Жидкая питательная среда для глубинного культивирования льдообразующих бактерий

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии, а также к пищевой промышленности, метеорологии, сельскому хозяйству и может быть использовано для получения микробного белка, инициирующего льдообразование. Питательная среда для глубинного культивирования льдообразующих бактерий содержит, г/л: калий фосфорнокислый двузамещенный 1,98-2,42, калий фосфорнокислый однозамещенный 1,53-1,87, сульфат магния 0,54-0,66, натрий серноватистокислый 0,54-0,66, ферментативный гидролизат казеина с содержанием аминного азота 135-145 мг% - остальное и 5-20 об.% перфторана. Внесение перфторана улучшает свойства жидкой питательной среды при глубинном культивировании льдообразующих бактерий, таких как Pseudomonas fluorescens ВУ 548, позволяет повысить выход микробного белка, инициирующего льдообразование. 1 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии, а также к пищевой промышленности, метеорологии, сельскому хозяйству и может быть использовано для получения микробного белка, инициирующего льдообразование.

Известна жидкая питательная среда на основе ферментативного гидролизата тушек пушных зверей (см. патент №2061038 МПК⁶ С12N 1/20, С12N 01/04), имеющая в своем составе следующее соотношение компонентов, г/л:

глюкоза 20;

натрий хлористый 3,0;

калий хлористый 0,2;

натрий фосфорнокислый двузамещенный 6,0;

содержание аминного азота в среде 70-120 мг%;

исходная концентрация водородных ионов 7,1-7,3 ед. рН.

Общим с заявляемым решением является содержание солей калия: калий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный; а также соли натрия - натрий серноватистокислый, при следующем соотношении компонентов, г/л:

калий фосфорнокислый двузамещенный 2,2;

калий фосфорнокислый однозамещенный 1,7;

натрий серноватистокислый 0,6.

К недостаткам данной среды следует отнести нестабильность и недостаточно высокий уровень результатов по накоплению концентрации льдообразующего белка, определяемого по величине льдообразующей активности (ЛОА). Кроме того, эта среда сложна в изготовлении и для ее получения используют дефицитное и дорогостоящее сырье, в частности мясо пушных зверей.

Известна жидкая питательная среда на основе ферментативного гидролизата казеина (см. патент RU №2239654, С12N 1/20, С12Q 1/04), имеющая в своем составе следующее соотношение компонентов, г/л:

калий фосфорнокислый двузамещенный 2,2;

калий фосфорнокислый однозамещенный 1,7;

сульфат магния 0,6;

натрий серноватистокислый 0,6;

ферментативный гидролизат казеина с содержанием аминного азота 138 мг% - остальное;

исходная концентрация водородных ионов 7,2 ед. рН.

Общим существенным признаком с заявляемой средой является питательная основа (ферментативный гидролизат казеина) и набор солей: калий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, сульфат магния, натрий серноватистокислый.

К недостаткам данной среды относятся: невысокий выход биомассы культур льдообразующих бактерий и ЛОА.

Была поставлена задача создать оптимальную жидкую питательную среду для увеличения выхода биомассы и интенсификации ЛОА у культур льдообразующих бактерий.

Целью настоящего изобретения является повышение выхода микробного белка, инициирующего льдообразование.

Поставленная цель решается благодаря тому, что в среду культивирования в качестве добавки вносят перфторан (ПФ) в количестве 5-20 об.%.

Вследствие того, что растворимость кислорода в питательной среде чрезвычайно мала, поэтому является целесообразным использование ПФ с газотранспортными свойствами (кислородная емкость 7 об.%) для улучшения свойств жидкой питательной среды.

ПФ представляет собой субмикронную эмульсию с газотранспортными функциями. ПФ содержит 10 об.% перфторорганических соединений, являющихся химически инертными соединениями, не подвергающимися метаболическим превращениям в организме человека и животных. Основными газотранспортными компонентами ПФ являются перфтордекалин и перфторметилциклогексилпиперидин.

Применение среды с ПФ менее 5 об.% не обеспечивает достаточно интенсивной ЛОА, т.к. идет медленный процесс увеличения биомассы.

Применение среды с ПФ более 20 об.% ведет к избытку кислорода в среде, что может вызвать токсический эффект и снизить ЛОА; также повышается концентрация в среде составляющих ПФ, например, эмульгатора - проксанола, что также неблагоприятно сказывается на ЛОА. Кроме того, применение ПФ в больших количествах нерентабельно и ведет к удорожанию технологии.

Сущность технического решения поясняется следующим.

Предлагаемая жидкая питательная среда для глубинного культивирования льдообразующих бактерий, содержащая в качестве питательной основы ферментативный гидролизат казеина, калий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, сульфат магния, натрий серноватистокислый, позволяет получить ЛОА на уровне 1,6×10⁹ центров нуклеации × см^-3 (ц.н. × см^-3).

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается вследствие того, что жидкая питательная среда для глубинного культивирования льдообразующих бактерий при следующем соотношении компонентов, г/л:

калий фосфорнокислый двузамещенный 1,98-2,42;

калий фосфорнокислый однозамещенный 1,53-1,87;

сульфат магния 0,54-0,66;

натрий серноватистокислый 0,54-0,66;

ферментативный гидролизат казеина с содержанием аминного азота 135-145 мг% - остальное;

исходная концентрация водородных ионов 6,9-7,3 ед. рН - дополнительно содержит 5-20 об.% ПФ.

В качестве льдообразующих бактерий используют культуру бактерий рода Pseudomonas, а именно Pseudomonas fluorescens ВУ 548 (см. сборник «Наука-производство-технологии-экология» 2005. Т 2. С. 246-248. Плетнева А.Ю. и др.), которую вводят в питательную среду из расчета не менее 10⁸ КОЕ/см³ (КОЕ - колониеобразующая единица).

Культивирование льдообразующих бактерий Pseudomonas fluorescens ВУ 548 осуществляют в биологическом реакторе, например в ферментере марки БИОР-0,25, в режиме постоянного перемешивания и принудительной аэрации (расход воздуха: объем воздуха на объем среды в минуту, равный (0,5-1,0) об./об. × мин).

Культивирование проводят в течение 22 часов при температуре (28±2)°С. Контроль за ростом культуры осуществляют путем определения концентрации биомассы по оптическому стандарту мутности ОСО 42-28-85-02, а также макрокультуральным методом на плотной питательной среде того же состава, но без ПФ. Показатель ЛОА учитывают путем проведения анализа на миникриостате МК-70 с регулируемой температурой.

Пример 1. Культивирование льдообразующих бактерий Pseudomonas fluorescens ВУ 548 осуществляют в питательной среде с оптимальным соотношением компонентов следующего состава, г/л:

калий фосфорнокислый двузамещенный 2,2;

калий фосфорнокислый однозамещенный 1,7;

сульфат магния 0,6;

натрий серноватистокислый 0,6;

ферментативный гидролизат казеина с содержанием аминного азота 138 мг% - остальное;

исходная концентрация водородных ионов 7,2 ед. рН.

Перед культивированием в стерильных условиях в среду добавляют 10 об.% ПФ.

Предлагаемая жидкая питательная среда для глубинного культивирования льдообразующих бактерий позволяет получить ЛОА на уровне 1,6×10⁹ ц.н. × см^-3, биомассу - 16,8 × 10⁹ КОЕ/см³.

Пример 2. Культивирование льдообразующих бактерий Pseudomonas fluorescens ВУ 548 осуществляют в питательной среде с максимальным соотношением компонентов следующего состава, г/л:

калий фосфорнокислый двузамещенный 2,42;

калий фосфорнокислый однозамещенный 1,87;

сульфат магния 0,66;

натрий серноватистокислый 0,66;

ферментативный гидролизат казеина с содержанием аминного азота 145 мг% - остальное;

исходная концентрация водородных ионов 7,3 ед. рН.

Перед культивированием в стерильных условиях в среду добавляют 20 об.% ПФ.

Предлагаемая жидкая питательная среда для глубинного культивирования льдообразующих бактерий позволяет получить ЛОА на уровне 4,5×10 ц.н. × см^-3, биомассу - 9,0×10⁹ КОЕ/см³.

Пример 3. Культивирование льдообразующих бактерий Pseudomonas fluorescens ВУ 548 осуществляют в питательной среде с минимальным соотношением компонентов следующего состава, г/л:

калий фосфорнокислый двузамещенный 1,98;

калий фосфорнокислый однозамещенный 1,53;

сульфат магния 0,54;

натрий серноватистокислый 0,54;

ферментативный гидролизат казеина с содержанием аминного азота 135 мг% - остальное;

исходная концентрация водородных ионов 6,9 ед. рН.

Перед культивированием в стерильных условиях в среду добавляют 5 об.% ПФ.

Предлагаемая жидкая питательная среда для глубинного культивирования льдообразующих бактерий позволяет получить ЛОА на уровне 1,0×10 ц.н. × см^-3, биомассу - 7,3×10⁹ КОЕ/см³.

Пример 4. Культивирование льдообразующих бактерий Pseudomonas fluorescens ВУ 548 осуществляют по прототипу в питательной среде с соотношением компонентов следующего состава, г/л:

калий фосфорнокислый двузамещенный 2,2;

калий фосфорнокислый однозамещенный 1,7;

сульфат магния 0,6;

натрий серноватистокислый 0,6;

ферментативный гидролизат казеина с содержанием аминного азота 138 мг% - остальное;

исходная концентрация водородных ионов 7,2 ед. рН.

Предлагаемая жидкая питательная среда для глубинного культивирования льдообразующих бактерий позволяет получить ЛОА на уровне 1,1×10⁷ ц.н. × см^-3, биомассу - 10,5×10⁹ КОЕ/см³. Отсутствие ПФ привело к снижению выхода биомассы в 1,6 раза, ЛОА - в 145 раз.

Сводные данные по ЛОА и выходу биомассы льдообразующих бактерий в описанных примерах представлены в таблице.

Таким образом, использование предлагаемой жидкой питательной среды с ПФ для глубинного культивирования льдообразующих бактерий позволяет значительно улучшить условия культивирования, которые способствуют увеличению ЛОА льдообразующих бактерий. ПФ может быть рекомендован для использования в качестве добавки для улучшения свойств различных питательных сред.

В таблице представлены ЛОА и биомасса льдообразующих бактерий Pseudomonas fluorescens ВУ 548 через 22 часа культивирования в жидкой питательной среде

Таблица.
Питательная среда	ЛОА, ц.н. × см-3	Биомасса, КОЕ/см3
Пример 1	1,6×109	16,8×109
Пример 2	4,5×106	9,0×109
Пример 3	1,0×106	7,3×109
Пример 4	1,1×107	10,5×109

Жидкая питательная среда для глубинного культивирования льдообразующих бактерий, содержащая в качестве питательной основы ферментативный гидролизат казеина, калий фосфорно-кислый двузамещенный, калий фосфорно-кислый однозамещенный, сульфат магния, натрий серноватисто-кислый, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит 5-20 об.% перфторана при следующем соотношении компонентов среды, г/л:

калий фосфорно-кислый двузамещенный	1,98-2,42
калий фосфорно-кислый однозамещенный	1,53-1,87
сульфат магния	0,54-0,66
натрий серноватисто-кислый	0,54-0,66
ферментативный гидролизат казеина
с содержанием аминного азота 135-145 мг%	остальное

исходная концентрация водородных ионов 6,9-7,3 ед. рН.