Противораковый агент, содержащий белок lk8 в качестве активного ингредиента
Изобретение относится к области медицины и касается противоракового агента, содержащего белок LK8 в качестве активного ингредиента. Противораковый агент, включающий белок LK8 SEQ ID NO 1 по настоящему изобретению является эффективным для подавления роста и метастазирования злокачественной опухоли. Так агент можно эффективно применять не только для подавления метастазирования рака, но также в качестве терапевтического агента для лечения первичной злокачественной опухоли. Преимущество изобретения заключается в повышении противоопухолевой активности. 6 з.п. ф-лы, 2 табл., 6 ил.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к противораковому агенту, содержащему определенный белок в качестве активного ингредиента, более точно, к противораковому агенту, содержащему белок, соответствующий kringle KV38 аполипопротеина (а) в качестве активного ингредиента.
Уровень техники
Опухоль развивается посредством неконтролируемой беспорядочной патологической пролиферации клеток. Если указанная опухоль демонстрирует деструктивный рост, инвазивность и метастазирование, она считается злокачественной опухолью. Инвазивность представляет собой свойство инфильтрировать и разрушать окружающие ткани, и, в частности, базальный слой, формирующий границу тканей, разрушается в результате указанного свойства, что приводит к локальному распространению и, иногда, поступлению опухоли в систему кровообращения. Метастазирование означает распространение опухолевых клеток из первичного очага в другие области через лимфатические или кровеносные сосуды. В широком смысле метастазирование означает также прямое распространение опухолевых клеток через перитонеальную полость или другие пространства.
В настоящее время для лечения злокачественных опухолей используют хирургическое вмешательство, лучевую терапию и химиотерапию, по отдельности или совместно. Хирургическое вмешательство представляет собой путь удаления патологических тканей. Так опухоли в конкретных областях, таких как молочная железа, толстая кишка и кожа, можно эффективно удалить с помощью хирургической операции. Однако опухоли позвоночника или рассеянные опухоли, такие как лейкоз, невозможно адекватно лечить хирургическим вмешательством.
Химиотерапия блокирует репликацию или метаболизм клеток, и ее применяют для лечения рака молочной железы, рака легких и рака семенников. Однако пациенты со злокачественными опухолями, которых лечат химиотерапией, серьезно страдают от побочных эффектов системной химиотерапии. Тошнота и рвота являются среди прочих наиболее распространенными, но тяжелыми эффектами. Побочные эффекты химиотерапии могут влиять на жизнь пациента, поскольку они могут быстро снижать его адаптивность. Кроме того, токсичность, ограничивающая дозу (DLT), также является одним из основных побочных эффектов химиотерапии, который требует тщательного внимания при введении лекарственного средства. Мукозит представляет собой пример DLT против противораковых агентов, таких как 5-фторурацил, который представляет собой антиметаболический цитотоксический агент, и метотрексат, а также противораковые антибиотики, такие как доксорубицин. Если пациент серьезно страдает от указанных побочных эффектов химиотерапии, его или ее следует госпитализировать и вводить анодин для уменьшения боли. Таким образом, побочные эффекты химиотерапии и лучевой терапии являются самой большой проблемой при лечении пациентов со злокачественными опухолями.
Таким образом, существует настоятельная необходимость в разработке противоракового агента, происходящего от живого существа, с целью уменьшения побочных эффектов химиотерапии. В частности, среди веществ, вырабатываемых в живом существе, был найден многообещающий субъект, который не атакует раковые клетки непосредственным образом, а предотвращает рост раковых клеток, действуя против различных эндотелиальных клеток, способствующих росту раковых клеток. Таким образом, противораковый агент, содержащий указанный субъект, может не только лечить злокачественные опухоли, но и предотвращать метастазирование.
Kringle представляет собой разновидность белковой структуры, которая состоит из 80 аминокислот и трех внутримолекулярных дисульфидных связей. Структуру kringle находят во многих белках, таких как тротромбин (Walz, D.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74:1069-1073, 1977), урокиназа (Pennica, D. et al., Nature, 301:579-582, 1983), фактор роста гепатоцитов (Lukker, N.A. et al., Protein Eng., 7:895-903, 1994) и аполипопротеин(а) (далее в настоящем документе упоминается как "аро(а)") (McLean, J.W. et al., Nature, 330:132-137, 1987). Kringle состоит из отдельной свернутой единицы. Функции kringle до сих пор не имеют ясного объяснения.
Аро(а) включает два типа доменов kringle, KIV и KV, и неактивный протеиназо-подобный участок. Домен kringle KIV разделяется на 10 подтипов (KIV-1 ˜ KIV-10), согласно гомологии аминокислот, и 15 ˜ 40 число копий указанного домена обнаруживают в различных аллелях человеческого гена аро(а). Аро(а) формирует липопротеин(а) (далее в настоящем документе упоминается как "Lp(а)") посредством ковалентной связи с аро В-100, главным белковым компонентом липопротеина низкой плотности (LDL) (Fless, G.M., J. Biol. Chem., 261:8712-8717, 1986). Повышение содержания Lp(a) в самой цитоплазме представляет собой главный фактор риска атеросклероза (Armstrong, V.W. et al., Artherosclerosis, 62:249-257, 1986; Assmann, G., Am. J. Cardiol., 77:1179-1184, 1996).
На основе того факта, что артеросклероз и рост раковых клеток зависят от ангиогенеза, заявители изучили противораковую активность KV38, одного из человеческих аро(а) kringle. В результате заявители завершили настоящее изобретение, подтвердив, что указанный белок можно эффективно использовать в качестве противоракового агента, поскольку он ингибирует ангиогенез эндогенным фактором роста, подобным bFGF, который необходим для роста раковых клеток.
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является разработка противоракового агента, включающего человеческий аро(а) kringle KV38 (далее в настоящем документе упоминается как "белок LK8") в качестве активного ингредиента.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения
Для того чтобы добиться указанной выше цели настоящего изобретения, настоящее изобретение обеспечивает противораковый агент, содержащий белок LK8 в качестве активного ингредиента.
Далее настоящее изобретение описывается подробно.
Противораковый агент по настоящему изобретению характеризуется содержанием белка LK8, имеющего аминокислотную последовательность, представленную SEQ. ID. № 1, в качестве активного ингредиента. Предпочтительно использовать агент в качестве ингибитора метастазирования, более предпочтительно его используют для подавления метастазирования рака толстой кишки или рака прямой кишки в печень.
Помимо этого противораковый агент используют для лечения первичных опухолей. Более предпочтительно агент используют для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака легкого, рака толстой кишки и рака прямой кишки.
Противораковый агент по настоящему изобретению предпочтительно содержит белок LK8 в количестве 0,1 ˜ 100 мг/кг, более предпочтительно, содержит белок LK8 в количестве 1 ˜ 50 мг/кг, а частота введения составляет 1 ˜ 4 раза в день. Однако композиция не ограничивается указанными параметрами, и возможны изменения в соответствии с состоянием пациента и типом и скоростью прогрессирования заболевания.
В настоящем изобретении «KV38» означает аро(а) kringle, а LK8 означает рекомбинантный белок KV38. Однако и белок KV38, и белок LK8, обычно называется белком LK8, если особо не указывается иное.
Белок LK8 по настоящему изобретению представляет собой домен, соответствующий KV38 kringle многих доменов аро(а) kringle, и обладает ингибирующим действием на пролиферацию и дифференцировку раковых клеток и метастазирование посредством подавления активности эндотелиальных клеток in vitro, а также in vivo. Как объясняется в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, системное введение белка LK8 приводит к ингибированию первичной опухоли и ее метастазирования (см. ФИГ.2 ˜ ФИГ.6). Таким образом, белок LK8 по настоящему изобретению можно эффективно использовать в качестве противоракового агента, особенно для первичных опухолей, а также в качестве ингибитора метастазирования, благодаря его свойствам подавления опухолевого роста и метастазирования.
Эффект от лечения будет усилен, если белок LK8 по настоящему изобретению использовать совместно с обычно химиотерапией или лучевой терапией. Лучевую терапию осуществляют для того, чтобы разрушить первичную опухоль, и если белок LK8 вводят во время лучевой терапии, можно более эффективно предотвратить метастазирование. Что касается химиотерапии, цитотоксичность, вызываемая огромной дозой химических противораковых агентов, представляет собой самую большую проблему. Если белок LK8 по настоящему изобретению вводить во время химиотерапии, уменьшенное количество химических противораковых агентов будет оказывать эквивалентное или даже улучшенное противораковое действие, а также уменьшать цитотоксичность.
В заключение можно сказать, что если введение белка LK8 осуществляют совместно с хирургическим вмешательством, лучевой терапией, химиотерапией или иммунотерапией, эффект от лечения будет максимальным. И кроме того, непрерывное введение белка LK8 удлиняет состояние покоя микрометастазов, подавляет рост первичной опухоли и стабилизирует состояние. Многие обычные противораковые агенты предназначены для длительного введения, вызывая такие проблемы как длительное производство белка и высокая цена продукта. Альтернативой для них является генная терапия. Также ожидается, что белок LK8 максимизирует эффект противоракового агента или ингибитора метастазирования, если его будут использовать для генной терапии.
Противораковый агент, содержащий белок LK8, по настоящему изобретению можно вводить перорально или парентерально и использовать в обычных формах фармацевтических композиций.
Противораковый агент можно изготавливать для перорального или парентерального введения смешиванием с обычными наполнителями, связующими агентами, увлажняющими агентами, разрыхлителями, разбавителями, такими как поверхностно-активные агенты или наполнители. Твердые композиции для перорального введения представляют собой таблетки, пилюли, опудривающие порошки, гранулы и капсулы. Указанные твердые композиции изготавливают смешиванием с одним или более подходящих наполнителей, таких как крахмал, карбонат кальция, сахароза или лактоза, желатин и т.п. Помимо простых наполнителей можно использовать смазывающие агенты, например стеарат магния, тальк и т.п. Жидкие композиции для перорального введения представляют собой суспензии, растворы, эмульсии и сиропы, и указанные выше композиции могут содержать различные наполнители, такие как увлажняющие агенты, подсластители, ароматизаторы и консерванты, помимо обычно используемых простых разбавителей, таких как вода или жидкий парафин. Композиции для парентерального введения представляют собой стерилизованные водные растворы, не растворимые в воде наполнители, суспензии, эмульсии и суппозитории. Не растворимые в воде наполнители и суспензии могут содержать, помимо активного соединения или соединений, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, сложный эфир для инъекций, такой как этилолеат и т.п. Суппозитории могут содержать, помимо активного соединения или соединений, витепсол, макрогол, твин 61, масло какао, лауриновое масло, глицеринизированный желатин и т.п.
LD50 белка LK8 составляет приблизительно 1000 мг/кг, что свидетельствует о весьма высокой безопасности противоракового агента по настоящему изобретению (см. таблицу 2).
Краткое описание чертежей
Осуществление предпочтительных вариантов настоящего изобретения можно лучше понять с помощью прилагаемых чертежей.
ФИГ.1 представляет собой схематическое изображение экспрессирующего вектора "pMBRI-LK8 (8,25 т.п.н.)" гена LK8, в котором кДНК LK8 (261 п.н.) встроена между промотором АОХ1 и терминатором АОХ1.
ФИГ.2 представляет собой серию фотографий и график, показывающие, что метастазирование в легкие клеточной линии меланомы мышей, B16F10, которую инъецировали в хвостовую вену мышей (C57BL/6), ингибируются лечением белком LK8,
(а) легкое мыши, леченной только PBS,
(b) легкое мыши, леченной белком LK8 1 мг/кг,
(с) график, показывающий, что метастазирование клеток B16F10 в легкое мыши ингибируется лечением белком LK8.
ФИГ.3 представляет собой серию фотографий и график, показывающие, что метастазирование в печень клеточной линии колоректального рака мышей СТ-26, трансплантированной в селезенку мыши, ингибируются лечением белком LK8,
(а) печень мыши, леченной PBS (контроль) и белком LK8 (10 мг/кг в день),
(b) график, показывающий количество колоний клеток СТ-26, метастазировавших в печень мыши, леченной PBS (контроль) и белком LK8 (10 мг/кг в день),
(с) фотографии, показывающие распределение раковых клеток СТ-26, метастазировавших в печень мыши, леченной PBS (контроль) и белком LK8 (10 мг/кг в день), которое наблюдалось при окрашивании гематоксилин-эозином.
ФИГ.4 представляет собой серию графиков, показывающих изменения размеров опухоли у мыши, которой трансплантировали клетки рака предстательной железы человека РС-3, в соответствии с введением белка LK8,
(а) график, показывающий изменения размеров опухоли после лечения белком LK8 100 мг/кг в день.
(b) график, показывающий изменения размеров опухоли после лечения белком LK8 50 мг/кг в день.
ФИГ.5 представляет собой график, показывающий изменения размеров опухоли у мыши, которой трансплантировали клетки рака легкого человека А549, в соответствии с введением белка LK8.
ФИГ.6 представляет собой серию графиков, показывающих изменения размеров опухоли (а) и массы опухоли (b) у мышей, которым трансплантировали клетки рака прямой кишки и рака толстой кишки человека LS 174Т, в соответствии с введением белка LK8.
Примеры
Практические и в настоящее время предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения являются иллюстративными, как показано в следующих примерах.
Однако следует оценить тот факт, что специалисты, принимая во внимание настоящее описание, могут производить модификации и улучшения в пределах идеи и объема настоящего изобретения.
Пример 1: Изготовление белка LK8
<1-1> Построение экспрессирующего вектора LK8 pMBRI-LK8
Для того чтобы эффективно изготовить белок LK8, заявители сначала сконструировали экспрессирующий вектор LK8.
Для экспрессии гена LK8 использовали вектор pPIC9 (8,0 т.п.н., Invitrogen, Нидерланды) в качестве базового вектора. Как можно видеть на репрезентативной карте, экспрессирующий вектор pPIC9 включает, по порядку, промотор АОХ1, который обеспечивает высокую экспрессию метанолом, сигнал секреции α-фактора, который включает секрецию экспрессируемого белка, 3'AOX1 (TT), сигнал полиаденилирования АОХ1, который обеспечивает эффективную терминацию транскрипции и полиаденилирования, и фрагмент ДНК, кодирующий гистидинол-дегидрогеназу дикого типа Pichia pastoris, которую используют в качестве селектируемого маркера для трансформанта указанного выше штамма.
Сначала ген LK8 амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров "LK8N-Xhol", представленного SEQ. ID. № 2 и "LK8C-EcoRI", представленного SEQ. ID. № 3, с использованием pET15b/LK8 (см. PCT/KR99/00554) в качестве матрицы. Продукт ПЦР подвергали ферментативному расщеплению с использованием рестрикционных ферментов XhoI и EcoRI, с последующим субклонированием путем инсерции продукта в вектор pPIC9, который подвергали ферментативному расщеплению с использованием тех же рестрикционных ферментов. В конечном итоге был сконструирован экспрессирующий вектор гена LK8 - "pMBRI-LK8" (8,25 т.п.н.).
<1-2> Получение трансформанта, включающего pMBRI-LK8
Pichia pastoris, метилотропный дрожжевой гриб, использовали в качестве хозяина для получения рекомбинантного трансформанта.
В частности, экспрессирующий вектор гена LK8, "pMBRI-LK8", обрабатывали рестрикционным ферментом SacI, обеспечивающим линеаризацию. Вектор встроили в ген AOXI хромосомы указанного выше штамма-хозяина с использованием гомологичной рекомбинации. В то же время для трансформации осуществляли электропорацию. Рекомбинантный дрожжевой трансформант выбирали со среды с дефицитом гистидина путем изучения колониеобразования. Осуществляли ПЦР для подтверждения инсерции кДНК LK8 в область АОХ1 хромосомы выбранного рекомбинантного трансформанта. Затем рекомбинантный трансформант культивировали, и индуцировали метанолом экспрессию гена LK8. В результате экспрессия гена LK8 была подтверждена, что свидетельствует о массовой секреции белка в культуральной среде.
Секретированный белок LK8 по настоящему изобретению был составлен из аминокислотной последовательности, представленной SEQ. ID. № 1.
<1-3> Культивирование рекомбинантного штамма
<1-3-1> Посевочная культура
В настоящем изобретении рекомбинантный штамм получали инсерцией гена LK8 в Pichia pastoris. Установленный штамм культивировали после посева в течение 24 часов с получением подходящей биомассы и активности (при разведении в 20 раз ОП600 составляла 0,8-1,2).
Посевочную культуру получали в среде YDP (1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 2% декстроза) в течение 24 часов при встряхивании культуры. Использовали ферментер объемом 75 л. Объем первоначальной среды составлял 20 л, а конечный объем культурального раствора доводили до 40 л способом подпитываемой культуры.
<1-3-2> Основная культура
По окончании культивирования посевочной культуры в среде YPD получали основную культуру с использованием раствора посевочной культуры в количестве 30% от первичной среды. Основную культуру получали в ферментере, содержавшем ингредиенты, перечисленные ниже в таблице 1. Когда фермент насыщался подачей метанола, фермент восстанавливали более чем 10% для продукции белка LK8. Тем временем непрерывно подавали метанол для индуцирования непрерывной экспрессии белка. Процедуру повторяли для получения белка LK8. Скорость потребления источника углерода была пропорциональна количеству клеток. Таким образом, когда некоторое количество фермента восстанавливалось, скорость подачи метанола автоматически регулировалась, таким образом, чтобы она не выходила за пределы ±20%. В результате повторения указанного выше процесса культивирования, во время которого ферментация продолжалась более 200 часов, получали секретированный белок LK8 в количестве 250 мг на 1 л культурального раствора.
| Таблица 1 Состав среды для основной культуры | ||
| Виды среды | Компонент | Концентрация |
| Среда для основной культуры | Метанол Раствор металлических микроэлементов | 500 г/л 8 мл/л |
| Состав раствора металлических микроэлементов | CuSO4·5H2O KI MnSO4·H2O NaMo·H2O H3BO4 CoCl2 ZnCl2 FeSO4·H2O Биотин H2SO4 | 4 г/л 0,3 г/л 4 г/л 0,1 г/л 0,01 г/л 0,1 г/л 3 г/л 10 г/л 0,1 г/л 5 мл/л |
Пример 2: Экспериментальное метастазирование в легкие с использованием внутривенного введения клеток мышиной меланомы B16F10
Клетки B16F10 (1,8Ч105) мышиной меланомы (далее в настоящем документе упоминаются как «клетки меланомы») (Американская коллекция типовых культур) вводили в хвостовую вену мыши C57BL/6 (Charles River Japan, Inc.). Начиная со следующего дня, белок LK8, полученный в описанном выше <примере 1>, инъецировали подкожно дважды (1 мг/кг в день, 0,2 мг/кг в день) в день в течение 14 дней. Контрольной группе инъецировали PBS вместо белка LK8. На 13-й день после трансплантации клеток мышь вскрывали и извлекали легкое для подсчета количества колоний метастазировавших злокачественных клеток (клеток меланомы).
В результате, огромные колонии сформировались в легких у мышей контрольной группы, которым инъецировали PBS, что свидетельствует о переносе клеток меланомы (ФИГ.2а). Напротив, количество и размеры колоний, образовавшихся переносом клеток меланомы, были значительно меньше в экспериментальной группе мышей, которым инъецировали белок LK8 (ФИГ.2b). В заключение можно сказать, что в группе, леченной белком LK8 1 мг/кг, наблюдалось 53% ингибирование метастазирования по сравнению с контрольной группой (ФИГ.2с).
Пример 3: Экспериментальное метастазирование в печень с использованием внутривенного введения клеток мышиного колоректального рака СТ-26
Клетки СТ-26 (Американская коллекция типовых культур), клетки мышиного колоректального рака, инъецировали в селезенку для индуцирования метастазирования в печень. Затем изучали эффект ингибирования образования метастазов белка LK8. В частности, клетки СТ-26, которые были на 80% выращены на планшете, промывали PBS с последующей сингуляризацией 0,02% EDTA. Одиночные клетки снова промывали PBS, затем тщательно ресуспендировали в PBS. Суспензию окрашивали трипановым синим для подсчета количества клеток. Плотность клеток доводили до 5·105/мл, которые затем инъецировали каждой мыши в 100 мкл. Использовали 6 ˜ 8-недельных мышей Balb/c (Charles River Japan, Inc.). После хирургического разреза правой части живота суспензию раковых клеток осторожно инъецировали в селезенку иглой калибра 30. Белок LK8 подкожно инъецировали экспериментальной группе два раза в день в количестве 10 мг/кг, и подобным же образом инъецировали физиологический раствор контрольной группе. Спустя 14 дней мышей умерщвляли для исследования печени (ФИГ.3а) и подсчитывали количество колоний, видимых на поверхности печени, которая была фиксирована в 10% растворе формалина. Не наблюдалось большой разницы в весе между группами. Однако количество колоний, которые были перенесены в печень, было значительно меньше в экспериментальной группе, которой вводили белок LK8 в количестве 10 мг/кг в день, чем в контрольной группе. Уменьшение количества колоний в экспериментальной группе, которой инъецировали белок LK8 в количестве 10 мг/кг в день, составляло приблизительно 60%, по сравнению с контрольной группой (ФИГ.3b). Кроме того, срезу печеночной ткани, которая была фиксирована в растворе формалина, окрашивали гематоксилин-эозином и изучали. В результате область опухоли была значительно ограничена в экспериментальной группе, леченной белком LK8, по сравнению с контрольной группой (ФИГ.3с).
Пример 4: Ингибирование роста первичной опухоли
Для того чтобы изучить влияние белка LK8 на антиангиогенез in vivo, использовали модель ксенотрансплантированной опухоли. Каждый релевантный эксперимент выполняли с использованием 4-недельных, отобранных слепым способом самок бестимусных мышей Balb/c nu/nu (Charles River Japan, Inc.), которые были выращены в стерильных условиях.
<Рак предстательной железы человека (РС-3)>
Клетки рака предстательной железы человека РС-3 (Американская коллекция типовых культур) культивировали в среде RPMI 1640 (GIBCO™, Invitrogen Corporation) с добавлением 10% FBS и приблизительно 5·106 клеток РС-3 подкожно инъецировали в центральную мышечную область спины бестимусной мыши. Ровно через 10 дней после трансплантации белок LK8 инъецировали в количестве 100 мг/кг в день. В то же время контрольной группе инъецировали только PBS вместо белка LK8. Лечение продолжали в течение 30 дней, затем размер опухоли измеряли каждые 3-4 дня. В результате рост опухоли был подавлен лечением белком LK8, что составляло приблизительно 60% ингибирование по сравнению с контрольной группой (ФИГ.4а). В случае, когда белок LK8 инъецировали в количестве 50 мг/кг в день, рост опухоли был подавлен сходным образом свыше 60% по сравнению с контрольной группой (ФИГ.4b).
<4-2> Рак легкого человека (А549)
Клетки рака легкого человека А549 (Американская коллекция типовых культур) культивировали в среде DMEM (GIBCO™, Invitrogen Corporation) с добавлением 10% FBS. Затем приблизительно 1·107 опухолевых клеток подкожно инъецировали в центральную мышечную область спины бестимусной мыши. Ровно через 5 дней после трансплантации белок LK8 инъецировали в количестве 50 мг/кг в день. Контрольной группе инъецировали только PBS вместо белка LK8. Лечение продолжали в течение 46 дней, затем размер опухоли измеряли каждые 3-4 дня. В результате рост опухоли был подавлен лечением белком LK8, что составляло 61% ингибирование по сравнению с контролем (ФИГ.5).
<4-3> Рак толстой и прямой кишки человека (LS 174T)
Клетки рака толстой и прямой кишки человека LS 174T (Американская коллекция типовых культур) культивировали в среде RPMI (GIBCO™, Invitrogen Corporation) с добавлением 10% FBS. Затем 5·106 опухолевых клеток подкожно инъецировали в центральную мышечную область спины бестимусной мыши. Ровно через 5 дней после трансплантации белок LK8 инъецировали в количестве 50 мг/кг в день. Контрольной группе вводили только PBS вместо белка LK8. Лечение продолжали в течение 34 дней, затем размер опухоли измеряли каждые 3-4 дня. В результате рост опухоли был подавлен лечением белком LK8, что составляло 64% ингибирование по сравнению с контролем (ФИГ.6а). Также вес опухоли уменьшался при лечении белком LK8 приблизительно на 68,7%, по измерению в последний день эксперимента (ФИГ.6b).
Пример 5: Тест на острую токсичность белка LK8
В тесте на острую токсичность использовали 5-недельных крыс линии SPF SD (Sprague Dawley). Крыс разделяли на 5 групп и 5 крысам каждой группы вводили однократно белок LK8 в дозах 260 мкг, 364 мг/кг, 510 мг/кг, 714 мг/кг и 1000 мг/кг соответственно, путем внутривенной инъекции (таблица 2). В течение 14 дней после введения испытуемого материала, белка LK8, наблюдали смерть, клинические симптомы и изменения массы тела. Были проведены гематологические анализы и биохимические анализы крови, и любые патологические признаки в желудочно-кишечном тракте, органах грудной клетки и живота изучали визуально во время вскрытия. В результате выявили слабую токсичность в группе, которой вводили 1000 мг/кг белка LK8, но ни случаев токсичности, ни случаев смерти не было выявлено в других группах в большинстве тестов, включая изменения массы тела, анализ крови, гематологические анализы и биохимические анализы крови, вскрытие и т.п. Таким образом, белок LK8, использовавшийся в указанном эксперименте, был оценен как безопасное вещество, поскольку он не вызывал никаких токсических изменений у крыс вплоть до уровня 1000 мг/кг, а его установленные величины LD50 были значительно больше, чем 1000 мг/кг для крыс (таблица 2).
| Таблица 2 Количество случаев смерти по дням после введения белка LK8 | ||||||||||||||||
| Введенное количество (мг/кг) | Количество случаев смерти/ общее количество крыс в испытании | Дни после введения белка LK8 | ||||||||||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | ||
| 260 | 0/5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 364 | 0/5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 510 | 0/5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 714 | 0/5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1000 | 3/5 | 0 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
ПРИМЕНИМОСТЬ В ПРОМЫШЛЕННОСТИ
Как было объяснено ранее в настоящем документе, белок LK8 обладает ингибирующим действием на метастазирование, в частности на рост рака предстательной железы человека, рак легкого, рак толстой кишки и рак прямой кишки, при системном введении. Таким образом, противораковый агент, содержащий белок LK8, по настоящему изобретению можно эффективно использовать в качестве агента для лечения первичной опухоли или ингибитора метастазирования.
Специалисты оценят тот факт, что концепции и конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, раскрытые в описании, можно легко использовать в качестве основы для модификации или разработки других вариантов осуществления таких же целей настоящего изобретения. Специалисты оценят также тот факт, что указанные эквивалентные варианты осуществления настоящего изобретения не отступают от идеи и объема настоящего изобретения, которые изложены в прилагаемой формуле изобретения.
1. Противораковый агент, содержащий белок LK8, представленный SEQ ID NO 1, в качестве эффективного ингредиента.
2. Противораковый агент по п.1, в котором эффективная доза белка LK8 составляет 1˜100 мг/кг.
3. Противораковый агент по п.2, в котором эффективная доза белка LK8 составляет 1˜50 мг/кг.
4. Противораковый агент по п.1, в котором агент применяют для ингибирования метастазирования рака.
5. Противораковый агент по п.1, в котором метастазирование рака представляет собой метастазирование рака толстой кишки или рака прямой кишки.
6. Противораковый агент по п.1, в котором агент применяют для лечения первичной опухоли.
7. Противораковый агент по п.6, в котором первичная опухоль выбрана из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака толстой кишки, рака прямой кишки и рака легкого.
