Способ количественного определения растворимого фибрина
Изобретение относится к способу количественного определения растворимого фибрина в образце плазмы крови, согласно которому вышеуказанный образец вводят в контакт с активатором плазминогена с высокой специфичностью к растворимому фибрину (PA-Fb sp) и определяют содержание в образце растворимого фибрина путем установления разницы между содержанием продуктов распада фибрина, представляющих собой D-димеры, получаемым после распада растворимого фибрина с помощью PA-Fb sp, и базовым содержанием продуктов распада фибрина, определяемым в вышеуказанном образце до введения его в контакт с PA-Fb sp. Также изобретение касается набора для осуществления заявленного способа, реагента, применяемого в заявленном способе и наборе в качестве положительного контроля, применения активатора плазминогена с высокой специфичностью к растворимому фибрину в заявленном способе и применение заявленных способа и набора для наблюдением за развитием процесса активации коагуляции и оценки эффективности антикоагулянтной терапии. Заявленный способ позволяет следить за развитием процесса активации коагуляции, оценивать эффективность антикоагулянтной терапии и определять, происходит ли снова активация коагуляции при прекращении терапии. 6 н. и 15 з.п. ф-лы, 6 табл.
Настоящее изобретение относится к способу количественного определения растворимого фибрина по образованию специфических продуктов распада в образце крови.
Во время активации коагуляции происходит образование тромбина, который приводит к возникновению осадка фибрина и образованию растворимого фибрина.
В самом деле, тромбин отщепляет от молекулы фибриногена фибринопептид А, приводящий к образованию мономеров фибрина, в которых сайты полимеризации "А", замаскированные в фибриногене, раскрываются, что приводит к взаимодействию между сайтами "А" молекулы мономера фибрина с сайтами "а", одинаково доступными как в фибриногене, так и в фибрине. Во-вторых, происходит высвобождение фибринопептида В, приводящее к раскрытию сайтов полимеризации "В", следствием которого является взаимодействие между сайтами "В" молекулы мономера фибрина с сайтами "b", одинаково доступными как в фибриногене, так и в мономерах фибрина.
Когда количество тромбина очень велико (тесты in vitro), весь фибриноген превращается в мономеры фибрина, которые полимеризуются вследствие взаимодействия сайтов "А" и "а", с одной стороны, и "В" и "b", с другой стороны, давая фибриновый сгусток. In vivo, однако, образование тромбина является намного менее интенсивным. Образование мономеров фибрина является также намного менее "взрывным", и в силу этого часть мономеров фибрина полимеризуется с образованием фибрина (тромб), а другая часть реагирует с фибриногеном, где сайты "а" и "b" являются доступными, или с продуктами деградации фибриногена, с образованием растворимого фибрина, в котором мономеры фибрина ассоциированы с фибриногеном.
Целью определения растворимого фибрина является изучение того, происходит ли у пациента активация коагуляции, причем признаком этой активации является наличие растворимого фибрина в крови, в особенности в плазме.
Это определение является необходимым дополнением к количественному определению D-димеров, образующихся в результате фибринолиза фибрина, представляющего собой тромб, который также является маркером процесса активации коагуляции. В самом деле, in vivo, содержание в плазме D-димеров повышается, как только сгусток деградирует. Поэтому, если имеется тромб и происходит его деградация, содержание D-димеров будет увеличиваться, вне зависимости от того, продолжается ли коагуляция или она остановлена, при этом содержание растворимого фибрина более не будет увеличиваться, если коагуляция остановлена, и, наоборот, будет возрастать, если коагуляция продолжается.
Специфическое измерение содержания в плазме растворимого фибрина по отношению к содержанию D-димеров, следовательно, позволяет
1. определять, происходит ли процесс коагуляции у пациента в момент осуществления взятия образца для анализа;
2. оценивать коагулолитический баланс. В самом деле, in vivo, содержание базовых D-димеров является отражением деградации тромба; содержание D-димеров, получаемое после добавления тромболитического агента в плазму, представляет собой сумму базовых D-димеров и D-димеров, происходящих от деградации циркулирующего фибрина (или растворимого фибрина).
Из наиболее давних способов количественного определения растворимого фибрина можно назвать тест с этанолом [1, 2, 9] или тест с сульфатом протамина [3, 4, 5, 7]. Однако эти тесты малоспецифичны [9, 10] и малочувствительны [10]. Более того, высокие содержания фибриногена (>5 г/л) искажают результаты, получаемые с помощью тестов с этанолом и сульфатом протамина. Наконец, может быть затруднительной интерпретация результатов тестов с сульфатом протамина [6, 8].
Другой тип детекции растворимого фибрина основан на способе гемагглютинации эритроцитов, сенсибилизированных мономерами фибрина, согласно методу Largo [11, 12]. Этот тип теста, например, выпускается фирмой Diagnostica Stago под названием "FS Test".
Этот способ реализации, хотя и очень легко осуществляемый, однако, иногда может быть недостаточно чувствителен и его можно применять, главным образом, в диагностике диссеминированных внутрисосудистых коагуляций. Однако он не позволяет выявлять более незначительные содержания растворимого фибрина (локализованные тромбозы, исследование эффективности антиокоагулянтной терапии).
В настоящее время другие способы количественного определения растворимого фибрина основаны на использовании моноклональных антител, детектирующих открытые в фибрине и замаскированные в фибриногене эпитопы или продукты распада фибрина или фибриногена [13-14]. Однако прямые количественные определения путем использования моноклональных антител приводят к содержаниям растворимого фибрина, которые разнятся в зависимости от используемого антитела.
Авторы настоящего изобретения предлагают особенно простой и быстрый способ, отличный от рекомендуемых в уровне техники, для оценки коагулолитического баланса пациента. Он обладает более высокой чувствительностью, чем вышеописанный способ гемагглютинации. Он обладает тем преимуществом, по сравнению с тестами, в случае которых используют моноклональные антитела, что позволяет осуществлять детекцию как циркулирующего (растворимого) фибрина, так и фибрина, уже подвергшегося распаду in vivo, что позволяет, таким образом, достигать очень точной оценки коагулолитического баланса.
Согласно способу настоящего изобретения, присутствующий в образце растворимый фибрин определяют по образованию продуктов распада растворимого фибрина во время инкубации образца с активатором плазминогена, обладающим высокой специфичностью к фибрину (PA-Fb sp). Так, разница между содержанием продуктов распада, полученных после распада растворимого фибрина с помощью PA-Fb sp, и содержанием продуктов распада базового фибрина, определенным до введения образца в контакт с PA-Fb sp, позволяет определить в образце плазматическое содержание растворимого фибрина.
Таким образом, объектом изобретения является способ количественного определения растворимого фибрина в биологическом образце, согласно которому вышеуказанный образец вводят в контакт с активатором плазминогена с высоким сродством к фибрину (PA-Fb sp) и определяют содержание в образце растворимого фибрина путем установления разницы между содержанием продуктов распада, получаемым после распада растворимого фибрина с помощью PA-Fb sp, и базовым содержанием продуктов распада фибрина, определяемым до введения образца в контакт с PA-Fb sp.
Способ количественного определения растворимого фибрина согласно изобретению в биологическом образце включает стадии:
- количественного определения продуктов распада фибрина, содержащихся во взятом образце плазмы;
- введения в контакт образца крови с активатором плазминогена, обладающим высокой специфичностью к фибрину (PA-Fb sp), в условиях, позволяющих содержащемуся в образце растворимому фибрину подвергаться распаду с образованием продуктов распада;
- количественного определения продуктов распада фибрина в инкубированном с PA-Fb sp образце;
- определения количества растворимого фибрина, соответствующего разнице между содержанием продуктов распада фибрина, оцененным после инкубации с PA-Fb sp, и содержанием продуктов распада фибрина, оцененным в необработанном образце.
Используемый для количественного определения продуктов распада реагент выбирают для определения заданной группы продуктов распада. Например, используют антитела с определенной специфичностью по отношению к конкретному типу продуктов распада.
Биологический образец представляет собой предпочтительно биологическую жидкость, например, образец крови или плазмы, или пункционную жидкость.
Объектом изобретения является также применение активатора плазминогена с высоким сродством к фибрину (то есть, который активирует плазминоген только в фибрине) в способе количественного определения растворимого фибрина по образованию специфических продуктов распада. Объектом изобретения является также набор для осуществления вышеуказанного способа.
Известны многочисленные соединения - активаторы плазминогена. Однако некоторые вызывают распад как фибриногена, так и фибрина, как, например, стрептокиназа и урокиназа [15]. Эти соединения неприменимы в случае способа согласно изобретению, так как они приводят к распаду фибриногена, в результате которого образуются продукты распада фибриногена, которые можно перепутать с продуктами распада фибрина.
Вторая группа активаторов плазминогена образована соединениями, описанными как обладающие высокой специфичностью к распаду фибрина по сравнению с фибриногеном. Для осуществления способа согласно изобретению используют преимущественно специфичность этой второй группы соединений.
Различные соединения, обладающие такой специфичностью (PA-Fb sp), описаны в литературе. Известны, например:
- тканевый активатор плазминогена (или t-PA) или его производные, как, например, TNK-tPA, который представляет собой мутант t-PA, обладающий очень высокой специфичностью к фибрину [16];
- активатор, происходящий из слюны Desmodus rotundus, (bat-t-PA или VPA=Vampire bar salivary plasminogen activator) или его производные: DSPAs=Desmodus rotundus salivary PAs; FEKP=DSPA-альфа-1 и -альфа-2; ЕКР=DSPA-бета; КР=DSPA-гамма [17];
- стафилокиназа (SAK), полипептид, секретируемый Staphylococcus aureus [18-19], или один из ее мутантов [20].
Способ согласно настоящему изобретению осуществляют предпочтительно при использовании образца плазмы. Содержание растворимого фибрина устанавливают путем определения продуктов распада, образующихся под действием PA Fb sp. В случае надобности можно осуществить поверку способа благодаря использованию положительного контроля, получаемого из нормальной плазмы, обработанной следовыми количествами тромбина, чтобы индуцировать активацию коагуляции, ответственную за образование растворимого фибрина, однако, без формирования сгустка.
Для получения положительной контрольной плазмы плазму сначала инкубируют с тромбином или другим активатором коагуляции в течение определенного времени. Процесс коагуляции, который таким образом был вызван, затем блокируют путем добавления ингибитора используемого активатора, чтобы избежать продолжения протекания реакции. В случае, если этим активатором является тромбин, используют, например, гирудин или гепарин в качестве ингибитора.
Время инкубации плазмы и концентрации активатора коагуляции и ингибитора для блокирования преимущественно определяют таким образом, чтобы осуществлять все стадии активации коагуляции, предшествующие началу формирования сгустка.
Инкубацию в присутствии активатора коагуляции (тромбина) предпочтительно осуществляют в течение времени инкубации, 2 минуты при комнатной температуре. Затем добавляют ингибитор в большом избытке для надежного блокирования коагуляции.
Если в качестве ингибитора используют гирудин, то его преимущественно используют в конечной концентрации 100 мкг/мл для конечной концентрации тромбина 0,18 Ед/мл.
Если в качестве ингибитора используют гепарин, то его используют в конечной концентрации 500 Ед/мл, когда конечная концентрация используемого тромбина составляет 0,18 Ед/мл.
Оценку растворимого фибрина согласно настоящему изобретению осуществляют на первой стадии распада растворимого фибрина с помощью PA-Fb sp с последующим определением специфических продуктов распада, образующихся под действием PA-Fb sp.
Необходимо, чтобы результаты, получаемые по способу согласно изобретению, могли быть достигнуты по возможности наиболее быстро, оставаясь при этом репрезентативными с точки зрения количества присутствующего в образце растворимого фибрина. Для этого условия использования PA-Fb sp должны быть установлены таким образом, чтобы распад растворимого фибрина протекал быстро и чтобы он не сопровождался "загрязняющим" распадом циркулирующего плазматического фибриногена, приводящим к продуктам распада, которые можно перепутать с продуктами распада растворимого фибрина при количественном определении.
Дозы PA-Fb sp, таким образом, выбирают так, чтобы индуцировать в наиболее значительной степени увеличение количества продуктов распада фибрина в положительных контрольных образцах и практически нулевое увеличение в отрицательных контрольных образцах (то есть, не подвергнутых обработке активатором коагуляции)
В рамках настоящего изобретения могут быть использованы различные активаторы фибринолиза, позволяющие осуществлять специфический распад фибрина. PA-Fb sp предпочтительно выбирают из группы, состоящей из вышеуказанных активаторов, а именно: t-PA или его производные, VPA или его производные, стафилокиназа или один из ее мутантов. Предпочтительно используют t-PA или стафилокиназу и более предпочтительно используют t-PA.
В условиях инкубации образцов в течение 15 минут при температуре 37°С конечная концентрация используемой стафилокиназы составляет 1-12 мкг/мл. Удерживаемая конечная концентрация составляет 10 мкг/мл. Время инкубации может быть изменено и его вариация определяется в зависимости от природы и концентрации используемого PA-Fb sp.
t-PA преимущественно используют в гамме конечных концентраций, составляющих 1-2,5 мкг/мл. t-PA предпочтительно используют в количестве 2 мкг/мл.
Существуют различные продукты распада растворимого фибрина, которые могут быть специфически детектированы. Согласно предпочтительному варианту осуществления измеряют содержание D-димеров, образующихся в результате воздействия PA-Fb sp на растворимый фибрин, то есть оценивают концентрацию D-димеров, образующихся в результате воздействия PA-Fb sp на растворимый фибрин (D-димеры после воздействия PA-Fb sp - базовые D-димеры до воздействия PA-Fb sp).
D-Димеры, образующиеся в результате распада растворимого фибрина в присутствии PA-Fb sp, могут быть количественно определены согласно любым обычным методам количественного определения аналитов, таким как, например, методы типа твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), чувствительные методы по агглютинации латексных шариков, методы иммунохроматографии и т.д. Из различных тестов для количественного определения D-димера, имеющихся в продаже, можно назвать, например, ASSERACHROM D-Di или STA LIAATEST D-Di, причем оба выпускаются фирмой Diagnostica Stago. Однако, в рамках настоящего изобретения условия использования теста ELISA ASSERACHROM D-Di преимущественно модифицированы для сокращения времени на тест (15 минут инкубации с иммобилизованным антителом и 15 минут с антителом, маркированным пероксидазой).
Кроме фрагмента DD/Е, существуют другие продукты распада фибрина, такие как комплексы YD/DY, YD/DXD, которые могут быть определены.
Как это пояснено в нижеприводимых примерах (см. пример 3), способ согласно изобретению может быть осуществлен в случае больных с активацией коагуляции либо до начала терапии, либо в течение антикоагулянтной терапии, либо после прекращения антикоагулянтной терапии. Он позволяет также оценивать не только развитие процесса активации коагуляции, в особенности в рамках диагностики активации коагуляции, но также и эффективность антикоагулянтной терапии.
Согласно другому аспекту объектом настоящего изобретения является набор (совокупность) для количественного определения растворимого фибрина в образце, отличающийся тем, что он включает:
- положительный контроль на наличие растворимого фибрина, получаемый согласно вышеописанному протоколу;
- отрицательный контроль, представляющий собой контрольную плазму;
- PA-Fb sp в индивидуальном количестве для одного образца или в достаточном количестве для множественных образцов;
- реагент для количественного определения D-димеров; и
- в случае необходимости, буфер для разведения образцов, такой как фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 0,05% твина-20.
Положительные и отрицательные контрольные плазмы находятся преимущественно в лиофилизированной форме.
Предпочтительно используемым PA-Fb sp является t-PA.
D-димеры количественно определяют, например, с помощью реагента для метода типа ELISA, такого как ASSERACHROM D-Di, или реагента для чувствительного теста агглютинации латексных частиц, такого как STA LIATEST D-Di, причем оба выпускаются фирмой Diagnostica Stago.
Нижеприводимые примеры поясняют настоящее изобретение.
Пример 1
Выбор концентрации тромбина, используемой для получения положительной контрольной плазмы, включающей растворимый фибрин
Положительную контрольную плазму приготовляют согласно следующему протоколу:
нормальная плазма - 300 мкл;
человеческий тромбин (Stago; номер по каталогу 00896) с 2 Ед/мл - 30 мкл;
инкубация в течение 2 минут при комнатной температуре;
гирудин (Knoll) - 100 мкг/мл; (конечная концентрация);
или гепарин (Choay) - 500 Ед/мл конечная концентрация).
Контролировать:
- чтобы не происходило формирования сгустка в пробирке;
- чтобы тест на детекцию растворимого фибрина, имеющийся в продаже, был положительным (например, FS- тест лаборатории Stago).
Могут быть приняты во внимание две возможности, представленные в таблице I:
| Таблица I | ||||
| I-A: пробирка 2 | ||||
| Номера пробирок | 1 | 2 | 3 | 4 |
| нормальная цитратная плазма | 300 мкл | 300 мкл | 300 мкл | 300 мкл |
| тромбин | 30 мкл·с | 30 мкл·с | 30 мкл·с | 30 мкл·с |
| 4 Ед/мл | 2 Ед/мл | 1 Ед/мл | 0,5 Ед/мл | |
| Инкубация 2 минуты при комнатной температуре | ||||
| наличие сгустка | + | - | - | - |
| гепарин или гирудин | 500 единиц 100 мкг | 500 единиц 100 мкг | 500 единиц 100 мкг | 500 единиц 100 мкг |
I-B: пробирка 3
| Номера пробирок | 1 | 2 | 3 | 4 |
| нормальная цитратная плазма | 300 мкл | 300 мкл | 300 мкл | 300 мкл |
| тромбин | 30 мкл·с | 30 мкл·с | 30 мкл·с | 30 мкл·с |
| 4 Ед/мл | 2 Ед/мл | 1 Ед/мл | 0,5 Ед/мл | |
| Инкубация 10-15 минут при комнатной температуре | ||||
| наличие сгустка | + | + | - | - |
| гепарин или гирудин | 500 единиц 100 мкг | 500 единиц 100 мкг | 500 единиц 100 мкг | 500 единиц 100 мкг |
Пример 2
Определение количества PA-Fb sp, используемого в определенных условиях инкубации
Для осуществления способа согласно изобретению количество добавляемого к образцу активатора должно быть таким, чтобы оно индуцировало значительное образование D-димеров в положительной контрольной плазме, такой, как полученная согласно примеру 1, и незначительное образование D-димеров в отрицательной контрольной плазме (необработанный тромбином контроль).
Инкубация контрольных плазм и положительных контрольных плазм (n=21), следовательно, была реализована с различными дозами PA-Fb sp в течение 15 минут при температуре 37°С. По окончании времени инкубации D-димеры определяли с помощью теста Lia или быстрого теста ELISA (D-Di Stago) (инкубация в течение 15 минут при температуре 37°С с иммобилизованным антителом и в течение 15 минут при температуре 37·С с индикаторным антителом).
Представленные в таблице II результаты получены с помощью теста ELISA.
Почти аналогичные результаты были получены с помощью теста Lia (n=5).
| Таблица II | ||||
| Распад растворимого фибрина с помощью возрастающих количеств t-PA и SAK | ||||
| D-димеры (нг/мл) | Растворимый фибрин (нг/мл) | |||
| отрицательный контроль | положительный контроль | Отрицательный контроль | положительный контроль (обработанный тромбином) | |
| без добавкиРА-Fb sp | 375 | 375 | ||
| стафилокиназа | ||||
| 10 мкг/мл | 400 | 1750 | <50 | 1375 |
| 2 мкг/мл | 390 | 1615 | <50 | 1225 |
| 1,5 мкг/мл | 375 | 1700 | <50 | 1325 |
| 1 мкг/мл | 350 | 1657 | <50 | 1305 |
| 0,5 мкг/мл | 410 | 1125 | <50 | 715 |
| t-PA | ||||
| 2 мкг/мл | 350 | 1790 | <50 | 1415 |
| 1 мкг/мл | 360 | 1420 | <50 | 1045 |
| 0,5 мкг/мл | 360 | 1210 | <50 | 835 |
Выбранная доза PA-Fb sp является такой, которая индуцирует:
- увеличение < 300 нг/мл в контрольных необработанных плазмах (отрицательные контрольные образцы);
- наиболее значительное увеличение в положительных контрольных плазмах.
Из этих результатов следует, что используемыми предпочтительными конечными концентрациями PA-Fb sp являются:
- 2 мкг/мл для t-PA: в этих условиях количество t-PA, которое может быть нейтрализовано с помощью PAI, является ничтожным;
- 10 мкг/мл для SAK (низкие дозы SAK индуцируют низкую способность к распаду растворимого фибрина у некоторых больных или в случае некоторых положительных контрольных образцов, очевидно, вследствие наличия антистафилокиназы в образце, которая может появляться вследствие инфекции стафилококками).
Пример 3
Результаты, полученные в случае здоровых субъектов и в случае больных с подозрением на активацию коагуляции (вследствие увеличения количества D-димеров)
Способ осуществляют при использовании образцов плазмы согласно вышеуказанному протоколу: инкубация образцов плазмы в течение 15 минут при температуре 37°С в присутствии t-PA (2 мкг/мл) или SAK (10 мкг/мл).
Образовавшиеся D-димеры количественно определяют с помощью теста ELISA, такого как описанный выше.
А. Результаты, полученные в случае здорового субъекта
| Таблица III | |
| F.S. (нг/мл) | |
| контрольные плазмы + t-PA (n=21) | 147±(100 нг/мл |
| контрольные плазмы + IIa + t-PA (n=21) | 2128±1219 нг/мл (предельные значения: 742-3660) |
| контрольные плазмы + SAK (n=11) | 64±82 нг/мл (предельные значения: 0-215) |
| контрольные плазмы + IIa + SAK (n=11) | 1700±1880 нг/мл (предельные значения: 250-5000) |
В. Результаты, полученные в случае больных с высоким содержанием D-димеров
(эксперимент, осуществленный с помощью быстрого теста ELISA)
| Таблица IV | |||
| Примеры согласно исследованию заявителей | |||
| Содержание D-димеров после добавления t-PA (нг/мл) | Содержание D-димеров до добавления t-PA (нг/мл) | Содержание растворимого фибрина (нг/мл) | |
| больной из группы 1 | 5420 | 510 | 4910 |
| больной из группы 2 | 1316 | 1234 | 82 |
| больной из группы 3 | 30162 | 20699 | 9463 |
Выводы
Способ согласно изобретению позволяет разделить больных на три группы в зависимости от их плазматических содержаний растворимого фибрина и D-димеров. Характеристики каждой из этих трех групп вкратце представлены в нижеприводимой таблице V:
| Таблица V | |||
| Растворимый фибрин (нг/мл) | D-димеры (нг/мл) | Вывод | |
| группа 1 | >500 | +/- | Образование не распавшегося сгустка |
| группа 2 | <300 | +/+++ | Наличие тромба, но коагуляция остановлена |
| группа 3 | >500 | +++ | Продолжается коагуляция, ассоциированная с распадом сгустка |
Как это было указано выше, способ согласно изобретению позволяет, таким образом, не только следить за развитием процесса активации коагуляции, но также и оценивать эффективность антикоагулянтной терапии и определять, происходит ли снова активация коагуляции при прекращении терапии.
Группа 1: ранняя активация коагуляции с повышением растворимого фибрина, без повышения D-димеров.
Группа 2: больные, у которых активация коагуляции остановлена (эффективная терапия), но уже сформировавшийся тромб продолжает распадаться (нормальное содержание растворимого фибрина, повышенное содержание D-димеров).
Группа 3: больные, у которых наблюдается активация коагуляции с распадом сгустка in vivo (одновременное повышение растворимого фибрина и D-димеров): недостаточно эффективная терапия.
Пример 4
Сводная таблица в отношении используемого способа:
Реагенты:
Буфер, рН 7,4
Очищенный человеческий тромбин (Stago, номер по каталогу 00896)
t-PA (Boeringer)
Апротинин; хранить раствор при температуре 4°С.
Набор D-димеров.
Используемый способ вкратце представлен в таблице VI.
Источники информации
1. GODAL H.C., ABILDGAARD U.: "Gelation of soluble fibrin in plasma by ethanol". Scand. J.Haematol.,3,342-350,1966.
2. BREEN F.A., TULLIS J.L.: "Ethanol gelation: a rapid screening test for intravascular coagulation". Ann. Intern. Med., 69, 1197-1206, 1968.
3. LIPINSKI B., WOROWSKI K.: "Detection of soluble fibrin monomer complexes in blood by means of protamine sulphate test". Thromb. Diath. Haemorrh., 20, 44-49, 1968.
4. SEAMAN A.J.: "The recognition of intravascular clotting. The plasma protamine paracoagulation test". Arch. Intern. Med., 125, 1016-1021, 1970.
5. LATALLO Z.S., WEGRZYNOWICZ S., BUDZUNKI A.Z.: "Effect of protamine sulphate on the solubility of fibrinogen, its derivatives and other plasma proteins". Scand.J.Haematol., suppl., 13, 151-162, 1971.
6. MESUMECI V.: "Ethanol gelation test and protamine sulphate test in diagnosis of intravascular coagulation". Scand. J.Haematol., suppl., 13, 197-202, 1971.
7. NIEWIAROWSKI S., GUREWICH V.: "Laboratory identification of coagulation. The serial dilution protamine sulfate test for the detection of fibrin monomer and fibrin degradation products". J. Lab. Clin. Med., 77, 665-676, 1971.
8. KIDDER W.R., LOGAN L.J., RAPAPORT S.I., PATCH M.J.: "The plasma protamine paracoagulation test - Clinical and laboratory evaluation". A.J.C.P., 58, 675-686, 1972.
9. GUREWICH V., LIPINSKI B., LIPINSKA I.:"A comparative study of precipitation and paracoagulation by protamine sulphate and ethanol gelation tests". Thromb. Res., 2, 539-556, 1973.
10. GERRITS W.B.J., PRAKKE E.M., VAN DER MEER J., VREEKEN J.: "Causes of a negative ethanol gelation test in diffuse intravascular coagulation". Thromb. Diath. Haemorrh., 31, 299-308, 1974.
11. LARGO R., HELLER V., STRAUB P.W.: "Detection of soluble intermediates of the fibrinogen-fibrin conversion using erythrocytes coated with fibrin monomers". Blood, 47, 991-1002, 1976.
12. SORIA J., SORIA C., DE RODRIGUEZ S., HORELLOU M.H., SAMAMA M., BILSKI-PASQUIER G.: "Recherche des complexes solubles de fibrine par un test d'hémagglutination - Applications cliniques". Presse Méd., 6, 43, 4045-4048, 1977.
13. DEMPFLE CE., DOLLMAN M., LILL H., PUZZOVIO D., DESSAUER A., HEENE D.L.: "Binding of a new monoclonal antibody against N-terminal heptapeptide of fibrin alpha-chain to fibrin polymerization site "A": effects of fibrinogen and fibrinogen derivatives, and pretreatment of samples with NaSCN. Blood Coagul. Fibrinolysis, 4, 79-86, 1993.
14. SOE G., KOHNO I., INUZUKA K., ITON Y., MATSUDA M.: "A monoclonal antibody that recognizes a neo-antigen exposed in the E domain of fibrin monomer complexed with fibrinogen or its derivatives: its application to the measurement of soluble fibrin in plasma. Blood, 88, 2109-2117, 1996.
15. GUREWICH V., HYDE E., LIPINSKI B.: "The resistance of fibrinogen and soluble fibrin monomer in blood to degradation by a potent plasminogen activator derived from cadaver limbs. Blood, 46, 555-565, 1975.
16. CANNON CP., GIBSON CM., MCCABE CH., ADGEY AA., SCHWEIGER MJ., SEQUEIRA RF., GROLLIER G., GIUGLIANO RP., FREY M., MUELLER HS., STEINGART RM., WEAVER WD., VAN DE WERF F., BRAUNWALD E.: "TNK-tissue plasminogen activator compared with frontloaded altephase in acute myocardial infarction results of the TIMI 10B trial." Thrombolysis in Myocardial Infarction (TIMI) 10B Investigators, Circulation 98(25), 2805-14, 1998.
17. BRINGMANN P., GRUBER D., LIESE A., TOSCHI, L., KRATZCHMAR J., SCHLEUNING WD., DONNER P.: "Structural features mediating fibrin selectivity of vampirebat plasminogen activators". J Biol Chem, 270, 25596-603, 1995.
18. COLLEN D.: "Staphylokinase: a potent, uniquely fibrin-selective thrombolytic agent". Nat Med, 4-279-84, 1998.
19. SAKHAROV D.V., BARRERTT-BERGSHOEFF M., HEKKENBERG R.T., RIJKEN D.C.: "Fibrin-specificity of a plasminogen activator affects the efficiency of fibrinolysis and responsiveness to ultrasound: comparison of nine plasminogen activators in vitro". Thromb Haemos, 81, 605-12, 1999.
20. COLLEN D., BERNAERTS R., DECLERCK P., DE COCK F., DEMARSIN E., JENNE S.. LAROCHE Y., LIJNEN HR., SILENCE K., VERSTREKEN M.: "Recombinant staphylokinase variants with altered immunoreactivity. I: Construction and characterization" Circulation, 94, 197-206, 1996.
1. Способ количественного определения растворимого фибрина в образце плазмы крови, согласно которому вышеуказанный образец вводят в контакт с активатором плазминогена с высокой специфичностью к растворимому фибрину (PA-Fb sp) и определяют содержание в образце растворимого фибрина путем установления разницы между содержанием продуктов распада фибрина, получаемых после распада растворимого фибрина с помощью PA-Fb sp и представлящих собой D-димеры, и базовым содержанием продуктов распада фибрина, определяемым в вышеуказанном образце до введения его в контакт с PA-Fb sp.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что активатор плазминогена с высоким сродством к растворимому фибрину (PA-Fb sp) является специфичным к фибрину.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что PA-Fb sp выбирают из группы, состоящей из tPA или его производных, VPA или его производных, стафилокиназы или одного из ее мутантов.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что PA-Fb sp представляет собой tPA или стафилокиназу.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что продукты распада фибрина определяют количественно по методу типа ELISA или LIATEST.
6. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что тестируемый образец инкубируют в течение 15 мин при температуре 37°С в присутствии РА-Fb sp.
7. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что PA-Fb sp представляет собой tPA в конечной концентрации 2 мкг/мл образца.
8. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что PA-Fb sp выбирают среди стафилокиназы, bat-tPA, VPA, DSPAs, FEKP, ЕКР и КР.
9. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что PA-Fb sp представляет собой стафилокиназу в конечной концентрации 10 мкг/мл образца.
10. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что содержания продуктов распада растворимого фибрина, образующихся за счет активациии PA-Fb sp, оценивают по отношению к положительному контролю.
11. Способ по п.9, отличающийся тем, что положительный контроль приготовляют из нормальной плазмы, обработанной таким образом, чтобы индуцировать активацию коагуляции in vitro, без образования сгустка.
12. Реагент для количественного определения фибрина, используемый в способе по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что он образован нормальной плазмой, обработанной таким образом, чтобы индуцировать активацию коагуляции in vitro, без образования сгустка, причем вышеуказанную плазму вводят в контакт с активатором плазминогена с высоким сродством и/или специфичностью к растворимому фибрину, в условиях, аналогичных таковым, которые могут быть применены к тестируемому образцу.
13. Применение активатора плазминогена с высоким сродством к фибрину (PA-Fb sp) в способе количественного определения растворимого фибрина по образованию специфических продуктов распада, представляющих собой D-димеры.
14. Применение по п.13, отличающееся тем, что PA-Fb sp выбирают из группы, состоящей из tPA или его производных, VPA или его производных, стафилокиназы или одного из ее мутантов.
15. Применение по п.13, отличающееся тем, что PA-Fb sp представляет собой tPA или стафилокиназу.
16. Набор для количественного определения растворимого фибрина, присутствующего в образце, отличающийся тем, что он включает
положительный контроль на наличие растворимого фибрина, представляющий собой реагент по п.12;
необработанный отрицательный контроль, представляющий собой контрольную плазму;
PA-Fb sp в индивидуальном количестве для одного образца или в достаточном количестве для множественных образцов;
реагент для количественного определения D-димеров; и
в случае необходимости, среду для разведения проб.
17. Набор по п.16, отличающийся тем, что положительные и отрицательные контрольные плазмы находятся в лиофилизированной форме.
18. Набор по п.16, отличающийся тем, что PA-Fb sp представляет собой tPA.
19. Набор по п.16, отличающийся тем, что реагентом для количественного определения D-димеров является реагент для ELISA или для теста на агглютинацию с сенсибилизацией частицами латекса типа LIATEST.
20. Применение способа по любому из пп.1-10, для наблюдения за развитием процесса активации коагуляции и оценки эффективности антикоагулянтной терапии.
21. Применение набора по любому из пп.16-19, для наблюдения за развитием процесса активации коагуляции и оценки эффективности антикоагулянтной терапии.
