Способ очистки липопептида (варианты), антибиотическая композиция на основе очищенного липопептида (варианты)

Изобретение касается высокоочищенного липопептидного антибиотика даптомицина и фармацевтических композиций, включающих данное соединение. Изобретение также раскрывает способ очистки даптомицина, включающий ряд последовательных стадий анионообменной хроматографии, гидрофобной хроматографии и анионообменной хроматографии и способ очистки даптомицина с помощью анионообменной хроматографии, усиленной модифицированным буфером. В настоящем изобретении раскрыт усовершенствованный способ продуцирования даптомицина в результате ферментации Streptomyces roseosporus и его очистки. Также раскрываются методы высокоэффективной жидкостной хроматографии для анализа чистоты даптомицина. В настоящем изобретении раскрываются также липопептидные мицеллы и способы создания этих мицелл, а также использование липопептидных мицелл при очистке липопептидных антибиотиков, таких как даптомицин, и их терапевтическое применение. Использование изобретения позволит получать липопептидные антибиотики со степенью чистоты от 95 до 98%, что в свою очередь повысит их антибактериальную активность в отношении грамположительной микрофлоры. 7 н. и 61 з.п. ф-лы, 19 ил., 3 табл.

 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

1. Способ очистки даптомицина, включающий стадии

a) связывания исходного препарата даптомицина, содержащего, по меньшей мере, 2,5% объединенного количества ангидро-даптомицина и β-изомера даптомицина, с анионообменной смолой в присутствии модифицированного буфера с низкой ионной силой, содержащего по меньшей мере один хаотропный агент, при этом даптомицин связывается с анионообменной смолой в мономерном и немицеллярном состоянии;

b) промывку анионообменной смолы модифицированным буфером со средней ионной силой, содержащим по меньшей мере один хаотропный агент, для вытеснения ангидро-даптомицина с удерживанием даптомицина;

c) элюирование даптомицина с анионообменной смолы модифицированным буфером с высокой ионной силой, содержащим по меньшей мере один хаотропный агент, для отделения даптомицина от β-изомера;

d) получение очищенного даптомицина или даптомицина, который в значительной степени свободен от ангидро-даптомицина, β-изомера даптомицина и/или от примесей 1-14, определенных в таблице 3.

2. Способ по п.1, в котором анионообменная смола содержит поли(стирол-дивинилбензол).

3. Способ по п.1 или 2, в котором хаотропный агент модифицированного буфера выбран из группы, состоящей из гуанидина, аммония, мочевины, сильного восстановителя, бензоата, аскорбата или их смесей.

4. Способ по п.1 или 2, в котором хаотропный агент модифицированного буфера представляет собой мочевину в молярной концентрации от 2 до 6 М, и буфер имеет рН 6,0-7,0.

5. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию фильтрации и концентрирования элюируемого даптомицина.

6. Способ по п.1, в котором стадии промывки и элюирования включают использование непрерывного градиента концентрации соли или ступенчатого градиента концентрации соли.

7. Способ очистки даптомицина, включающий следующие стадии:

a) ферментацию Streptomyces roseosporus с подпиткой н-декановой кислотой для получения даптомицина в культуральной среде;

b) осветление культуральной среды с получением осветленного раствора;

c) обработку осветленного раствора при помощи анионообменной хроматографии с получением обогащенного препарата даптомицина;

d) обработку обогащенного препарата даптомицина при помощи хроматографии гидрофобного взаимодействия с получением полуочищенного препарата даптомицина; и

e) обработку полуочищенного препарата даптомицина при помощи анионообменной хроматографии в присутствии модифицированного буфера, который содержит по меньшей мере один хаотропный агент, с получением очищенного даптомицина или даптомицина, который в значительной степени свободен от ангидро-даптомицина, β-изомера даптомицина и/или от примесей 1-14, определенных в таблице 3.

8. Способ по п.7, в котором анионообменную хроматографию на стадии с) осуществляют на смоле FP-DA 13.

9. Способ по п.7, в котором указанное осветление на стадии b) включает экстрагирование культуральной среды буфером, содержащим бутанол.

10. Способ по п.7, в котором анионообменную хроматографию на стадии с) осуществляют с использованием анионообменной смолы, содержащей сополимер 2-метакриловой кислоты и диметакрилата этиленгликоля (EGDM).

11. Способ по п.7, в котором хроматографию гидрофобного взаимодействия на стадии d) осуществляют с использованием смолы, содержащей перекрестно-сшитый сополимер дивинилбензола и стирола.

12. Способ по п.11, в котором хроматографию гидрофобного взаимодействия осуществляют при нейтральном рН, а концентрация растворителя, которая понижается, сопоставима с концентрацией растворителя, используемой при осуществлении хроматографии гидрофобного взаимодействия при рН 4,0-5,0.

13. Способ по п.12, в котором смолу используют повторно в результате изменения рН смолы без стадии удаления растворителя.

14. Способ по п.7, в котором анионообменную хроматографию с модифицированным буфером на стадии е) осуществляют с использованием смолы, содержащей поли(стирол-дивинилбензол).

15. Способ по п.14, в котором анионообменная хроматография с модифицированным буфером на стадии е) включает следующие стадии:

i) подачу полуочищенного препарата даптомицина со стадии d) в модифицированный буфер для анионообменной хроматографии;

ii) связывание полученного препарата даптомицина с анионообменной смолой в присутствии модифицированного буфера, при этом даптомицин связывается с анионообменной смолой в мономерном и немицеллярном состоянии;

iii) промывку анионообменной смолы модифицированным буфером для вытеснения ангидро-даптомицина с удерживанием даптомицина; и

iv) элюирование даптомицина с анионообменной смолы модифицированным буфером с отделением даптомицина от β-изомера.

16. Способ по п.15, в котором стадии промывки и элюирования включают использование непрерывного градиента концентрации соли или ступенчатого градиента концентрации соли.

17. Способ по п.15, в котором анионообменную хроматографию с использованием модифицированного буфера осуществляют как радиальную проточную хроматографию.

18. Способ по п.7, в котором одну или более из стадий с), d) и е) осуществляют путем непрерывной проточной хроматографии или радиальной проточной хроматографии.

19. Способ по п.7, дополнительно включающий стадию анионобменной хроматографии перед стадией е).

20. Способ по п.7, дополнительно включающий стадию фильтрации или концентрирования даптомицина.

21. Способ по п.7, дополнительно включающий стадии фильтрации и концентрирования даптомицина.

22. Способ по п.7, дополнительно включающий стадию депирогенирования даптомицина.

23. Способ по п.7, дополнительно включающий стадию лиофилизации даптомицина.

24. Способ очистки даптомицина, включающий стадии:

a) ферментацию Streptomyces roseosporus с подпиткой н-декановой кислотой для получения даптомицина в культуральной среде;

b) осветление культуральной среды с получением осветленного раствора;

c) обработку осветленного раствора при помощи анионообменной хроматографии с получением обогащенного препарата даптомицина;

d) обработку обогащенного препарата даптомицина при помощи хроматографии гидрофобного взаимодействия с получением полуочищенного препарата даптомицина; и

e) обработку полуочищенного препарата даптомицина при помощи анионообменной хроматографии с получением очищенного даптомицина.

25. Способ по п.24, в котором подпитку н-декановой кислотой во время ферментации на стадии а) регулируют достижением остаточной концентрации н-декановой кислоты не более чем 50 млн^-1.

26. Способ по п.24, в котором указанное осветление на стадии b) включает фильтрацию или центрифугирование и объемную фильтрацию.

27. Способ по п.24, в котором анионообменную хроматографию на стадии с) осуществляют с использованием анионообменной смолы, содержащей сополимер 2-метакриловой кислоты и диметакрилата этиленгликоля (EGDM).

28. Способ по п.24, в котором хроматографию гидрофобного взаимодействия на стадии d) осуществляют с использованием смолы, содержащей перекрестно-сшитый сополимер дивинилбензола и стирола.

29. Способ по п.28, в котором хроматографию гидрофобного взаимодействия осуществляют при нейтральном рН, а концентрация растворителя, которая понижается, сопоставима с концентрацией растворителя, используемой при осуществлении хроматографии гидрофобного взаимодействия при кислом рН.

30. Способ по п.29, в котором смола используется повторно путем загрузки колонки при кислом рН и элюирования с колонки при нейтральном рН.

31. Способ по п.24, в котором анионообменную хроматографию на стадии е) осуществляют использованием анионообменной смолы, содержащей сополимер 2-метакриловой кислоты и диметакрилата этиленгликоля (EGDM).

32. Способ по п.24, в котором анионообменную хроматографию на стадии е) осуществляют для снижения содержания растворителя со стадии b).

33. Способ по п.24, в котором анионообменная хроматография на стадии е) включает следующие стадии:

i) подачу полуочищенного препарата даптомицина со стадии d) в модифицированный буфер для ионообменной хроматографии, где модифицированный буфер содержит по меньшей мере один хаотропный агент;

ii) связывание полученного препарата даптомицина с анионообменной смолой в присутствии модифицированного буфера, при этом даптомицин связывается с анионообменной смолой в мономерном и немицеллярном состоянии;

iii) промывку анионообменной смолы модифицированным буфером для вытеснения ангидро-даптомицина с удерживанием даптомицина; и

iv) элюирование даптомицина с анионообменной смолы модифицированным буфером с отделением даптомицина от β-изомера.

34. Способ по п.33, в котором стадии промывки и элюирования включают использование непрерывного градиента концентрации соли.

35. Способ по п.33, в котором стадии промывки и элюирования включают использование ступенчатого градиента концентрации соли.

36. Способ по п.24, дополнительно включающий стадию отделения обогащенного даптомицина, полученного на стадии с), от низкомолекулярного материала с использованием ультрафильтрации.

37. Способ по п.36, дополнительно включающий стадию депирогенирования даптомицина.

38. Способ по п.24, где данный способ осуществляют путем непрерывной проточной хроматографии.

39. Способ по п.24, дополнительно включающий стадию фильтрации или концентрирования даптомицина.

40. Способ по п.24, дополнительно включающий стадии фильтрации и концентрирования даптомицина.

41. Способ по п.24, дополнительно включающий стадию депирогенирования даптомицина с использованием ультрафильтрации.

42. Способ по п.41, в котором указанное депирогенирование включает стадии:

i) получение раствора даптомицина в условиях, при которых даптомицин находится в мономерном и в немицеллярном состоянии;

ii) фильтрацию раствора даптомицина в условиях, при которых даптомицин проходит через фильтр, а пирогены не проходят через фильтр;

iii) создание условий для образования агрегатов даптомицина;

iv) фильтрацию агрегатов даптомицина в условиях, при которых агрегаты даптомицина удерживаются на фильтре; и

v) сбор агрегатов даптомицина.

43. Способ по п.41, дополнительно включающий стадию лиофилизации даптомицина.

44. Способ очистки липопептида, родственного даптомицину, включающий стадии

a) образования мицелл препарата липопептида, родственного даптомицину, из препарата в мономерном и немицеллярном состоянии, где препарат получен анионообменной хроматографией или хроматографией гидрофобного взаимодействия;

b) отделение мицелл липопептида, родственного даптомицину, от низкомолекулярного материала; и

c) сбор мицелл липопептида, родственного даптомицину.

45. Способ по п.44, в котором липопептид, родственный даптомицину, представляет собой даптомицин.

46. Способ по п.44, в котором мицеллы липопептида, родственного даптомицину, отделяют от низкомолекулярного материала посредством ультрафильтрации.

47. Способ по п.46, в котором ультрафильтрация осуществляется с использованием мембраны для номинальной молекулярной массы (NMW) 10000 или 30000.

48. Способ по п.44, в котором условия формирования мицелл включают изменение рН от нейтрального или щелочного до рН приблизительно 2,5-4,7.

49. Способ по п.44, в котором условия формирования мицелл включают изменение температуры от, по меньшей мере, 15 до 2-10°С.

50. Способ по п.44, дополнительно включающий стадии:

d) обработку мицелл липопептида, родственного даптомицину, со стадии с) в условиях для диссоциации в мономеры;

e) отделение мономеров липопептида, родственного даптомицину, от высокомолекулярного материала; и

f) сбор мономеров липопептида, родственного даптомицину.

51. Способ по п.44, в котором повторную хроматографию гидрофобного взаимодействия используют для получения препарата липопептида, родственного даптомицину, в мономерном и немицеллярном состоянии на стадии а).

52. Способ по п.44, в котором липопептид, родственный даптомицину, представляет собой А54145 или антибиотик А-21978, в котором боковая цепь н-декановой жирной кислоты даптомицина замещена н-октаноиловой, н-нонаноиловой, н-ундеканоиловой, н-додеканоиловой, н-тридеканоиловой или н-тетрадеканоиловой жирнокислотной боковой цепью.

53. Способ очистки даптомицина, включающий стадии:

a) ферментацию Streptomyces roseosporus с подпиткой н-декановой кислотой для получения даптомицина в культуральной среде;

b) осветление культуральной среды с получением осветленного раствора;

c) обработку осветленного раствора ступенчатой или колоночной хроматографией с получением обогащенного препарата даптомицина;

d) образования мицелл обогащенного препарата даптомицина;

e) отделение мицелл даптомицина от низкомолекулярного материала; и

f) сбор мицелл даптомицина.

54. Способ по п.53, дополнительно включающий следующие стадии:

g) воздействие на даптомицин, собранный на стадии f), для диссоциации мицелл даптомицина на мономеры даптомицина;

h) отделение мономеров даптомицина от высокомолекулярного материала; и i) сбор мономеров даптомицина.

55. Способ по п.53, в котором указанная ступенчатая или колоночная хроматография представляет собой анионообменную хроматографию или повторную хроматографию гидрофобного взаимодействия.

56. Способ по п.54, в котором указанную анионообменную хроматографию осуществляют с использованием смолы, содержащей сополимер 2-метакриловой кислоты и диметакрилата этиленгликоля (EGDM), и указанную хроматографию гидрофобного взаимодействия осуществляют с использованием смолы, которая представляет собой перекрестно-сшитый сополимер дивинилбензола и стирола.

57. Способ по пп.7, 24 или 53, в котором указанное осветление на стадии b) включает микрофильтрацию или центрифугирование.

58. Антибиотическая композиция, содержащая (а), в сущности, чистый даптомицин, (b) даптомицин, который в значительной степени свободен от ангидро-даптомицина и в значительной степени свободен от β-изомера даптомицина, (с) даптомицин, который, в сущности, свободен от ангидро-даптомицина и в значительной степени свободен от β-изомера даптомицина, (d) даптомицин, который лишен ангидро-даптомицина и в значительной степени свободен от β-изомера даптомицина, (е) даптомицин, который в значительной степени свободен от примесей 1-14, или (f) даптомицин, который, по существу, свободен от примесей 1-14, определенных в таблице 3.

59. Композиция по п.58, содержащая в сущности чистый даптомицин.

60. Композиция по п.58, содержащая даптомицин, который в значительной степени свободен от ангидро-даптомицина и в значительной степени свободен от β-изомера даптомицина.

61. Композиция по п.60, которая, в сущности, свободна от ангидро-даптомицина.

62. Композиция по п.60, в которой отсутствует ангидро-даптомицин.

63. Композиция по п.58, которая в значительной степени свободна от каждой из примесей 1-14, определенных в таблице 3.

64. Композиция по п.58, которая, в сущности, свободна от каждой из примесей 1-14, определенных в таблице 3.

65. Композиция по п.58, в которой чистота даптомицина определена при помощи ВЭЖХ.

66. Композиция по п.58, в которой даптомицин очищен способом по любому из пп.7-23.

67. Антибиотическая фармацевтическая композиция, обладающая антибактериальной активностью против грамположительных микроорганизмов, содержащая композицию по п.58.

68. Фармацевтическая композиция по п.67, дополнительно содержащая один или более антибиотиков, одно или более противогрибковых средств, или антибиотик и противогрибковое средство совместно.