Способы диагностики
Изобретение относится к области медицины, конкретно, настоящее изобретение относится к новым неинвазивным способам определения присутствия или отсутствия в биологическом образце антигена Helicobacter pylori или метаболита, продуцируемого бактерией, посредством измерения на основе биосенсора. Изобретение также относится к применению биосенсора, содержащего специфические антитела против H.pylori или их антигенсвязывающие фрагменты, иммобилизованные вместе с отталкивающими биомолекулы полимерами, предотвращающими неспецифическое связывание. Изобретение также относится к наборам для тестирования, используемым в данном способе. Изобретение обеспечивает быстроту и надежность диагностики, способы высокочувствительны и специфичны. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 ил.
Настоящее изобретение относится к новым способам диагностики инфекции Helicobacter pylori. Конкретно, настоящее изобретение относится к новым неинвазивным способам определения присутствия или отсутствия в биологическом образце антигена Helicobacter pylori или метаболита, продуцируемого бактерией, посредством измерения на основе биосенсора. Настоящее изобретение также относится к применению биосенсора, содержащего специфические антитела против Н. pylori или их антигенсвязывающие фрагменты, иммобилизованные вместе с отталкивающими биомолекулы полимерами, предотвращающими неспецифическое связывание. Изобретение также относится к наборам для тестирования, используемым в данном способе.
Предпосылки создания изобретения
Helicobacter pylori представляет собой искривленную грамотрицательную бактерию, обнаруживаемую в верхней части желудочно-кишечного тракта человека. С момента первого выделения бактерии в 1982 г. накоплено огромное количество подтверждений связи Н. pylori с различными желудочными нарушениями, включая диспепсию (изжога, вздутие и тошнота), симптоматическое или асимптоматическое воспаление слизистой желудка, проявляемое в виде хронического поверхностного гастрита или хронического активного гастрита, пептические язвы желудка и двенадцатиперстной кишки и даже рак желудка и различные лимфомы желудка [Dunn B.E. et al., Clinical Microbiology Reviews 10 (1997), 720-740]. В настоящее время предполагается, что почти все случаи пептических язв, ранее рассматривавшиеся как идиопатические, в действительности вызваны инфекцией Н. pylori [NIH Consensus Conference, JAMA 276 (1994), 1710].
Н. pylori представляет собой всемирно распространенный патоген человека. Другие известные виды, переносящие бактерию, представляют собой приматов, отличных от человека. Инфекции Н. pylori связаны с социально-экономическим развитием: в развивающихся странах от 70 до 90% населения заражено бактерией, тогда как в развитых странах распространенность инфекции составляет приблизительно от 25 до 50%. Инфекция приобретается в детстве, обычно до 10-летнего возраста и предполагается, что заболеваемость снижается с улучшением гигиены. Однако путь передачи инфекции точно не известен, хотя предполагается, что фекально-оральный и орально-оральный путь являются наиболее важными (Dunn B.E. et al., см.выше).
Для диагностики инфекции Н. pylori доступны различными способы и анализы как инвазивные, так и неинвазивные. Инвазивные способы включают биопсию желудка или двенадцатиперстной кишки. Образцы для биопсии могут быть исследованы визуально или гистологически, путем культивирования бактерии, тестирования уреазного фермента, продуцируемого Н. pylori, или анализа с использованием генной технологии. Для большинства таких способов доступны коммерческие продукты. Неинвазивные способы включают серологические тесты для обнаружения антител к Н. pylori и проба на содержание мочевины в выдыхаемом воздухе с использованием 13С или 14С-меченной мочевины, для обоих из которых доступны множество коммерческих тестов. Кроме того описаны анализы, измеряющие субстратный метаболизм Н. pylori в сыворотке крови [Moulton-Barret R.G. et al., Am.J.Gastroenterol., 88 (1993), 369-374] и в моче [Pathak C.M. et al., Am.J.Gastroenterol., 88 (1993), 734-738].
В иммунологических анализах измеряется присутствие IgG, IgA или IgM антител против Н. pylori в сыворотке пациента или образцах крови (смотри, например, патент США 5262156; Pyloriset EIA-A и EIA-G, Orion Diagnostica, Finland), образцах мочи (смотри, например, патент США 5262156) и слюне или других образцах слизистых выделений (смотри, например, патент США 6068985; Home Heliobacter Test, Ani Biotech Oy, Finland). Определение антител против Н. pylori имеет несколько недостатков, таких как сильная зависимость от антигенного препарата, используемого для захвата антител, перекрестные реакции антител с родственными разновидностями бактерий и относительно долгий промежуток времени, необходимый для получения надежных результатов теста. Точность так называемых тестов «для кабинета» или «около пациента», предлагаемых для применения во врачебных кабинетах, меньше чем у обычных лабораторных анализов [Cohen H. Et al., Gastroenterology 110 (1996) A83; Sadowski et al., Gastroenterology 110 (1996) A246]. Важно то, что данные анализы, зависящие от обнаружения специфических антител против Н. pylori, являются менее подходящими для применения при оценке и последующем лечении и исцелении, поскольку повышенные уровни антител поддерживаются в течение продолжительного периода времени после лечения и излечивания инфекции. Последующие исследования показали большие варьирования в снижении уровней антител после лечения [Kosunen T.U., et al., Lancet 339 (1992), 893-895; Cutler A., et al., Dig. Dis. Sci., 38 (1993), 2262-2266], но обычно для снижения необходимо несколько месяцев, что достоверно предсказывает излечение.
Данный недостаток позволяет преодолеть обнаружение антигенов или метаболитов Н. pylori вместо специфических антител против Н. pylori. В патентах США 5716791, 5871942 и 5932430 описаны, наряду с прочим, способы обнаружения антигенов Н. Pylori в образцах фекалий за счет комплексообразования антигена с поликлональным антителом и обнаружения образующегося при этом комплекса с помощью второго антитела. В международной патентной заявке WO01/44815 описано обнаружение антигенов Н. pylori в образцах крови с использованием, например, метода ELISA. Данные способы предлагаются для прослеживания влияния лечения на инфекцию Н. pylori.
Однако обычные иммуноанализы, основанные на маркерной молекуле, например, радиоактивно-меченой, ферментативно-меченой, флюоресцентно-меченой или хемолюминисцентно-меченой, являются трудоемкими и времязатратными, поскольку до фактического обнаружения требуется несколько стадий инкубирования, промывок и разделения. Дополнительно, для надежного проведения таких анализов требуется квалифицированный персонал и достаточно дорогое оборудование. Образец, особенно образец фекалий, также может представлять проблемы. Многие пациенты находят, что сбор образца фекалий, не говоря о сборе нескольких образцов фекалий, необходимых в последующем, неприятным и не гигиеничным, и их согласие на лечение может снизиться. Аналогично персоналу может не нравиться обработка образцов фекалий и получение образцов для таких анализов вследствие собственного риска инфицирования.
Таким образом явно необходимы дополнительно улучшенные способы диагностики для диагностирования инфекции Н. pylori.
Соответственно, одна задача настоящего изобретения заключается в разработке высокочувствительных и специфических способов неинвазивного обнаружения и определения антигенов Н. pylori и/или метаболитов, продуцируемых бактерией, в биологическом образце.
Другая задача настоящего изобретения заключается в разработке усовершенствованных способов и средств для достоверного прослеживания действия фармакологического лечения при борьбе с инфекцией Н. pylori и для установления излечения пациента с минимальными неудобствами для пациента.
Следующая задача настоящего изобретения заключается в разработке усовершенствованных способов и средств для обнаружения инфекции Н. pylori, при этом данные способы можно надежно использовать для применения в кабинетах врачей и в центрах здравоохранения, где технические навыки и обычные задачи персонала могут быть не столь развитыми, как в клинических лабораториях.
Следующая задача настоящего изобретения заключается в разработке усовершенствованных способов и средств для обнаружения инфекции Н. pylori, при этом данные способы являются простыми, быстрыми и осуществимыми в реальном времени, так что результаты исследования могут быть получены даже во время визита пациента в больницу или в кабинет врача, тем самым будут исключено несколько посещений пациента.
Краткое изложение сущности изобретения
Неожиданно было установлено, что возможно неинвазивно обнаруживать присутствие или отсутствие Helicobacter pylori в биологическом образце с использованием способов, основанных на применении высокоспецифического и чувствительного биосенсора, что отвечает задачам настоящего изобретения. Биосенсор, используемый в настоящем изобретении, включает подложку-носитель, на которой непосредственно прикреплены специфические антитела против Н. Pylori или их антигенсвязывающие фрагменты вместе с отталкивающими биомолекулы молекулами, которые покрывают поверхность между иммобилизованными антителами или фрагментами антител. Такие отталкивающие биомолекулы молекулы эффективно предотвращают нежелательное неспецифическое связывание аналита и загрязняющих (био)молекул, присутствующих в биологическом образце, и чрезвычайно повышают чувствительность анализа. Применение такого биосенсора дает возможность надежного обнаружения антигенов Н. Pylori и/или метаболитов, продуцируемых бактерией, в биологическом образце.
Настоящее изобретение относится к неинвазивному способу обнаружения присутствия или отсутствия антигена Helicobacter pylori или метаболита, продуцируемого бактерией, в биологическом образце, предусматривающему взаимодействие биологического образца, полученного от пациента, страдающего или предположительно страдающего инфекцией Н. pylori, с биосенсором, включающем подложку носителя, к которой присоединены антитела против Н. pylori или антигенсвязывающие фрагменты вместе с отталкивающими биомолекулы молекулами, и обнаружение сигнала, возникающего при образовании комплекса антитело-антиген.
Настоящее изобретение дополнительно относится к применению биосенсора, включающего подложку-носитель, к которой непосредственно присоединены специфические антитела против Н. pylori или их антигенсвязывающие фрагменты вместе с отталкивающими биомолекулы молекулами, которые покрывают поверхность между иммобилизованными антителами или их антигенсвязывающими фрагментами, для диагностики инфекции Helicobacter pylori.
Настоящее изобретение также относится к тест-набору для обнаружения в биологическом образце присутствия или отсутствия антигена Helicobacter pylori или метаболита, продуцируемого бактерией, где набор для тестирования содержит биосенсор, включающий подложку-носитель, к которой непосредственно присоединены специфические антитела против Н. pylori или их антигенсвязывающие фрагменты вместе с отталкивающими биомолекулы молекулами, которые покрывают поверхность между иммобилизованными антителами или фрагментами антител, и реагенты, необходимые для обнаружения.
Описание фигур
На фиг.1 изображено схематическое представление подложки-носителя/биосенсора, используемых в способе по настоящему изобретению, содержащих Fab' фрагменты антитела против Н. pylori вместе с присоединенными отталкивающими биомолекулы молекулами.
На фиг.2 изображено схематическое представление подложки-носителя/биосенсора, используемых в способе по настоящему изобретению, содержащих коллоидные/наночастицы для усиления сигнала определения.
На фиг.3А и 3В показана стандартная кривая и стандартные отклонения для SPR измерений.
На фиг.4 показаны изотермы SPR связывания для обнаружения Н. pylori в образцах кала. Полоса показывает два измерения с отдельными пленками. BSF37 и BSF48 являются образцами, полученными от пациентов, положительных в отношении Helicobacter pylori, и BSF51 представляет собой образец, полученный от пациента, отрицательного в отношении Helicobacter pylori. Обозначение «ссылка» указывает на пустой образец.
На фиг.5 показаны изотермы SPR связывания для обнаружения Н. pylori в образцах мочи. Образцы 1 и 3 представляют собой образцы, полученные у пациентов, положительных в отношении Helicobacter pylori и образец 2 представляет образец, полученный у пациента, отрицательного в отношении Helicobacter pylori. Обозначение «ссылка» указывает на пустой образец, и BSU относится к образцу мочи пациента.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение основано на разработке способов и средств, достаточно чувствительных и специфических для обнаружения и/или измерения низких количеств комплексов антитело-антиген, образованных в иммунологической реакции между иммобилизованным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, которое является специфическим в отношении бактерии Н. pylori, ее антигена и/или метаболита, продуцируемого бактерией, антигена, являющегося производным Н. pylori. При использовании таких способов и средств антигены Н. pylori и/или метаболиты, продуцируемые бактерией, могут быть обнаружены в любом биологическом образце, получаемом неинвазивно от пациентов, страдающих от инфекции Н. pylori.
Выражения «антиген Н. pylori» и «антиген, являющийся производным Н. pylori», как они использованы в данном описании, относятся к поверхностному антигену или антигену, получающемуся при разрушении или метаболизме бактерии Н. pylori. Выражения «антигенсвязывающий фрагмент» и «фрагмент антитела», как они используются в данном описании, относятся к (Fab')2 или Fab' фрагментам антител, специфических в отношении антигенов Н. pylori.
В способе по настоящему изобретению преимущество достигается за счет специальной подложки-носителя и биосенсора, включающего такую подложку носитель. Данные подложки-носители и биосенсоры описаны в общем виде в заявке на патент Финляндии 20011877, который включен в данное описание путем ссылки. Подложки-носители, используемые в настоящем изобретении, содержат специфические антитела, сформированные против бактерии Н. pylori, или антигенов Н. pylori, или антигенсвязывающих фрагментов данных антител, при этом антитела присоединены к подложке-носителю. Дополнительно подложки-носители также содержат отталкивающие биомолекулы мономерные/полимерные молекулы, присоединенные к той же подложке-носителю, что и антитела или фрагменты антител, для предотвращения неспецифического связывания аналитов и нежелательных загрязняющих (био)молекул, присутствующих в биологическом образце.
Конкретно, подложка несет антитела против Н. pylori или их антигенсвязывающие части, непосредственно иммобилизованные посредством функциональной группы, присутствующей в антителах или фрагментах антител, на твердой поверхности подложки-носителя с образованием слоя ориентированных антигенсвязывающих сайтов (фиг.1). Антитела или фрагменты антител подвергаются самосборке на поверхности подложки, при этом активный антигенсвязывающий сайт остается незащищенным, а функциональная группа, обладающая сродством к поверхности субстрата, является связанной с поверхностью.
Свободные сульфгидрильные группы в антителах или фрагментах антител служат в качестве функциональных групп и могут хемисорбироваться на поверхностях металлов, таких как поверхности золота, серебра, меди, алюминия и палладия, путем ковалентного связывания между атомами металла и атомами серы, образуя таким образом монослой. В антителах или фрагментах антител могут присутствовать другие фрагменты, которые склонны к самосборке, включая тиольные, дисульфидные и сульфгидрильные группы, которые спонтанно хемисорбируются на поверхностях металлов за счет серасодержащих функциональных групп. Если необходимо и желательно, к антителу или фрагменту антитела также могут быть введены новые функциональные группы путем превращения его структурной части в функциональную группу или с использованием линкерных молекул, содержащих функциональную группу.
Альтернативно можно использовать известные способы достижения контролируемой иммобилизации антител, при условии, что они отвечают критериям специфичности и чувствительности. Такие способы включают, наряду с прочим, селективное связывание через белок А или белок G [смотри, например, Lekkala J. and Sadowsky J., Chemical Sensor Technology 5 (1994) 199-213], ковалентное связывание через свободную сульфгидрильную группу в петлевой области Fab' фрагментов [смотри, например, Fischer B., et al., Langmuir 9 (1993), 136-140] и биотинилированные антитела, прикрепленные к поверхности с использованием химии биотин/(стрепт)авидина [Morgan H. and Taylor D.M., Biosens.Bioelectron., 7 (1992), 405-410]. Предпочтительным является непосредственное присоединение через функциональную группу, присутствующую в антителах Н. pylori или фрагментах антител.
Аналогично отталкивающие биомолекулы молекулы также подвергаются самосборке за счет свободных сульфгидрильных или других серасодержащих групп на поверхности и покрывают твердую поверхность между антителами или фрагментами антител. Термин «отталкивающая биомолекулы молекула», как он используется в данном описании, относится к молекулам, которые присоединены к твердой поверхности с образованием гидрофильного слоя между иммобилизованными антителами, и чьи силы притяжения меньше, чем силы отталкивания в отношении аналита и загрязняющих (био)молекул. Отталкивающие биомолекулы молекулы, используемые в биосенсоре по настоящему изобретению, включают нейтральные гидрофильные мономеры или полимеры, такие как полиакриламид, поли-N,N-диметилакриламид, поливиниловый спирт, сополимер этилена и винилового спирта, поли(гидроксиэтилметакрилат), поли(этиленоксид) и поли(этиленгликоль). Также можно использовать другие полимеры, такие как полиэтиленфталат, политетрафторэтилен, полиуретан и аналогичные биосовместимые полимеры. Предпочтительными отталкивающими биомолекулы молекулами, используемыми в настоящем изобретении, являются полиакриламид и поли-N,N-диметилакриламид, при этом особенно предпочтительным является N-[трис(гидроксиметил)метил]акриламид.
Отталкивающие биомолекулы полимеры предпочтительно ковалентно присоединены к твердой поверхности через подходящую функциональную группу (терминальная якорная группа), такую как сульфидная, дисульфидная или тиольная группа, на одном кольце полимера. Обычно, отталкивающий биомолекулы полимер содержит ОН-группы на другом конце молекул, образуя таким образом гидрофильный слой. Толщина слоя отталкивающих биомолекулы молекул предпочтительно немного меньше, чем толщина слоя антител на твердой поверхности.
Твердая поверхность подложки-носителя, используемой в настоящем изобретении, относится к типу, который может индуцировать изменение сигнала, который излучается на субстрат для взаимодействия с сочетанием субстрата, иммобилизованных антител или фрагментов антител и связанного аналита, и при последующем детектировании изменение сигнала указывает на увеличение массы вещества на субстрате (т.е. накопление молекул аналита, селективно связанных с биомолекулами, иммобилизованными на поверхности субстрата).
Используемый материал твердой поверхности, который может использоваться для обнаружения увеличения массы на его поверхности, зависит от выбранного метода анализа и представляет собой пленку подходящей толщины из подходящего материала. Таким образом, твердая поверхность может представлять собой пленку из материала, совместимого с методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR), такого как золото, серебро, медь, алюминий, палладий или другого подходящего металла, предпочтительно из золота, когда для анализа используется SPR-измерение; электрод, покрытый золотом или другим подходящим металлом, таким как один из вышеперечисленных металлов, в том случае, когда используется технология микробаланса кварцевого кристалла (QCM), или подходящее металлическое покрытие в устройстве поверхностной акустической волны (SAW), или на электроде, при использовании методов на основе SAW или электрохимических методов, соответственно.
Необязательно при желании в реакционную смесь могут быть включены отдельные частицы, такие как коллоидные или наночастицы, аналогичным образом покрытого материала, который используется для твердой поверхности, для усиления сигнала определения (фиг.2).
Антитела и фрагменты антител, используемые в настоящем изобретении, могут представлять собой любые поликлональные или моноклональные антитела или фрагменты антител, которые способны связываться с антигеном Н. pylori. К подложке-носителю также могут быть присоединены смеси антител или фрагменты антител, возникающие против различных штаммов Н. pylori, для установления чувствительности и специфичности обнаружения. Предпочтительно используются моноспецифические поликлональные или моноклональные антитела, наиболее предпочтительно моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. Для того чтобы гарантировать корректную ориентацию, предпочтительными являются фрагменты антител, т.е. F(ab')2 и Fab' фрагменты, при этом Fab' фрагменты являются наиболее предпочтительными вследствие повышенной чувствительности. Иллюстративными примерами являются коммерческие моноклональные антитела против Н. pylori, продуцируемые клонами 7101 и 7102, доступные от Medix Biotechnica, Kaunianen, Финляндия, или их антигенсвязывающие фрагменты.
Предпочтительно антитела или фрагменты антител, принадлежащие к классу IgG, присоединяют к подложке-носителю. Однако, там где это применимо, также можно использовать антитела или фрагменты антител, принадлежащие к IgM или IgA классу иммуноглобулинов.
Количество антител или фрагментов антител, используемое для получения подложки-носителя, а также получение фрагментов антител, когда это необходимо, входят в объем знаний специалиста в данной области. Аналогично количество отталкивающих биомолекулы молекул, используемое для получения подложки-носителя, может быть определено с использованием стандартного способа специалистом в данной области. Обычно как антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, так и отталкивающие биомолекулы молекулы используют в избытке, чтобы гарантировать оптимальные рабочие характеристики подложки-носителя. В данном аспекте сошлемся на представленный ниже пример 1 и также на заявку на патент Финляндии 20011877, включенную в данное описание в качестве ссылки. При получении подложки-носителя антитело или фрагмент антитела и отталкивающие биомолекулы молекулы могут быть присоединены одновременно или последовательно. Альтернативно, отталкивающие биомолекулы молекулы могут быть присоединены к подложке-носителю, уже содержащей иммобилизованные антитела.
Слой, содержащий антитело или фрагмент антитела, может быть регенерирован с использованием подходящего раствора, такого как раствор 0,1М HCl-глицин, рН 1-2 или 0,1М фосфатного буфера, рН 2-7. Это обеспечивает дополнительно преимущество подложки-носителя, т.е. подложка может использоваться повторно до 10 раз, что дает существенное преимущество с точки зрения как стоимости, так и удобства для пользователя.
Биологический образец для анализа может представлять собой любой жидкий или растворимый биологический образец. Таким образом, биологический образец может представлять собой цельную кровь, сыворотку крови, мочу, слюну или другие слизистые секреты, слезную жидкость или фекалии. Также, при желании, с использованием способов по настоящему изобретению можно анализировать образцы, полученные при биопсии. Образец может быть проанализирован как таковой или в концентрированном виде с использованием подходящих способов.
Правильная ориентация специфических антител или фрагментов антител и применение отталкивающих биомолекулы молекул на подложке-носителе по настоящему изобретению позволяют осуществлять простое и быстрое обнаружение инфекции Н. pylori в биологических образцах. Кроме того, данные отличительные особенности дают специфичность и чувствительность достаточно высокие для осуществления, при желании, количественного или полуколичественного измерения антигенов Н. pylori в дополнение к качественным измерениям. Это является преимуществом, особенно с позиций прослеживания эффективности фармакологического лечения инфекции Н. pylori, при этом обычно довольно тяжелый и продолжительный протокол может быть изменен на ранней стадии, если выбранное лечение не является эффективным. Общее исцеление может быть продемонстрировано намного раньше, чем при измерении антител. Также легко могут быть обнаружены новые или рецидивные инфекции. Количественное измерение антигенов Н. pylori также может обеспечить информацию о продолжительности и серьезности инфекции, что может оказаться полезным при выборе лечения.
В способе по изобретению биологический образец, полученный от пациента страдающего или предположительно страдающего инфекцией Н. pylori, приводят во взаимодействие с подложкой-носителем биосенсора, подробно описанной выше, и обнаруживают сигнал, появляющийся при образовании комплекса антитело-антиген. Подложка-носитель и биосенсор по изобретению могут наноситься на любые стандартные платформы, использующуюся при измерениях на основе биосенсоров. Однако методы обнаружения, которые являются особенно подходящими в способе по настоящему изобретению, представляют собой поверхностный плазмонный резонанс (SPR), резонаторную технологию толщины сдвиговой волны, такую как микробаланс кварцевого кристалла (QXM), метод поверхностных акустических волн (SAW устройства) и электрохимические измерения. Метод поверхностного плазмонного (SPR) резонанса является особенно предпочтительным.
Тест-набор по настоящему изобретению содержит реагенты для осуществления способа по настоящему изобретению. Конкретно, тест-набор содержит биосенсор, включающий подложку-носитель, к которой непосредственно присоединены специфические антитела против Н. pylori или их антигенсвязывающие фрагменты вместе с отталкивающими биомолекулы молекулами, которые покрывают поверхность между иммобилизованными антителами или фрагментами антител, и реагенты, необходимые для измерения, такие как стандарты, контроли, промывочные растворы и растворы для разведения.
Следующие неограничивающие примеры проясняют настоящее изобретение.
Пример 1
Общий способ получения подложки-носителя по изобретению
Для получения подложки-носителя первоначально получали Fab'-фрагменты из специфического моноклонального антитела против Н. pylori следующим образом. Первоначально получали F(ab')2 фрагменты с использованием набора ImmunoPure F(ab')2 Preparation Kit (PIERCE, США) из моноклональных антител против Н. pylori, таких как клоны 7101 и 7102 моноклональных антител против Н. pylori (Medix Biotechnica, Kaunianen, Финляндия). Равным образом можно использовать другие известные коммерческие наборы и способы. Затем F(ab')2 фрагменты расщепляли на Fab'-фрагменты с помощью дитиот-реитола (DTT, Merck) в буфере HEPES/EDTA, содержащем 150 мМ NaCl, 10мМ HEPES, 5 мМ EDTA, pH 6,0, обычно в течение ночи в трубке для микродиализа, как описано Ishikawa [Ishikawa E., J.Immunoassay 4 (1983), 209-320]. Кратко, F(ab')2 фрагменты в концентрации 0.2-0,5 мг/мл смешивали с буфером HEPES/EDTA и 6.25 мМ раствора DTT в трубке для микродиализа. Трубку для диализа погружали в 250 мл продутого аргоном буфера HEPES/EDTA и подвергали диализу в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона. Fab'-фрагменты сохраняли в аргоне и сразу же использовали для присоединения.
Твердую поверхность получали следующим образом. Стеклянные предметные стекла покрывали тонкой пленкой титана для увеличения адгезии золота и затем тонкой пленкой золота с использованием выпаривания в вакууме. Непосредственно перед употреблением предметные стекла очищали в горячем растворе Н2О2:NH4OH:H2O (1:1:5) и ополаскивали водой. Предметные стекла прикрепляли с помощью масла, согласующего показатель преломления, к SPR призме в устройстве поверхностного плазмонного резонанса (SPRDEVI, VTT, Tampere, Finland), проточную ячейку собирали на призме и проточную ячейку тщательно ополаскивали буферным раствором, содержащим 10 мМ HEPRS, 150 мМ NaCl, pH 6, полученным с использованием воды высокой очистки (18,2 М Ωсм; Milli-Q система, Millipore Co., Bedford, USA).
Fab' фрагменты (850 мкл) в концентрации 70 мкг/мл в 10 мл буфера HEPES/EDTA, pH 6, добавляли в проточную ячейку. Fab' фрагментам давали возможность взаимодействовать с покрытой золотом поверхностью обычно в течение 5 минут с последующим прополаскиванием поверхности буфером HEPES/EDTA в течение 5 минут. Затем буфер заменяли на 0,1М забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), pH 7,2 и оставляли взаимодействовать на поверхности с 1-1,5 мл раствора N-[трис(гидроксиметил)метил]акриламида в концентрации 0,15 мг/мл в PBS буфере в течение 5 минут. Затем поверхность блокировали бычьим сывороточным альбумином (БСА).
Пример 2.
Общая методика измерения антигенов Н. pylori с помощью SPR
Антигены Н. pylori могут быть измерены в биологическом образце с использованием следующей общей методики SPR. Поверхность подложки-носителя, полученной как описано в примере 1, споласкивают PBS, pH 7,2. Отрицательный образец (пустой) запускают первым. Используемый отрицательный образец зависит от типа биологического образца, предназначенного для измерения. Таким образом, например, когда измеряют образец кала, отрицательный образец представляет собой образец кала, отрицательный в отношении Н. pylori, когда измеряют образец мочи, отрицательный образец представляет собой образец мочи, полученный от субъекта, не инфицированного Н. pylori, и когда планируется измерить образец сыворотки, отрицательный образец представляет собой образец сыворотки, полученный от субъекта, не инфицированного Н. pylori. Поверхность подложки-носителя последовательно подвергают взаимодействию со стандартным раствором, положительным и отрицательным контролями и образцами путем заполнения растворами, предназначенными для измерения, проточную ячейки измеряющего устройства на 10 минут каждый и регистрации сигнала. Проточную ячейку споласкивают PBS, pH 7,2, в течение 5 минут между измерениями.
Пример 3
Получение стандартной кривой и воспроизводимость измерения
Антиген Н. pylori, который использовали в качестве стандарта, экстрагировали из бактериальной массы штамма Н. pylori АТСС 49503 с использованием методики экстракции глицин-кислота, описанной Rautelin и Kosunen [J.Clin.Microbiol., 25 (10) 91987), 1944-1951]. Концентрацию белка определяли с использованием анализа Бредфорда [Bradford, Anal. Biochem., 72 (1976), 248]. Стандарты разводили в 0,1М PBS, pH 7,2, до концентраций 0,001, 0,01, 0,1, 0,1, 1, 10, 100 и 270 мкг/мл и действовали в соответствии с общей методикой, описанной в примере 2. Для анализа воспроизводимости проводили три отдельных измерения в последующие дни.
Результаты представлены на фиг.3А. Стандартная кривая, представленная на фиг.3А, показывает, что ответная реакция прямо сопоставима с концентрацией антигена в полулогарифмической шкале. В таблице 1 показаны стандартные отклонения от трех отдельных измерений на стандартной кривой в последующие дни (фиг.3В). Получена прекрасная воспроизводимость.
| Таблица 1: SPR интенсивность, полученная для стандартов | ||
| Концентрация Н. pylori [мкг/мл] | Изменение интенсивности [мВ] | Стандартное отклонение [мВ] |
| 0,001 | 0,004 | |
| 0,01 | 0,005 | 0,001 |
| 0,1 | 0,009 | 0,004 |
| 1 | 0,014 | 0,005 |
| 10 | 0,031 | 0,004 |
| 100 | 0,062 | 0,014 |
| 270 | 0,102 | 0,010 |
Пример 4.
Обнаружение антигена Н. pylori в образцах кала и стула
Образцы кала и мочи, полученные от пациентов, инфицированных Н. pylori (инфекция подтверждена биопсией), и от неинфицированных пациентов анализировали с использованием SPR в соответствии с общей методикой, описанной в примере 2. Инфицирование пациентов Н. pylori было диагностировано по образцу биопсии с помощью коммерческого быстрого уреазного теста и подтверждали оценкой патолога.
Образцы стула получали следующим образом. 0.1 г стула суспендировали в 500 мкл 0.1 М фосфатного буферного раствора, рН 7,2 и интенсивно перемешивали в течение 15 секунд. Суспензию центрифугировали в течение 5 минут при 5000 об/мин и супернатант использовали для измерения. Образцы мочи анализировали как таковые.
Проводили измерения для двух образцов стула, образцы BSF37 и BSF48 получены от пациентов с инфекцией Н. pylori, подтвержденной биопсией. Третий образец, BSF51, получен от пациента, отрицательного в отношении Н. pylori. Измерения проводили с использованием двух отдельных пленок. Результаты показаны на фиг.4. Неспецифическое связывание для слоя составляло 0,0013±0,0006 мВ (n=3, сравнивали два различных слоя). Ответная реакция полученного от пациента образца BSF48 составила 0,0136±0,0004 мВ и для полученного от пациента образца BSF37 0,0113 мВ, т.е. в десять раз и в восемь раз, соответственно, превышало фоновое значение. Полученный от отрицательного пациента образец BSF51 дал интенсивность 0,00096 мВ. Результаты четко показывают, что методом по изобретению специфически обнаруживается антиген Н. pylori, присутствующий в образцах стула.
Проводили измерения для двух образцов мочи, образцы 1 и 3 получены от пациентов с инфекцией Н. pylori, подтвержденной биопсией. Третий образец, образец 2, получен от пациента, отрицательного в отношении Н. pylori. Результаты показаны на фиг.5. Неспецифическое связывание для слоя составляло 0,0185±0,0050 мВ. Ответная реакция полученного от пациента образца 1 составляла 0,117 мВ и для полученного от пациента образца 3 - 0,044 мВ, т.е. в 6.3 и в 2,4 раза, соответственно, изменялась по сравнению с фоном. Полученный от отрицательного пациента образец 2 дал интенсивность 0,008 мВ. Результаты четко показывают, что методом по изобретению специфически обнаруживается антиген Н. pylori, присутствующий в образцах мочи.
1. Неинвазивный способ обнаружения присутствия или отсутствия антигена Helicobacter pylori или метаболита, продуцируемого бактерией, в биологическом образце, включающий взаимодействие биологического образца, полученного от пациента, страдающего или предположительно страдающего инфекцией Н.pylori, с биосенсором, включающем подложку-носитель, к которой присоединены антитела против Н.pylori или антиген-связывающие фрагменты вместе с отталкивающими биомолекулы молекулами, где как антитела против Н.pylori или антиген-связывающие фрагменты, так и отталкивающие биомолекулы молекулы непосредственно присоединены к твердой поверхности подложки-носителя, и обнаружение сигнала, возникающего при образовании комплекса антитело-антиген.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что молекулы, отталкивающие биомолекулы, представляют собой нейтральные гидрофильные мономеры или полимеры.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что отталкивающие биомолекулы молекулы выбирают из полиакриламида, поли-N,N-диметилакриламида, поливинилового спирта, сополимера этилена и винилового спирта, поли(гидроксиэтилметакрилата), поли(этиленоксида) и поли(этиленгликоля) и полиэтиленфталата, политетрафторэтилена, полиуретана и аналогичных биосовместимых полимеров.
4. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что отталкивающие биомолекулы молекулы выбирают из полиакриламида или поли-N,N-диметилакриламида.
5. Способ по п.3, отличающийся тем, что отталкивающие биомолекулы молекулы представляют собой молекулы N-[трис(гидроксиметил)метил]акриламида.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что твердая поверхность поверхности подложки-носителя представляет собой пленку материала, совместимого с поверхностным плазменным резонансом (SPR).
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что твердая поверхность поверхности подложки-носителя представляет собой пленку золота, серебра, меди, алюминия, палладия или другого подходящего металла.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что твердая поверхность поверхности подложки-носителя представляет собой пленку золота.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что обнаружение осуществляют методом поверхностного плазменного резонанса (SPR).
10. Применение биосенсора, содержащего подложку-носитель, к которой непосредственно присоединены специфические антитела против Н.Pylori или их антиген-связывающие фрагменты вместе с отталкивающими биомолекулы молекулами, которые покрывают поверхность между иммобилизованными антителами или их антиген-связывающими фрагментами, для обнаружения в биологическом образце присутствия или отсутствия антигена Helicobacter pylori или метаболита, продуцируемого бактерией.
11. Набор для обнаружения в биологическом образце присутствия или отсутствия антигена Helicobacter pylori или метаболита, продуцируемого бактерией, где набор для тестирования содержит биосенсор, содержащий подложку-носитель, к которой непосредственно присоединены специфические антитела против Н.Pylori или их антиген-связывающие фрагменты вместе с отталкивающими биомолекулы молекулами, которые покрывают поверхность между иммобилизованными антителами или их антиген-связывающими фрагментами, реагенты, необходимые для калибровки и количественного контроля, и вспомогательные реагенты, такие как промывочные растворы и буферы для разведения.
