Способ определения неоптерина в крови

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии, и касается оптимизации ВЭЖХ-определения неоптерина в крови человека. Экстракцию сыворотки проводят смесью хлороформа и метанола в соотношении 1:1, после центрифугирования отбирают верхний водно-метанольный слой, упаривают, сухой остаток растворяют в 0,02 М глициновом буфере с рН 8,4, ВЭЖХ-анализ проводят на обращенно-фазовой колонке 100×4 мм с сорбентом Диасфер C₁₈ размером частиц 5 мкм со скоростью 500 мкл в мин в изократическом режиме длиной волны возбуждения 350 нм, эмиссии 430 нм. В качестве мобильной фазы используют смесь ацетонитрила, изопропанола, 0,01-0,05 М цитратного буфера (1:1:98) с рН 3,5-4,5, который обеспечивает максимум флюоресценции неоптерина. Способ характеризуется относительной простотой и эффективностью экстракции (98%), отличается относительной быстротой определения аналита и высокой воспроизводимостью. 2 табл., 1 ил.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии.

Неоптерин относится к птеридинам, которые представляют собой гетерогенную группу веществ, производных гуанозинтрифосфата. По химической структуре неоптерин - D-эритро-1`,2`,3`-тригидроксипропилптеридин - промежуточный продукт биохимической трансформации гуанозинтрифосфата в тетрагидробиоптерин. Известно, что последний является естественным кофактором для моноаминоксидаз ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана) и NO-синтазы, а также участвует в синтезе таких нейромедиаторрв, как серотонин и дофамин [1]. Нарушение биосинтеза тетрагидробиоптерина вызывает серьезное неврологическое заболевание (атипичная фенилкетонурия). Биологическая функция самого неоптерина до конца не выяснена, хотя установлено, что метаболиты неоптерина являются антиоксидантами. Однако исследования in vitro показали, что совместное действие фактора некроза опухолей альфа (ФНО-α) и 7,8-дигидронеоптерина усиливает апоптоз клеток за счет действия активного кислорода. Кроме того, неоптерин играет определенную роль в механизме цитотоксического действия активированных макрофагов. Повышенная экскреция неоптерина с мочой была обнаружена при заболеваниях, связанных с гиперактивацией клеточного иммунного ответа: инфекциях, вызванных вирусами и внутриклеточными паразитами, реакции отторжения трансплантата, при некоторых неопластических процессах [2]. Гиперпродукция неоптерина характерна для большинства больных аутоиммунными ревматическими заболеваниями. Уровень неоптерина как в сыворотке крови, так и в моче часто коррелирует с тяжестью и активностью болезни и может использоваться для оценки эффективности терапии. С клинической точки зрения важное значение имеет тот факт, что уровень неоптерина нередко сильнее коррелирует с клинико-лабораторными проявлениями активности и тяжести болезни, чем уровни других маркеров активации клеточного иммунитета - растворимых рецепторов цитокинов: ФНО (рФНО-55Р) и интерлейкина-2 (рИЛ-2Р) [3].

В клинической практике используют измерение уровня неоптерина в различных биологических жидкостях: чаще исследуются сыворотка крови и моча, реже концентрацию неоптерина определяют в синовиальной, спинно-мозговой и амниотической жидкостях [2, 3, 4, 5].

Известен способ определения неоптерина в сыворотке крови методом W.E.Slazyk and F.W.Splerto (1990) [4], заключающийся в том, что к 2 мл плазмы добавляют 0,5 мл 30% трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и 0,25 мл раствора йода, тщательно перемешивают и инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Затем центрифугируют образцы 30 мин при 4°С и 3100 g и супернатант в объеме 1,75 мл наносят на колонку с катионообменным сорбентом. Колонку промывают 5 мл деионизированной дистиллированной воды и элюируют неоптерин 2 мл 1 М NH₄ОН. Элюат нейтрализуют добавлением 30 мкл ледяной уксусной кислоты и 50 мкл получившейся смеси вводят в инжектор. ВЭЖХ-анализ проводят на обращенно-фазовой колонке Excalibur 250×4,6 мм с сорбентом октадецилсилан (octadecylsilane-ODS) размером частиц 5 мкм со скоростью 1 мл/мин, подвижная фаза метанол-вода в соотношении 15:85, фильтры возбуждения 360-370 нм, фильтры эмиссии 418-700 нм. Применяется предколонка 70×4,6 мм с 5-микронным сорбентом Spherisorb ODS. Регистрируют пик и рассчитывают концентрацию неоптерина в сыворотке по высоте пика стандарта.

Однако данный способ определения неоптерина имеет ряд недостатков. Способ сложен по причине того, что для осуществления его требуется твердофазная экстракция неоптерина на картриджах. Способ требует дополнительного определения креатинина для пересчета конечной концентрации неоптерина. Кроме того, уменьшается точность способа за счет того, что применяемая ТХУ обладает собственной флюоресценцией и ее пик накладывается на пик неоптерина.

Известен способ определения неоптерина в сыворотке крови методом C.Carru et al. (2004) [5], заключающийся в том, что к 100 мкл плазмы добавляют 10 мкл 5% ТХУ (рН смеси равен 3), перемешивают и центрифугируют 5 мин при 3000 g, затем к 50 мкл супернатанта добавляют 200 мкл бидистиллированной воды и из полученной смеси 30 мкл вводят в инжектор. Анализ проводят на обращенно-фазовой колонке Waters 250×4,6 мм с сорбентом Spherisorb C₁₈ размером частиц 5 мкм со скоростью 1,5 мл/мин, подвижная фаза вода-ацетонитрил в соотношении 99:1 v/v, изократический режим, длина волны возбуждения 353 нм, эмиссии 438 нм. Регистрируют пик и рассчитывают концентрацию неоптерина в сыворотке по высоте пика стандарта.

Однако данный способ определения неоптерина имеет ряд недостатков. Способ сложен по причине того, что для осуществления его также требуется твердофазная экстракция неоптерина на картриджах. Кроме того, уменьшается точность способа за счет того, что применяемая ТХУ обладает собственной флюоресценцией и ее пик накладывается на пик неоптерина.

В качестве прототипа взят способ определения неоптерина по J.J.Rippin (1992) [6], заключающийся в том, что к 100 мкл плазмы добавляют 10 мкл раствора Fe-EDTA, перемешивают, инкубируют 20 мин при комнатной температуре. Экстракцию неоптерина проводят на колонке SCX Bond-Elut (propylbenzenesulfonic acid silica sorbent), промытой 1 мл 0,18 M HCl. После нанесения пробы колонку промывают 1 мл метанола и неоптерин элюируют 1 мл смеси NH₄OH (308 г/л) в ацетонитриле (1:5), элюат упаривают на воздухе. Сухой остаток растворяют в 100 мкл мобильной фазы, тщательно перемешивают и 20 мкл вводят в петлю. Анализ проводят на обращенно-фазовой колонке 250×4,5 мм с сорбентом ODS2 размером частиц 5 мкм со скоростью 1,5 мл/мин, подвижная фаза - 50 мл метанола в 1 л 50 мМ фосфатного буфера, рН 6,2; изократический режим, длина волны возбуждения 360 нм, эмиссии 440 нм. Применяют предколонку с сорбентом ODS2. Регистрируют пик и рассчитывают концентрацию неоптерина в сыворотке по высоте пика стандарта.

Однако данный способ за счет необходимости экстрагирования неоптерина на колонке SCX Bond-Elut удлиняет время исследования. Способ недостаточно чувствителен, так как при растворении сухого остатка в мобильной фазе с рН 6,2 (в слабокислой среде) снижается растворимость неоптерина, который частично выпадает в осадок и это снижает точность определения. Кроме этого, при использовании подвижной фазы с рН 6,2 вызывается эффект «карамелизации» верхнего слоя сорбента, что снижает точность определения и неблагоприятно действует на колонку, уменьшая срок ее службы.

Для повышения точности способа и скорости определения неоптерина экстракцию проводят смесью хлороформа и метанола в соотношении 1:1, сухой остаток растворяют в 0,02 М глициновом буфере с рН 8,4, а в качестве мобильной фазы для ВЭЖХ-анализа используют смесь: ацетонитрил-изопропанол - 0,01-0,05 М цитратный буфер в соотношении 1:1:98 с рН 3,5-4,5.

Способ осуществляют следующим образом. К 100 мкл сыворотки добавляют 10 мкл раствора Fe-EDTA, перемешивают, инкубируют 20 мин при комнатной температуре, добавляют смесь хлороформа и метанола в соотношении 1:1, встряхивают в течение 1 мин, центрифугируют 10 мин при 1000 g, отбирают верхний водно-метанольный слой, упаривают, сухой остаток растворяют в 100 мкл 0,02 М глицинового буфера, 20 мкл полученного раствора вводят в инжектор. Анализ проводят на обращено-фазовой колонке 100×4 мм с сорбентом Диасфер С₁₈ размером частиц 5 мкм со скоростью 500 мкл в мин, в качестве мобильной фазы используют смесь: ацетонитрил-изопропанол - 0,01-0,05 М цитратный буфер в соотношении 1:1:98 с рН 3,5-4,5; изократический режим, длина волны возбуждения 350 нм, эмиссии 430 нм. Регистрируют пик и рассчитывают концентрацию неоптерина в сыворотке по высоте пика стандарта.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что применяется жидко-жидкостная экстракция смесью метанол-хлороформ. После добавления в сыворотку данной смеси, встряхивания и центрифугирования образуется чистый водно-метанольный слой, под которым остается хлороформ, удерживающий все неполярные соединения, что позволяет получить экстракты особой чистоты и значительно продлить срок эксплуатации колонки. Если в прототипе сухой остаток после упаривания растворяют в мобильной фазе, то предлагаемый способ подразумевает растворение в 0,02 М глициновом буфере с рН 8,4, так как при растворении в мобильной фазе с рН 6,2 снижается растворимость неоптерина и тем самым снижается точность способа. Если в прототипе используется мобильная фаза: 50 мл метанола в 1 л 50 мМ фосфатного буфера, рН 6,2, то в предлагаемом способе используют в качестве мобильной фазы смесь: ацетонитрил-изопропанол - 0,01-0,05 М цитратный буфер в соотношении 1:1:98 с рН 3,5-4,5, так как: а) метанол придает вязкость элюенту, что обусловливает высокое давление в хроматографической системе и износ оборудования; б) применение ацетонитрила позволяет получать высокие и узкие пики, что повышает чувствительность и точность способа, а метанол обусловливает широкие «размытые» пики; в) изопропанол применяется в качестве стабилизатора времен удерживания, так как чем стабильнее время удерживания, тем специфичнее и лучше идентификация вещества; г) используемый элюент устраняет эффект «карамелизации» верхнего слоя сорбента, что увеличивает срок службы колонки; д) в интервале рН 3,5-4,5 определяется максимум флюоресценции неоптерина (таблица 1).

Таблица 1 Зависимость степени флюоресценции неоптерина от молярности и рН буферного компонента мобильной фазы
Тип мобильной фазы	Максимум флюоресценции 10 нг вещества, мВольт
Молярность
ацетонитрил-изопропанол - 0.001 М цитратный буфер (1:1:98)	150
ацетонитрил-изопропанол - 0.01-	200
0.05 М цитратный буфер (1:1:98)
ацетонитрил-изопропанол - 0.1 М	160
цитратный буфер (1:1:98)
рН
ацетонитрил-изопропанол - 0.01-	175
0.05 М цитратный буфер (1:1:98) рН 2
ацетонитрил-изопропанол - 0.01-	200
0.05 М цитратный буфер (1:1:98) рН3,5-4,5
ацетонитрил-изопропанол - 0.01-	160
0.05 М цитратный буфер (1:1:98) рН 6

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Кровь у здорового донора Б., 22 года, брали из локтевой вены утром натощак и оставляли при комнатной температуре на 1 час до полной ретракции сгустка. Затем пробирку с кровью центрифугировали в течение 15 мин при 3000 g и отделяли сыворотку для анализа. В одну пробирку типа эппендорф вносили 100 мкл сыворотки, в другую - 100 мкл раствора стандарта неоптерина известной концентрации (D-(+)-Neopterin, Sigma). Добавляли в каждую 10 мкл раствора Fe-EDTA, перемешивали, инкубировали 20 мин при комнатной температуре, добавляли смесь хлороформа и метанола в соотношении 1:1, встряхивали в течение 1 мин, центрифугировали 10 мин при 1000 g, отбирали верхний водно-метанольный слой, упаривали, сухой остаток растворяли в 100 мкл 0,02 М глицинового буфера, 20 мкл полученного раствора вводили в петлю инжектора. Анализ проводили на обращенно-фазовой колонке 100×4 мм с сорбентом Диасфер С₁₈ размером частиц 5 мкм со скоростью 500 мкл в мин, в качестве мобильной фазы использовали смесь: ацетонитрил-изопропанол - 0,01-0,05 М цитратный буфер в соотношении 1:1:98 с рН 3,5-4,5; изократический режим работы насоса, длина волны возбуждения 350 нм, эмиссии 430 нм. Для регистрации хроматограмм использовался программно-аппаратный комплекс «Multichrom for Windows» («Амперсенд», Россия). Время удерживания пика стандарта (10 нг) - 2,7±0,5 мин, высота - 200 мВ. Время удерживания пика неоптерина биопробы - 2,7±0,5 мин, высота 7 мВ (см. чертеж). Конечную концентрацию неоптерина рассчитывали в программе ChemCalc (© Дутов А.А.), и она составила 3,5 нг/мл.

Пример 2. Больной Д., 52 года, диагноз: рак антрального отдела желудка, T₃N₁M₀. Кровь брали и обрабатывали аналогично примеру 1. Время удерживания пика неоптерина биопробы - 2,7±0,5 мин, высота 31 мВ (см. чертеж). Концентрация неоптерина составила 20 нг/мл.

Данным способом проведено исследование у 15 здоровых доноров 18-23 лет и 10 больных с различной онкопатологией (таблица 2).

Таблица 2 Концентрации неоптерина, определяемые различными способами
	Прототип	Заявляемый способ
Здоровые (n=7)	<100 нмоль/л	-
Больные с трансплантацией костного мозга (n=5)	100-200 нмоль/л	-
Здоровые (n=15)	-	15,9±1,05 нмоль/л
Больные с различной онкопатологией (n=10)	-	20-100 нмоль/л

Воспроизводимость способа оценивали по значению коэффициента вариации (V):

V=(S/M)·100%,

где S - среднеквадратическое отклонение, М - средняя арифметическая. Коэффициент вариации (V) способа составил 6,6%.

Таким образом, предлагаемый способ является более точным, менее трудоемким и обладает высокой воспроизводимостью.

Источники информации

1. Фукс Д., Самсонов М.Ю., Вейс Г. и др. Клиническое значение неоптерина при заболеваниях человека//Тер. архив. - 1993. - №5. - С.80-87.

2. Шевченко О.П., Олефиренко Г.А., Орлова О.В. Неоптерин//Лаб. Медицина. - 2001. - №4. - С.55-61.

3. Насонов Е.Л., Самсонов М.Ю., Тилз Г., Фукс Д. Неоптерин: новый иммунологический маркер аутоиммунных ревматических заболеваний//Клин. Медицина. - 2000. - №8. - С.43-46.

4. Slazyk W.E., Splerto F.W. Liquid-chromatographic measurement of biopterin and neopterin in serum and urine/Clin Chem - 1990. - Vol.36. - №7. - P.1364-1368.

5. Carru С., Zinellu A., Sotgia S. et all. A new HPLC method for serum neopterin measurement and relationships with plasma thiols levels in healthy/Biomed Chromatogr - 2004. - Vol.18. - P.360-366.

6. Rippin J.J. Analysis for fully oxidized neopterin in serum by high-performance liquid chromatography/Clin Chem - 1992. - Vol.38. - №9. - P.1722-1724.

Способ определения неоптерина в сыворотке крови, включающий инкубацию сыворотки с раствором Fe-EDTA, экстракцию и ВЭЖХ-анализ, отличающийся тем, что экстракцию проводят смесью хлороформа и метанола в соотношении 1:1, экстракт центрифугируют 10 мин. при 1000 g, отбирают верхний вводно-метанольный слой, упаривают, сухой остаток растворяют в 0,02 М глициновом буфере с рН 8,4, ВЭЖХ-анализ проводят на обращено-фазовой колонке 100×4 мм с сорбентом Диасфер C₁₈ размером частиц 5 мкм со скоростью 500 мкл в мин. в изократическом режиме длиной волны возбуждения 350 нм, эмиссии 430 нм, а в качестве мобильной фазы используют смесь ацетонитрила, изопропанола, 0,01-0,05 М цитратного буфера в соотношении 1:1:98 с рН 3,5-4,5.