Рекомбинантная фагмидная днк phen-tab, содержащая ген одноцепочечного антитела человека, способного связывать фактор некроза опухоли альфа человека; рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli-продуцент одноцепочечного антитела человека против фактора некроза опухоли альфа человека; рекомбинантное растворимое одноцепочечное антитело человека против фактора некроза опухоли альфа человека

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано для получения растворимых одноцепочечных антител человека против фактора некроза опухоли альфа человека. Из сконструированной in vitro комбинаторной фаговой библиотеки одноцепочечных антител человека отбирают рекомбинантную фагмидную ДНК pHEN-TAB, содержащую уникальный ген одноцепочечного антитела человека под контролем промотора лактозного оперона. Полученной фагмидной ДНК трансформируют клетки Escherichia coli HB2151 и получают рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli HB2151/pHEN-TAB, депонированный в НИИ ККМ ФГУП ГНЦ ВБ "Вектор" под номером В-1077-продуцент одноцепочечного антитела человека, способного связывать фактор некроза опухоли альфа человека. Изобретение позволяет получить растворимое одноцепочечное высокоаффинное антитело человека scTAB против фактора некроза опухоли альфа человека, с константой аффинности К_аф=3,96±0,52×10⁸М^-1. 3 н.п. ф-лы, 6 ил.

 

Изобретение относится к биотехнологии, белковой и генной инженерии, конкретно - к получению растворимых одноцепочечных антител человека против фактора некроза опухоли альфа человека, и представляет собой отобранную из сконструированной in vitro комбинаторной фаговой библиотеки одноцепочечных антител человека рекомбинантную фагмидную ДНК pHEN-ТАВ, содержащую уникальный ген одноцепочечного антитела человека под контролем промотора лактозного оперона, обеспечивающий в клетках Escherichia coli HB2151 синтез одноцепочечного антитела человека, способного связывать фактор некроза опухоли альфа человека; рекомбинантный штамм Escherichia coli - продуцент одноцепочечного антитела человека scTAB, способного связывать фактор некроза опухоли альфа человека; рекомбинантное растворимое одноцепочечное антитело человека scTAB, способное связывать фактор некроза опухоли альфа человека.

Фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α) является главным медиатором острого воспалительного ответа на грамотрицательные бактерии и другие инфекционные агенты. Основным источником ФНО-α являются активированные мононуклеарные фагоциты, хотя стимулированные Т-клетки, натуральные киллеры и тучные клетки также могут секретировать этот белок [1]. Главным стимулятором запуска продукции ФНО-α макрофагами является бактериальный липополисахарид (ЛПС) или грамотрицательные бактерии, высвобождающие ЛПС [1]. Интерферон-гамма, продуцируемый Т-клетками и NK-клетками, усиливает продукцию этого цитокина ЛПС-активированными макрофагами [2].

ФНО-α ответственен за многие системные осложнения, возникающие при тяжелых инфекционных процессах, при этом ФНО-α, продуцируемый в большом количестве, может вызывать системные клинические и патологические проявления. Воздействуя на гипоталамус, он индуцирует лихорадку и поэтому называется естественным эндогенным пирогеном. В результате возникающей лихорадки увеличивается синтез простагландинов цитокин-стимулированными клетками гипоталамуса [3]. Кроме того, ФНО-α оказывает воздействие на печень, увеличивая, в частности, синтез гепатоцитами сывороточного амилоидного белка А и фибриногена - сывороточных воспалительных белков. Пролонгированная продукция ФНО-α вызывает и метаболические повреждения, такие как кахексия: он ингибирует синтез липопротеинлипазы - фермента, необходимого для высвобождения жирных кислот из циркулирующих липопротеиновых комплексов. Когда концентрация ФНО-α в сыворотке достигает больших значений, превышая 10^-7 М, это вызывает снижение сосудистого тонуса и сократимости миокарда, что, в конечном счете, приводит к резкому падению кровяного давления и шоку [3]. Кроме того, ФНО-α вносит ощутимый вклад при развитие локальных воспалительных реакций, в частности, при аутоиммунных заболеваниях [4].

Таким образом, повышение концентрации ФНО-α в крови приводит к ряду нежелательных последствий, включая шоковый синдром. Поэтому для коррекции подобных состояний можно применять антагонисты некоторых цитокинов, включая антитела человека против ФНО-α [5, 6]. В последние годы опубликован ряд работ, посвященных созданию искусственных антител, которые можно получать в больших количествах в апробированных экспрессионных системах в отличие от иммуноглобулинов, получаемых при иммунизации животных и человека. Одним из подходов является создание одноцепочечных антител (scFv), состоящих из вариабельных доменов тяжелой (Vh) и легкой (Vl) цепей иммуноглобулина, объединенных гибким пептидным линкером в одну молекулу. Небольшие размеры одноцепочечных антител облегчают их проникновение в ткани и выведение из организма [7, 8]. Одноцепочечные антитела были получены к интерлейкину 6 [9], вирусу осповакцины [10], вирусу Эбола [11]. Литературные данные о получении растворимых одноцепочечных антител человека против ФНО-α отсутствуют.

Технической задачей изобретения является получение растворимого одноцепочечного антитела человека против ФНО-α человека.

Поставленная задача решается путем отбора из сконструированной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека рекомбинантной фагмидной ДНК pHEN-TAB, содержащей уникальный ген одноцепочечного антитела человека, специфически направленного против ФНО-α человека; получением путем трансформации отобранной фагмидной ДНК pHEN-TAB штамма бактерий Escherichia coli - продуцента растворимого рекомбинантного одноцепочечного антитела человека scTAB против ФНО-α человека.

Комбинаторная библиотека одноцепочечных антител человека, сконструированная нами ранее [12], представляет собой популяцию фагмидных ДНК на основе фагмиды pHEN2, каждая из которых содержит под контролем промотора лактозного оперона ДНК-последовательность, кодирующую уникальное одноцепочечное антитело человека в составе химерного белка с оболочечным белком pIII бактериофага М13. При трансформации клеток Е.coli этой популяцией фагмидных ДНК образуется репертуар бактериофагов, каждый из которых экспонирует на своей поверхности уникальное мини-антитело в составе оболочечного фагового белка р3. Физическая сцепленность антитела и кодирующего его генетического материала дает возможность быстрого анализа антигенспецифических молекул, позволяя отбирать антитела, специфичные к целевому антигену.

На первом этапе сконструированной нами комбинаторной фагмидной библиотекой одноцепочечных антител человека трансформируют клетки супрессорного штамма Escherichia coli TG1 с использованием электропоратора BIORAD Gene Pulser™. Трансформированные клетки высевают на агаризованную среду 2×YT, содержащую 100 мкг/мл ампициллина и 1.5% глюкозы и растят при 30°С в течение ночи. Выросшие клетки собирают и хранят в среде 2×YT, содержащей 30% глицерин, при -70°С.

Для получения антител против ФНО-α человека проводят аффинное обогащение библиотеки специфическими клонами с последующим отбором индивидуальных клонов, способных продуцировать бактериофаги, экспонирующие на своей поверхности одноцепочечные антитела человека против ФНО-α человека. В качестве антигена используют рекомбинантный ФНО-α человека [13].

Для этого аликвоту трансформированных клеток размораживают, растят до среднелогарифмической фазы и инфицируют фагом-помощником М13К07, при этом получают популяцию нитчатых бактериофагов, каждый из которых экспонирует на своей поверхности уникальное одноцепочечное антитело человека в виде химерного белка с оболочечным белком pIII фага М13К07.

Аффинное обогащение библиотеки проводят в ходе трех последовательных раундов. Для проведения раунда обогащения в лунках полистиролового планшета сорбируют ФНО-α человека в концентрации 2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере, рН 7.2 (ФСБР). По окончании сорбции места неспецифического связывания насыщают раствором 0,2% Твин-20-ФСБР, после чего в каждую лунку добавляют аликвоту (10¹² БОЕ) библиотеки в виде коллекции нитчатых бактериофагов. Несвязавшиеся фаговые частицы удаляют при промывке, а фаги, несущие на своей поверхности одноцепочечные антитела, способные связываться с ФНО-α человека, элюируют раствором ФНО-α человека в концентрации 2 мкг/мл в ФСБР. Полученным элюатом инфицируют культуру клеток Е. coli TG1 в стадии экспоненциального роста для амплификации элюированных фаговых антител.

Второй и третий раунды аффинного обогащения проводят аналогично. При этом используют ФНО-α человека в концентрации 2 и 1,5 мкг/мл соответственно. Степень обогащения библиотеки антителами, специфически связывающимися с ФНО-α человека, проверяют с использованием непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) по способности популяций фаговых антител, полученных в результате каждого раунда аффинного обогащения, связывать ФНО-α человека (фиг.1). При этом фаговые антитела выделяют, как описано в Примере 1. В качестве отрицательного контроля используют связывание популяций фаговых антител с сухим обезжиренным молоком.

Далее, из популяции фаговых антител, обогащенной антителами против ФНО-α человека, с помощью ТИФА проводят отбор моноклональных фаговых антител, специфически связывающих ФНО-α человека. Для этого ФНО-α человека сорбируют в лунки 96-луночных иммунологических планшетов («Медполимер», Россия) в концентрации 0.5 мкг/мл. Места неспецифического связывания блокируют раствором 3%-го бычьего сывороточного альбумина (БСА, «Sigma», США) в ФСБР. Затем в лунки вносят выделенные, как описано в Примере 1, фаговые антитела, разведенные в ФСБР с 0,1% Твин, и инкубируют 1 час при 37°С. После промывки в лунки вносят анти-М13К07 мышиную сыворотку в разведении 1:2000, а затем антивидовой конъюгат щелочной фосфатазы («Sigma», США) в разведении 1:4000. В качестве хромогена используют пара-нитрофенилфосфат. Контролем неспецифического связывания служит связывание вируса с фагом-помощником М13К07, не несущим фрагментов антител на своей поверхности. В качестве отрицательного контроля используют связывание фаговых антител с БСА. Клоны, продемонстрировавшие сигнал, значение которого в 3 и более раз превышает контроль неспецифического связывания и отрицательный контроль, отбирают как положительные.

Далее проводят определение нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих одноцепочечные антитела против ФНО-α человека. Для амплификации Vh и Vl фрагментов в качестве матрицы используют фагмидные ДНК, выделенные методом щелочного лизиса [14], и олигонуклеотидные праймеры:

LMB - 5'-CAGGAAACAGTCATGAC и

pHEN-SEQ - 5'-CTATGGGGCCCCATTCA.

Амплификацию осуществляют методом ПНР с использованием Taq и Vent ДНК-полимераз при температуре отжига праймеров LMB и pHEN-SEQ 55°С.

Определение нуклеотидных последовательностей очищенных Vh и Vl фрагментов проводят в обоих направлениях с использованием автоматического секвенатора CEQ™ 2000XL DNA Analysis System ("Beckman") и наборов "F"CEQ DTCS Kit. Нуклеотдные и выведенные аминокислотные последовательности анализируют с использованием баз данных IgBLAST и V-base (фиг.2).

На основе результатов определения нуклеотидных последовательностей встроенных Vh- и Vl- фрагментов и рестрикционного анализа фагмиды строят схему фагмиды, содержащей ген, кодирующий уникальное одноцепочечное антитело против ФНО-α человека (фиг.3).

Рекомбинантная фагмидная ДНК pHEN-TAB, содержащая ген одноцепочечного антитела человека, способного связывать ФНО-α человека, характеризуется следующими признаками:

- имеет молекулярную массу 3,46 МДа и размер 5237 п.о.;

- содержит полученный генно-инженерными методами искусственный ген одноцепочечного антитела человека, обеспечивающий под контролем промотора лактозного оперона в клетках Е.coli синтез одноцепочечного антитела человека, способного связывать ФНО-α человека;

состоит из следующих элементов:

- Sfil / NotI - векторного фрагмента фагмиды pHEN2 (MRC, Великобритания) размером 4495 п.о., содержащего сайт инициации репликации плазмиды pUC18, сайт инициации репликации нитчатого бактериофага М13, последовательности, кодирующие гистидиновый гексомер и эпитоп C-myc, ori фага М 13, промотор Lac-оперона Е.coli, ori Е. coli, ген β-лактамазы (bla), супрессируемый стоп-кодон TAG, фрагмент гена белка pIII фага М13;

- SfiI/NotI - фрагмента размером 742 п.о., включающего искусственный ген одноцепочечного антитела человека, способного связывать ФНО-α человека, в котором вариабельный домен тяжелой цепи соединен с вариабельным доменом легкой цепи иммуноглобулина человека с помощью ДНК последовательности, кодирующей гибкий пептидный линкер Ser(Gly₄Ser)₂AlaArgGlySerGly₄Ser, и имеющего нуклеотидную последовательность, представленную на фиг.2;

содержит:

- промотор Lac- оперона Е. coli;

- генетический маркер: ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость трансформированных фагмидой pHEN-TAB клеток E.coli к ампициллину;

- уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющие следующие координаты: HindIII - 235, SfiI - 328, NotI - 1070, EcoRI - 2361.

Следующий этап работы - получение рекомбинантного бактериального штамма-продуцента одноцепочечных антител против ФНО-α человека в растворимой форме, т.е. в виде свободных антител, не связанных с бактериофагом. Для получения таких антител используют несупрессорный штамм Escherichia coli HB2151 (К12, ara, D(lac-pro)), thi/ F' proA+B+, laclq, lacZDM15), правильно транслирующий стоп-кодон TAG, находящийся в структуре антитела перед белком р3 бактериофага. Следует отметить, что на С-конце одноцепочечного антитела находится гистидиновый гексамер, а также С-myc эпитоп для детекции продукции этого антитела.

Компетентные клетки Escherichia coli HB2151 трансформируют ДНК фагмиды ДНК pHEN-TAB, выделенной из отобранного клона методом щелочного лизиса [14]. Полученный таким образом рекомбинантный штамм E.coli HB2151/pHEN-TAB характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки мелкие утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут не простых питательных средах. При росте на агаре "Difco" - колонии круглые, гладкие, прижатые, мутные, блестящие, серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде или бульоне Луриа) образуют интенсивную ровную муть. Клетки растут при температуре 37°С при оптимуме рН от 6.8 до 7.0.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды.

Рекомбинантный штамм E.coli HB2151/pHEN-TAB обеспечивает индуцируемый изопропилтиогалактозидом (ИПТГ) синтез одноцепочечных антител человека scTAB, способных связываться с ФНО-α человека, с уровнем продукции около 1% суммарного клеточного белка.

Полученный штамм депонирован в НИИ коллекции культур микроорганизмов ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор» под номером В-1077.

Для получения одноцепочечного антитела культуру полученного штамма нарабатывают до оптической плотности 0,6-0,8, после чего клетки индуцируют ИПТГ и растят на качалке при температуре 30°С примерно 4-5 часов. Выделение растворимых антител из периплазмы проводят, используя набор для очистки антител «Ni-NTA Oiagen», согласно инструкции, прилагаемой к набору. Степень очистки определяют сканированием геля на денситометре "Chromoscan 200" (Great Britain). Концентрацию белка в пробе определяют на спектрофотометре SmartSpec™ 3000 (BIO-RAD, США), используя метод Лоури [15].

Исследование специфичности отобранного антитела scTAB проводят методом Вестерн-блот анализа (см. пример 5). Аффинность полученного антитела в реакции связывания с ФНО-α человека исследуют методом ТИФА при последовательном разведении антитела (см. пример 6).

Сущность изобретения заключается в следующем:

- из сконструированной комбинаторной фаговой библиотеки одноцепочечных антител человека отобрана фагмидная ДНК pHEN-TAB, содержащая уникальный ген одноцепочечного антитела человека против ФНО-α человека;

- путем трансформации клеток Escherichia coli HB2151 фагмидной ДНК pHEN-TAB получен рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli HB2151/ pHEN-TAB - продуцент одноцепочечного антитела человека scTAB против ФНО-α человека;

- из клеток Escherichia coli HB2151/ pHEN-TAB выделено растворимое рекомбинантное одноцепочечное антитело человека scTAB против ФНО-α человека.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:

Фиг.1. Связывание популяций фаговых антител после раундов селекции с ФНО-α человека (темные колонки) и с обезжиренным молоком (светлые колонки).

Фиг.2. Нуклеотидная и соответствующая ей аминокислотная последовательность одноцепочечного антитела человека scTAB.

Фиг.3. Схема фагмиды pHEN-TAB, содержащей ген одноцепочечного антитела scTAB. Указаны сайты для эндонуклеаз рестрикции HindIII, Sfil, ApaLI, NotI и EcoRI; промотор лактозного оперона Р lac Z; место посадки рибосом RBS; гены вариабельных доменов тяжелых (Vh) и легких (VI) цепей иммуноглобулинов, супрессируем стоп кодон amber TAG; фрагмент гена белка pIII; ori репликации ColE1; ori фага М13; ген ампициллиновой устойчивости Ар^r.

Фиг.4. Электрофореграмма фракций, полученных при хроматографии на Ni-NTA носителе лизатов E.coli, содержащих sc-TAB. А - окраска Кумасси R-250, Б - иммуноблоттинг с МКА. М - стандарты молекулярных масс, 1 -периплазматическая фракция клеток Е. coli HB2151-pHEN-TAB до нанесения на колонку, 2 - несвязавшаяся периплазматическая фракция клеток Е. coli HB2151-pHEN-TAB после нанесения на колонку, 3 - фракция промывки, 4 - элюат.

Фиг.5. Вестерн-блот анализ ФНО-α человека с помощью очищенного одноцепочечного антитела человека scTAB (1), МКА мыши против С-myc эпитопа (2), конъюгата антивидовых антител (anti-mouse) со щелочной фосфатазой (3). Приведены - стандарты молекулярных масс.

Фиг.6. Определение константы аффинности одноцепочечного антитела scTAB с использованием непрямого иммуноферментного анализа. Приведен график титрования полученного антитела scTAB. На твердую фазу сорбирован ФНО-α человека 0,5 мкг/мл. Одноцепочечное антитело scTAB нанесено в последовательных разведениях с шагом 1: 2, исходная концентрация 2.25 мкг/мл, и проявлено с помощью МКА мыши против С-myc эпитопа (ICN, США) в разведении 1:4000 с последующим добавлением антивидового конъюгата щелочной фосфатазы антивидовым конъюгатом (anti-mouse) щелочной фосфатазы в разведении 1:4000.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.

Пример 1. Получение популяции нитчатых бактериофагов, каждый из которых экспонирует на своей поверхности уникальное одноцепочечное антитело человека в виде химерного белка с оболочечным белком р3 фага М13К07.

Аликвотой комбинаторной фагмидной библиотеки одноцепочечных антител человека [13] трансформируют клетки супрессорного штамма Escherichia coli TG1 с использованием электропоратора BIORAD Gene Pulser™. Трансформированные клетки высевают на агаризованную среду 2xYT, содержащую 100 мкг/мл ампициллина и 1.5% глюкозы и растят при 30°С в течение ночи. Выросшие клетки собирают и хранят в среде 2×YT, содержащей 30% глицерин, при -70°С.

50 мкл (около 10¹⁰ клеток) инокулируют в 100 мл среды 2×YT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозу, и растят при постоянном перемешивании при 37°С до OD₆₀₀=0.5. После этого полученную культуру инфицируют фагом-помощником М13К07 (Pharmacia Biotech, Швеция), добавляя его в соотношении 1:20 (количество бактериальных клеток: количество фаговых частиц), и инкубируют 30 мин при 37°С. Затем 20 мл культуры осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 3300 g. Осадок ресуспендируют в 10 мл 2×YT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина, и переносят суспензию в 200 мл 2×YT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина. Культуру инкубируют ночь при постоянном перемешивании при 30°С. На следующий день клетки Е. coli осаждают центрифугированием 10800 g, 10 мин в центрифуге "Beckman J2-21", к супернатанту добавляют 1/5 объема раствора PEG/NaCl (20% ПЭГ6000 и 2,5 М NaCl), хорошо перемешивают и в течение 1 ч инкубируют на льду. После этого суспензию центрифугируют при 10800 g 30 мин. Полученный осадок растворяют в 40 мл фосфатно-солевого буфера рН 7,2 (PBS) и добавляют 8 мл раствора PEG/NaCl, инкубируют во льду не менее 20 мин и проводят осаждение бактериофагов в центрифуге "Beckman J2-21" при 3300 g 30 минут. Супернатант вместе с остатками PEG/NaCl тщательно удаляют, а осадок ресуспендируют в 2 мл стерильного PBS. Для удаления остатков бактериальных клеток фаговую суспензию центрифугируют при 3300 g 10 мин. Выход фаговых частиц составляет приблизительно 10¹²-10¹³ бляшкообразующих единиц (БОЕ).

Пример 2. Аффинное обогащение полученной библиотеки фаговыми антителами, специфичными к ФНО-α человека.

Аффинное обогащение библиотеки проводят в ходе трех последовательных раундов. Для проведения первого раунда обогащения в лунках 96-луночного планшета («Медполимер», Россия) сорбируют ФНО-α человека в концентрации 2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере, рН 7.2 (ФСБР) и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день после удаления антигена лунки трижды промывают ФСБР и места неспецифического связывания насыщают раствором 0,2% Твин-20-ФСБР в течение 2 ч при 37°С. После этого лунки трижды промывают ФСБР и в каждую лунку добавляют аликвоту (10¹² БОЕ) библиотеки в виде коллекции нитчатых бактериофагов в 100 мкл раствора ФСБР. Планшеты инкубируют 1,5 часа при постоянном перемешивании при 37°С, после чего лунки планшета промывают 20 раз раствором ФСБР с 0,1% Твин-20, а затем 20 раз ФСБР.

Элюцию связавшихся бактериофагов проводят с помощью антигена. Для этого в лунки добавляют раствор ФНО-α человека в концентрации 2 мкг/мл в ФСБР. Для получения фагового репертуара культуру клеток Е. coli TG1 в стадии экспоненциального роста (по 10 мл для каждого элюата) инфицируют полученными фаговыми элюатами (по 400 мкл), инкубируют 30 мин при 37°С, затем центрифугируют 10 мин при 3000 g. Осадки ресуспендируют в 1 мл 2×YT и высевают на чашки с агаризованной средой 2×YT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозу. Чашки инкубируют ночь при 30°С. Выросшие клетки собирают и хранят в среде 2×YT, содержащей 30% глицерин, при -70°С. Амплификацию отобранных после первого раунда бактериофагов проводят, как описано в Примере 1.

Второй и третий раунды аффинного обогащения проводят аналогично. При этом используют ФНО-α человека в концентрации 2 и 1,5 мкг/мл соответственно.

Степень обогащения библиотеки антителами, специфическими к ФНО-α человека, проверяют с использованием непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) по способности популяций фаговых антител, полученных в результате каждого раунда аффинного обогащения, связывать ФНО-α человека. Для этого ФНО-α сорбируют на 96-луночные иммунологические планшеты («Медполимер», Россия) в концентрации 0,5 мкг/мл. Места неспецифического связывания блокируют раствором 5%-го обезжиренного молока в фосфатном буфере, рН 7.2. Затем в лунки вносят фаговые антитела, выделенные, как описано в Примере 1, разведенные ФСБР, содержащим 0,1% Твин, и инкубируют 1 час при 37°С. После промывки в лунки вносят анти-М13 мышиную сыворотку в разведении 1:2000, а затем антивидовой конъюгат щелочной фосфатазы («Sigma», США) в разведении 1:4000. В качестве хромогена используют пара-нитрофенилфосфат. В качестве отрицательного контроля используют связывание фаговых антител с обезжиренным молоком. Результаты приведены на фиг.1.

Пример 3. Отбор клонов, способных продуцировать антитела, связывающие ФНО-α человека.

Для получения моноклональных фаговых антител отдельные колонии E.coli TG1 из обогащенной против ФНО-α человека библиотеки пересевают с агаризованной среды в жидкую среду 2×YT, содержащую 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы, и растят до плотности, равной 0,5 при OD₆₀₀. Затем клетки инфицируют фагом-помощником М13К07, осаждают центрифугированием 3300 g, 10 мин и ресуспендируют клеточный осадок в среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл канамицина. Клетки культивируют при 30°С при перемешивании в течение ночи и затем осаждают центрифугированием 10800 g, 10 мин.

Супернатант, содержащий фаговые антитела, исследуют на способность связываться с ФНО-α человека методом ТИФА. ФНО-α человека сорбируют на 96-луночные иммунологические планшеты («Медполимер», Россия) в концентрации 0,5 мкг/мл. Места неспецифического связывания блокируют раствором 3%-го бычьего сывороточного альбумина (БСА, «Sigma», США) в ФСБР. Затем в лунки вносят выделенные, как описано в Примере 1, фаговые антитела, разведенные в ФСБР с 0,1% Твин, и инкубируют 1 час при 37°С. После промывки в лунки вносят анти-М13К07 мышиную сыворотку в разведении 1:2000, а затем антивидовой конъюгат щелочной фосфатазы («Sigma», США) в разведении 1:4000. В качестве хромогена используют пара-нитрофенилфосфат. Контролем неспецифического связывания служит связывание вируса с фагом-помощником М13К07, не несущим фрагментов антител на своей поверхности. В качестве отрицательного контроля используют связывание фаговых антител с БСА. Клоны, продемонстрировавшие сигнал, значение которого в 3 и более раз превышает контроль неспецифического связывания и отрицательный контроль, отбирают как положительные.

В дальнейшем из супернатантов положительных клонов выделяют фаговые антитела с помощью преципитации раствором PEG/NaCl и последующего центрифугирования, как описано в Примере 1.

Пример 4. Получение одноцепочечного антитела scTAB против ФНО-α человека в растворимой форме. Для получения одноцепочечного антитела в растворимой форме, т.е. в виде молекул одноцепочечных антител, не связанных с бактериофагом, используют несупрессорный штамм E.coli HB2151, правильно транслирующий охра-стоп-кодон TAG, находящийся в структуре антитела перед белком р3 бактериофага. Следует отметить, что на С-конце одноцепочечного антитела находится гистидиновый гексамер и С-myc эпитоп для детекции продукции этого антитела.

Культуру клеток HB2151 трансформируют фагмидной ДНК, выделенной из отобранного клона методом щелочного лизиса [14]. Для получения одноцепочечного антитела одну колонию трансформантов пересевают в 5 мл среды 2×YT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 0,1% глюкозы, и подращивают на качалке приблизительно 2 ч. После этого суспензию переносят в колбу, содержащую 50-100 мл среды 2×YT, 100 мкг/мл ампициллина и 0,1% глюкозы, и культивируют при непрерывном перемешивании до оптической плотности 0,6-0,8. Затем клетки индуцируют 100 мМ IPTG до конечной концентрации 1 мМ и растят на качалке при температуре 30°С примерно 4-5 часов.

Выделение растворимых антител из периплазмы проводят, используя набор для очистки антител «Ni-NTA Oiagen», согласно инструкции, прилагаемой к набору. Фракции, полученные при хроматографической очистке, анализируют электрофоретически и методом Вестерн-блот анализа с использованием анти C-myc MKA мыши (фиг.4). Степень очистки определяют сканированием геля на денситометре "Chromoscan 200" (Great Britain); для антитела scTAB она составляет приблизительно 50%. Концентрацию белка в пробе определяют на спектрофотометре SmartSpec™ 3000 (BIO-RAD, США), используя метод Лоури [15]. Для элюата, содержащего антитело scTAB, концентрация белка составляет 0,09 мг/мл, следовательно концентрация антитела scTAB составляет 0,045 мг/мл.

Пример 5. Проверка специфичности одноцепочечного антитела человека scTAB. Специфичность полученного антитела scTAB подтверждают методом Вестерн-блот анализа. ФНО-α человека разделяют электрофоретически в 12% полиакриламидном геле с SDS, переносят на нитроцеллюлозный фильтр 0,45 мкм ("Millipore", США), который после блокирования сайтов неспецифического связывания раствором 3% БСА ("Sigma", США) инкубируют с исследуемым антителом. Связавшиеся антитела выявляют с помощью МКА мыши против С-myc эпитопа (ICN, США) в разведении 1:4000 с последующим добавлением антивидового конъюгата щелочной фосфатазы ("Sigma", США) в разведении 1:4000. Визуализацию иммунного комплекса проводят, добавляя 5-бромо-3-индоло фосфат ("Carl Roth GmbH", Германия) и нитро-тетразолевый синий ("Sigma", США). Результаты подтверждают связывание антитела scTAB с белком с молекулярным весом около 17 кДа, что соответствует молекулярному весу рекомбинантного ФНО-α человека [13]. В качестве отрицательного контроля используют выявление ФНО-а человека с помощью МКА мыши против С-myc эпитопа и антивидовым конъюгатом щелочной фосфатазы, взятых в тех же разведениях (фиг.5).

Пример 6. Определение константы аффинности полученного одноцепочечного антитела scTAB в реакции связывания с рекомбинантным ФНО-α человека. Константу аффинности определяют методом ИФА. На твердую фазу сорбируют рекомбинантный ФНО-α человека в концентрации 0.5 мкг/мл и после блокировки мест неспецифического связывания раствором 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА, "Sigma", США), инкубируют с полученным рекомбинантным антителом, добавленным в последовательных разведениях, начиная с концентрации 2.25 мкг/мл с шагом разведения 1:2. Иммунный комплекс выявляют с помощью МКА мыши против С-myc эпитопа (ICN, США) в разведении 1:4000 с последующим добавлением антивидового конъюгата щелочной фосфатазы ("Sigma", США) в разведении 1:4000. В качестве хромогена используют пара-нитрофенилфосфат ("ICN", США). В качестве отрицательного контроля в параллельных экспериментах тестируют связывание полученного рекомбинантного антитела с БСА. Результаты экспериментов показывают способность полученного рекомбинантного антитела связывать ФНО-α человека (фиг.6). Величину константы аффинности рассчитывают методом наименьших квадратов по формуле

где х - концентрация антител в растворе, R - концентрация сорбированного антигена, k - константа аффинности, А - нормировочный множитель. Величина константы аффинности для рекомбинантного антитела человека 1F4 составляет 3,96±0,52×10⁸ М^-1 (фиг.6).

Таким образом, впервые сконструирована рекомбинантная фагмида pHEN-TAB, содержащая под контролем промотора лактозного оперона ген одноцепочечного антитела человека, способного связывать фактор некроза опухоли альфа человека; трансфекция клеток Escherichia coli HB2151 обусловливает получение штамма Escherichia coli HB2151/ pHEN-TAB -продуцента рекомбинантного одноцепочечного антитела человека scTAB против фактора некроза опухоли альфа человека; получено растворимое рекомбинантное одноцепочечное антитело человека scTAB против фактора некроза опухоли альфа человека с К_аф=3,96±0,52×10⁸ М^-1.

Источники информации

1. Abbas, A.K., Lightman, A.H., Pober, J.S. Cellular and Molecular Immunology. Fourth Edition, 553. - 2000. P.240-246.

2. Konur A, Schulz U, Eissner G, Andreesen R, Holler E. // Br. J. Dermatol. - 2005. Vol. 152 (6). - P.915-919.

3. Carlson DL., Willis MS., White DJ., et al. // Crit Care Med. - 2005. Vol. 33 (5). - P.1021-1028.

4. Kawaguchi M., Mitsuhashi Y., Kondo S. // Br J Dermatol. - 2005. Vol. 152 (5). - P.915-919.

5. Dinarello C.A. / /Eur. Cytokine Netw. - 1994. - Vol. 5 (6). - P.517-531.

6. Fisher C.J. Jr., Dhainaut J.-F., Opal S.M., et al. // J. A. M. A. - 1994. Vol.271 (23). P.1836-1843.

7. Barbas С., Bjorling E., Chiodi F. et al. // Proc. natl. Acad. Sci. USA. - 1992. - Vol. 89. - P.9339-9343.

8. Yokota Т., Milenic D.E., Whitlow M., Schlom J. // Cancer Res. - 1991. - Vol. 51. - P. 6363-6365.

9. Krebs, В., Griffin, H., Winter, G., Rose-John, S. // J. Biol. Chem. - 1998. - Vol. 273 (5). - P.2858-2865.

10. Tikunova N.V., Morozova V.V., Batanova T.A., Belanov E.F., Bormotov N.I., Ilyichev A.A. // Hum. Antibodies. - 2001. - Vol.10 (3-4), - P.95-99.

11. Тикунова Н., Колокольцов A.A., Чепурнов А.А. // ДАН. - 2001. - T.378. C.551-554.

12. Батанова T.A., Улитин А. Б., Жираковская E.В., Ламан А.Г., Бровко Ф.А., Воронина В.В., Тикунова Н.В. // Мол. генет., вирус., микробиол. - 2005.

13. Berkova N, Lemay A, Korobko V, Shingarova L, Sagaidak L, Goupil S. // Cancer Detect Prev. - 1999. - Vol. 23 (1). - P.1-7.

14. Birnboim H.C. and Doly J.A rapid aikalin extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. // Nucl. Acids Res. - 1979. - Vol.7. - P.1513-1523.

15. Lawri E. et al // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193. - P.256.

16. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. M.: ФАИР-ПРЕСС, 1999.

1. Рекомбинантная фагмидная ДНК pHEN-TAB, содержащая ген одноцепочечного антитела человека, способного связывать фактор некроза опухоли альфа человека, размером 5237 п.о, и молекулярной массой 3,46 МДа, включающая

Sfil - NotI - векторный фрагмент фагмиды pHEN2 (MRC, Великобритания) размером 4495 п.о, содержащий сайт инициации репликации плазмиды pUC18, сайт инициации репликации нитчатого бактериофага М13, последовательности, кодирующие гистидиновый гексомер и эпитоп С-myc, промотор Lac-оперона E.coli, ген β-лактамазы (bla), супрессируемый стоп-кодон TAG, фрагмент гена белка pIII фага М 13;

SfiI - NotI - фрагмент размером 742 п.о., представляющий собой искусственный ген одноцепочечного антитела человека, способного связывать ФНО-α человека, в котором вариабельный домен тяжелой цепи соединен с вариабельным доменом легкой цепи иммуноглобулина человека с помощью ДНК последовательности, кодирующей гибкий пептидный линкер Ser(Gly₄Ser)₂AlaArgGlySerGly₄Ser, имеющий нуклеотидную последовательность, приведенную на фиг.2;

содержит

промотор Lac- оперона Е. coli;

генетический маркер: ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость трансформированных фагмидой pHEN-TAB клеток E.coli к ампициллину;

уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющие следующие координаты: HindIII - 235, SfiI - 328, NotI - 1070, EcoRI - 2361.

2. Рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli HB2151/ pHEN-TAB, содержащий рекомбинантную фагмидную ДНК pHEN-TAB, согласно п.1, депонированный в НИИ ККМ ФГУП ГНЦ ВБ "Вектор" под номером В-1077, продуцент одноцепочечного антитела человека, способного связывать фактор некроза опухоли альфа человека.

3. Рекомбинантное растворимое одноцепочечное антитело человека, способное связывать фактор некроза опухоли альфа человека, продуцируемое штаммом по п.2, имеющее аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.2.