мМ аргинин, 30 мМ сульфат натрия, 3% маннита (мас./об.), рН 6,2 или

е) 40 мМ аргинин, 30 мМ сульфат натрия, 3% маннита (мас./об.), 10 мМ метионин, 0,01% плуроник F68 (мас./об.), рН 6,2.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления композиции включают количество белка эритропоэтина 50, 100, 400, 800 или 2500 мкг/мл. Наиболее предпочтительные композиции включают либо 10 мМ фосфат натрия, 40 мМ сульфат натрия, 3% маннита (мас./об.), 10 мМ метионин, 0,01% плуроник F68 (мас./об.), рН 6,2, либо 40 мМ аргинин, 30 мМ сульфат натрия, 3% маннита (мас./об.), 10 мМ метионин, 0,01% плуроник F68 (мас./об.), рН 6,2. Дальнейшие детали таких композиций известны из патентной заявки WO 01/87329.

Изобретение относится также к способу лечения нарушений распределения железа при диабете, включающему введение эффективного количества белка эритропоэтина, как определено выше. Кроме того, изобретение относится к лекарственному средству для лечения нарушений распределения железа при диабете, отличающемуся тем, что оно содержит эффективное количество белка эритропоэтина. В вышеуказанных случаях неинсулинзависимый сахарный диабет представляет собой предпочтительную форму диабета.

При лечении нарушений распределения железа при диабете ЭПО может, например, вводиться в дозе 150 ед./кг массы тела два раза в неделю. Доза может варьироваться в соответствии с нуждами отдельного пациента и может также лежать в интервале, например, от 100 до 200 ед./кг. В зависимости от периода полувыведения используемого производного ЭПО дозы могут вводиться, например, от 1 до 3 раз в неделю. В зависимости от нужд отдельного пациента лечащий врач мог бы также выбрать различные дозировки.

Специфическая активность ЭПО или конъюгатов ЭПО в соответствии с настоящим изобретением может быть определена с помощью различных анализов, известных в области техники. Биологическая активность очищенных белков ЭПО, соответствующих настоящему изобретению, такова, что введение белка ЭПО путем инъекции больным людям приводит в результате к увеличению продукции ретикулоцитов и красных клеток крови в клетках костного мозга по сравнению с не получавшими инъекцию или контрольными группами субъектов. Биологическая активность белков ЭПО или их фрагментов, полученных или очищенных согласно настоящему изобретению, может быть протестирована методами, соответствующими описанным в статье Annable, et al., Bull. Wld. Hlth. Org. (1972) 47: 99-112 и Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2). Другой биологический способ определения активности белка ЭПО, анализ на нормоцитоемических мышах, описан в области техники (см., например, Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2) и монографию по эритропоэтину Ph. Eur. BRP.).

Изобретение будет более понятным при ссылке на следующие примеры, которые иллюстрируют, но не ограничивают изобретение, описанное в данном контексте.

Пример

Женщину среднего возраста, страдающую от диабета, проверяют на нарушения распределения железа посредством определения следующих параметров - СРБ (С-реактивный белок), ферритин и растворимый трансферриновый рецептор, как описано Р.Lehmann, M.Volkmann, J.Lotz, A.Baldauf, R.Roeddiger, постер, представленный на Ежегодном собрании AACC/CSCC, 29 июля - 2 августа 2001 г., Чикаго, Иллинойс. Результаты показывают нарушения в распределении железа. Больную лечат подкожным введением 150 ед./кг Рекормона™ (коммерчески доступный белок эритропоэтина) два раза в неделю в течение максимум 12 недель. Впоследствии определение вышеописанных параметров показывает улучшение нарушения дефицита железа.

1. Применение белка, обладающего активностью эритропоэтина, его аналогов (производных) для получения лекарственного средства для лечения нарушений распределения железа при диабете.

2. Применение по п.1, в котором диабет представляет собой неинсулинзависимый сахарный диабет.

3. Применение по любому из пп.1 и 2, в котором белок эритропоэтина представляет собой человеческий эритропоэтин.

4. Применение по п.3, в котором белок эритропоэтина представляет собой эпоэтин α или эпоэтин β.

5. Применение по любому из пп.1 и 2, в котором белок эритропоэтина экспрессируется путем активации эндогенного гена.

6. Применение по п.3, в котором белок эритропоэтина экспрессируется путем активации эндогенного гена.

7. Применение по п.4, в котором белок эритропоэтина экспрессируется путем активации эндогенного гена.

8. Применение по любому из пп.1 и 2, в котором белок эритропоэтина имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2.

9. Применение по любому из пп.1 и 2, в котором белок эритропоэтина имеет последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированную введением от 1 до 6 центров гликозилирования.

10. Применение по любому из пп.1 и 2, в котором белок эритропоэтина представляет собой дарбепоэтин альфа.

11. Применение по любому из пп.1 и 2, в котором белок эритропоэтина, как описано в любом из пп.3-10, является пегилированным.

12. Применение по п.11, в котором белок эритропоэтина представляет собой конъюгат, который включает белок эритропоэтина, имеющий по меньшей мере одну свободную и обладающий in vivo биологической активностью, вызывающий повышение продукции ретикулоцитов и красных клеток крови в клетках костного мозга, и выбранный из группы, состоящей из человеческого эритропоэтина и его аналогов, которые имеют последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированную введением от 1 до 6 центров гликозилирования или реаранжировкой по меньшей мере одного центра гликозилирования, указанный белок эритропоэтина ковалентно связан с n количеством групп полиэтиленгликоля формулы -CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR, причем -СО каждой группы полиэтиленгликоля образует амидную связь с одной из аминогрупп, где R означает низший алкил; x составляет 2 или 3; m составляет от приблизительно 450 до приблизительно 900; n составляет от 1 до 3; при этом n и m выбраны таким образом, что молекулярная масса конъюгата за исключением белка эритропоэтина составляет от 20 до 100 кДа.

13. Применение по п.12, в котором x означает 2, m составляет 650-750, n означает 1 и R представляет собой метил.

14. Применение по п.11, в котором белок эритропоэтина представляет собой конъюгат, который включает белок эритропоэтина, имеющий по меньшей мере одну свободную аминогруппу и обладающий in vivo биологической активностью, вызывающей повышение продукции ретикулоцитов и красных клеток крови в клетках костного мозга, и выбранный из группы, состоящей из белка человеческого эритропоэтина и его аналогов, которые имеют первичную структуру белка человеческого эритропоэтина, модифицированную введением от 1 до 6 центров гликозилирования, указанный белок эритропоэтина ковалентно связан с одной-тремя низшими алкоксигруппами полиэтиленгликоля, причем каждая группа полиэтиленгликоля ковалентно связана с белком эритропоэтина посредством линкера формулы -C(O)-X-S-Y-, где С(O) линкера формирует амидную связь с одной из указанных аминогрупп, Х представляет -(СН₂)_k- или -CH₂(O-CH₂-CH₂)_k-, k составляет от 1 до 10, Y представляет собой

средняя молекулярная масса каждой молекулы полиэтиленгликоля составляет от приблизительно 20 до приблизительно 40 кДа и молекулярная масса конъюгата составляет от приблизительно 51 до приблизительно 175 кДа.

15. Применение по п.12 с конъюгатом эритропоэтина формулы

в которой n означает целое число от 1 до 3; m означает целое число от 450 до 900; R представляет собой низший алкил; Х означает -(CH₂)_k- или -СН₂(O-CH₂-CH₂)_k-, k составляет 1-10 и Р представляет собой остаток белка эритропоэтина за исключением n аминогрупп, которые формируют амидную связь с X.

16. Способ лечения нарушений распределения железа при диабете, включающий введение эффективного количества белка эритропоэтина.

17. Лекарственное средство для лечения нарушений распределения железа при диабете, отличающееся тем, что включает эффективное количество белка эритропоэтина.