Способ определения функциональной активности симпато-адреналовой системы
Владельцы патента RU 2310196:
Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук (RU)
Изобретение относится к медицине, а именно к экологической физиологии и эндокринологии. Для определения функциональной активности симпато-адреналовой системы (САС) животных и человека исследуют кровь. Осуществляют приготовление трех проб крови, разведенных в 200 раз, причем первой - с изотоническим раствором хлорида натрия, второй контрольной - с раствором фитогемагглютининов, третьей опытной - с раствором фитогемагглютининов и пропранолола. Инкубируют пробы в течение 10 минут. Подсчитывают под микроскопом в камере Горяева количество свободных неагглютинировавших эритроцитов. Вычисляют показатель активности (АК) по формуле:
где Эр - количество эритроцитов в 0,85% растворе NaCl; Контр. - количество эритроцитов в растворе ФГА; ПП - количество эритроцитов в растворе ФГА и пропранолола. При АК ниже 80% считают САС неактивной. Использование способа позволяет повысить точность оценки САС.
Изобретение относится к физиологии и медицине и может быть использовано в экологической физиологии, эндокринологии, а также в клинических и экспериментальных исследованиях для биотестирования различных гормональных и других биологически активных веществ, в том числе и фитоэкдистероидов.
Известны радиоиммунологические методы, методы ЯМР и флуоресцентных зондов для определения концентрации свободных и связанных с рецепторами катехоламинов (Справочник практического врача /Под ред. Воробьева А.И. М.: Медицина, 1992).
Недостаток этих методов заключается в необходимости использования сложной медицинской аппаратуры, специально оборудованных помещений и специально обученного персонала, дорогостоящих реактивов.
Известен способ определения состояния (симпато-адреналовой системы) САС по антигемолизирующему эффекту при использовании метода гипоосмотического гемолиза эритроцитов в сочетании с ПП-тестом (Соминский В.Н., Соковнин В.М., Окунь К.В. Параметры кинетики взаимодействия пропранолола с мембраной эритроцитов у лиц с различным антигемолизирующим эффектом этого препарата // Космическая биология и авиакосм. медицина, 1988, №3, С.86-88; Соминский В.Н., Бердышева Л.В., Блума Р.К. и др. Использование эритроцитов крови для прижизненной оценки функционального состояния адренорецепторов // Физиол. журн. СССР им. Сеченова, 1989, №2. с.189-193).
Недостаток известного способа заключается в необходимости относительно большого количества крови и сложной математической обработке.
Известен способ оценки состояния симпатоадреналовой системы человека (SU 1422158, А1 07.09.1988), выбранный за прототип, сущность которого заключается в следующем. Из крови пациента отделяют эритроциты, трехкратно их отмывают в охлажденном физиологическом растворе, добавляют 8-10 мг ЭДТА к 1-2 мл эритроцитарной взвеси и экстрагируют катехоламины (А и НА) в 0,4 н. надхлорной кислоте в течение 30 мин. После отделения белого хлопьевидного осадка путем центрифугирования сливают полученный супернатант и доводят рН до 8,5. Проводят адсорбционную колоночную хроматографию, в качестве сорбента используя окись алюминия. Проводят элюцию катехоламинов, двукратно добавляя 3,5 мл 0,25 н. уксусной кислоты для получения уксуснокислого элюата и дальнейшего окисления катехоламинов. Элюат окисляют ферроцианидом калия в фосфатном буфере рН 4,2-6,2 для получения продуктов окисления А и НА. Измеряют флюоресценцию А и НА, регистрируют разницу опытных и контрольных проб и по их значению судят о тяжести заболевания.
Известный способ является многостадийным и трудоемким, что влияет на точность результатов исследований.
Задачей изобретения является разработка нового способа определения состояния симпато-адреналовой системы.
Техническим результатом предложенного способа является повышение точности оценки САС, это позволяет использовать способ для мониторинга и экспресс-оценки САС животных и человека.
Способ основан на методе фитогемагглютинации, предложенном Н.А.Моисеенко, Л.И.Иржаком для качественной характеристики гетерогенной популяции эритроцитов (Мойсеенко Н.А., Иржак Л.И. Агглютинация эритроцитов кролика при напряженном эритропоэзе // Журн. общей биол., 1972. Т. 33. №6, С.779-786.4).
Мембрана эритроцитов содержит β-адренорецепторы и может отражать состояние адренорецепторов в других органах и тканях. Нами предложено использовать метод фитогемагглютинации в сочетании с ПП-тестом. ПП-тест позволяет сравнить исходный контрольный образец крови с фитогемагглютининами (ФГА) с имитацией in vitro его состояния при стрессе.
Технический результат достигается тем, что в способе определения функциональной активности симпато-адреналовой системы (САС) животных и человека, включающем исследование крови, согласно изобретению осуществляют приготовление трех проб крови разведенных в 200 раз, причем первой - с изотоническим раствором хлорида натрия, второй контрольной - с раствором фитогемагглютининов; третьей опытной - с раствором фитогемагглютининов и пропранолола, инкубацию проб - в течение 10 минут, количественный подсчет под микроскопом в камере Горяева свободных неагглютинировавших эритроцитов, вычисляют показатель активности (АК) по формуле:
где Эр - количество эритроцитов в 0,85% растворе NaCl;
Контр. - количество эритроцитов в растворе ФГА;
ПП - количество эритроцитов в растворе ФГА и пропранолола,
И при АК ниже 80% считают САС неактивной.
Способ осуществляется следующим образом.
В изобретении используется пропранолол (ПП) - неселективный блокатор β-адренорецепторов и солевая вытяжка в 0,85% растворе NaCl фитогемагглютинина из гороха посевного (Pisum sativum L.) (Мойсеенко Н.А., Иржак Л.И. Агглютинация эритроцитов кролика при напряженном эритропоэзе // Журн. общей биол., 1972. Т. 33. №6, С.779-786). Раствор ФГА готовят экстрагированием их из размолотых семян гороха посевного (Pisum sativum L.) 0,85% раствором NaCl в течение 2-х суток в бытовом холодильнике при t=4C°. Вес сухой навески к объему раствора NaCl как 1:5. Полученную вытяжку фильтруют через обеззоленный фильтр.
Кровь с антикоагулянтом от человека или экспериментального животного, тщательно перемешанную в разведении 200 раз, набирают в эритроцитарные меланжеры и проводят количественное определение реакции агглютинации эритроцитов.
В первой пробе кровь разводят с 0,85% NaCl и определяют общее количество эритроцитов.
Вторую контрольную пробу разводят раствором ФАГ и определяют количество свободных, не вовлеченных в реакцию агглютинации эритроцитов.
Третью опытную пробу разводят раствором ФАГ+ПП и определяют количество свободных эритроцитов.
Подсчет эритроцитов, не подвергшихся агглютинации, проводят через 10 минут инкубации под микроскопом в камере Горяева в пяти больших квадратах. Вычисляют количество агглютинировавших эритроцитов по разнице между общим количеством эритроцитов (проба 1) и количеством свободных неагглютинировавших эритроцитов в пробах 2 и 3. Опытная проба 3 позволяет сравнить исходную агглютинабельность контрольного образца в растворе ФГА с имитацией in vitro его состояния при стрессе.
По способности β-адренорецепторов связываться с ПП определяют показатель активности симпато-адреналовой системы по простой математической формуле, в которой сравниваются степени агглютинации эритроцитов в контрольной (с ФГА) и опытной (с раствором ФГА и пропранолола) пробах.
где АК - активность САС;
Эр - количество эритроцитов в 0,85% растворе NaCl;
Контр. - количество эритроцитов в растворе ФГА;
ПП - количество эритроцитов в растворе ФГА и пропранолола.
Экспериментально установлено, что симпато-адреналовая система не активирована, если показатель активности ниже 80%, т.е. имеются значительные различия в контрольной и опытной пробах.
Пример 1
Берут кровь с антикоагулянтом от интактной крысы, набирают в эритроцитарные меланжеры, при этом кровь набирают до метки 0,5, до метки 101 - раствор ФГА (контрольная проба), опытная проба - ФГА с ПП: до метки 0,5 - кровь, до 1 - ПП с концентрацией 10-6 моль/литр, до метки 101 - раствор ФГА. Содержимое меланжеров в течение этого времени перемешивают. Осуществляют подсчет свободных неагглютинировавших эритроцитов в 5 больших квадратах.
Общее количество эритроцитов в 5 больших квадратах Эр. - 495; в контр. - 312, в ПП-пробе - 371.
САС не активирована.
Пример 2
Осуществляют оценку САС по вышеописанному способу при введении экспериментальной крысе 20-гидроксиэкдизона (20 Е) в дозе 20 мг/кг из растения серпухи венценосной S. coronata L. (Володин В.В., Володина С.О. Способ получения экдистероидов. Пат.2153346. Россия. МКИ 3A61К 35/78. Заявл. 29.03.1999. №99106351/14, Опубл. 27.07.2000. // Б.И. 2000. №21).
Эр - 571; ПП - проба 399; контроль - 297 эр.
САС не активирована.
Пример 3
Осуществляют оценку САС по вышеописанному способу после физической нагрузки (плавание в течение 40 минут) экспериментальной крысе.
Эр=480; контр. проба - 247; ПП-проба 273 эр.
САС умеренно активирована.
Пример 4
Осуществляют оценку САС по вышеописанному способу при введении экспериментальной крысе тироксина в дозе 30 мг/кг веса.
Эр=580; контр. проба 352; ПП-проба 368 эр.
САС значительно активирована.
Экспериментально установлено и подтверждено, что чем ближе показатель АК к 100%, тем выше активность САС. Наименьшая активность САС у интактной крысы и у крысы, которой вводился 20-Е; у животных при введении тироксина и физической нагрузке (стрессорный фактор) отмечена более высокая активность САС, максимальная при введении тироксина.
Таким образом, предлагаемый способ прост и не требует специальной подготовки и может быть проведен параллельно с клиническим определением общего количества эритроцитов в крови.
Способ легко реализуется в обычных клинических лабораториях, не требует сложного оборудования. Необходимое для анализа количество крови можно брать из отходов крови с антикоагулянтом, которые обычно остаются в клинических лабораториях после ряда стандартных анализов, или получать проколом кожи людей, лабораторных и диких животных. Важно лишь, чтобы хранились они без замораживания не более 24 часов после их изъятия из организма. Высокая чувствительность предлагаемого способа допускает применение его для оценки степени адаптированности людей и животных к условиям деятельности и среды обитания, а также функциональных резервов организма.
Способ определения функциональной активности симпато-адреналовой системы (САС) животных и человека, включающий исследование крови, отличающийся тем, что осуществляют приготовление трех проб крови разведенных в 200 раз, причем первой - с изотоническим раствором хлорида натрия, второй контрольной - с раствором фитогемагглютининов; третьей опытной - с раствором фитогемагглютининов и пропранолола, инкубацию проб в течение 10 мин, количественный подсчет под микроскопом в камере Горяева свободных неагглютинировавших эритроцитов, и вычисляют показатель активности (АК) по формуле
где Эр - количество эритроцитов в 0,85% растворе NaCl;
Контр. - количество эритроцитов в растворе ФГА;
ПП - количество эритроцитов в растворе ФГА и пропранолола,
и при АК ниже 80% считают САС не активной.
