Способ получения конъюгата для стереоспецифического анализа

Изобретение относится к области (иммуно)биотехнологии и может быть использовано в производстве высокочувствительных и надежных тест-систем для определения антигенов, антител, нуклеиновых кислот и других стереоспецифических соединений. Сущность изобретения состоит в одноэтапном синтезе конъюгата, в состав которого входит стереоспецифичное (аффинное) соединение, ковалентно конъюгированное с суспензоидными частицами углерода. Благодаря высокой оптической плотности таких конъюгатов в видимой области светового спектра возможно непосредственное визуальное определение аналита в виде черных пятен или произвольного рисунка на рабочей поверхности твердой фазы, которые формируются через несколько секунд или минут после добавления конъюгата. Изобретение обеспечивает существенное увеличение чувствительности и способно расширить диапазон и повысить уровень информативной ценности и надежности фундаментальных и прикладных аналитических исследований в биологии, медицине и сельском хозяйстве и может быть использовано в технологии изготовления диагностикумов для иммунохимического, генно-гибридизационного и лиганд-рецепторного анализов, а также служить основой для создания безинструментальных систем для упрощенного и быстрого диагностического тестирования.

 

Изобретение относится к области иммунобиотехнологии и может быть использовано в производстве высокочувствительных тест-систем для (качественного и количественного) определения антигенов, антител и других иммунореактивных соединений, а также в технологии изготовления безинструментальных и надежных диагностикумов для генно-гибридизационного и лиганд-рецепторного анализа. Предполагаемая область применения изобретения включает практику аналитических исследований в биологии, медицине, сельском хозяйстве, криминологии, выполняемых с фундаментальными или прикладными (диагностическими) целями.

В иммуноаналитической практике известен ряд способов, каждый из которых условно можно разделить на три стадии: формирование специфического комплекса антиген-антитело, введение в него метки и ее визуализация тем или иным способом. К таким методам можно отнести радиоиммунологический анализ (РИА) (Yalow R.S., Berson S.A. - Nature, 1959, v.184, р.1648-1649), иммуноферментный анализ (ИФА) (Ngo Т.Т. & Lenhoff Н.М. Enzyme-mediated immunoassay, 1985, Plenum Press, New York.), био- и хемилюминесцентные иммуноанализы (Woodhead J.S., Weeks I. - Pure & Appl. Chem. 1985, v.57, p.523-529). Все перечисленные способы обладают рядом положительных качеств: универсальностью, т.е. позволяют определять любое соединение, против которого возможно получение специфических антител; избирательностью и специфичностью; высокой чувствительностью. Однако наряду с достоинствами у перечисленных (аналогичных заявляемому способу) методов анализа есть существенные недостатки. В первую очередь это опасность для здоровья, которую представляет введение изотопных меток, подготовка и выполнение РИА, а также использование токсических, канцерогенных хромогенов в ИФА; зависимость от сложной и дорогостоящей регистрирующей аппаратуры и ограниченно доступных реагентов, используемых либо в технологии изготовления диагностикумов, либо в самой процедуре анализа.

Известны системы анализа с прямым мечением специфичных аналиту соединений (анти-аналитов) оптически плотными частицами или водорастворимыми цветными полимерами различной природы и размеров. Среди таких меток - латексы, в том числе цветные (Tarcha et al., Abbot Labs., Eur. pat. appl. 89116594.6), эритроциты (Guesdon J-L., AvrameasS., Ann. Immunol., 1980, v.131 С, р.389-396), неметаллические коллоиды серы, селена, теллура (Yost et al., Eur. pat. appl. 88110459.0), полимеризованные красители Конго красный, Трипановый голубой, Lissamine blue (Henry Robert P., US Pat. 4.452.886), коллоидное золото (Roth J., Heitz P.U., Immunolabeling with the Protein A - Gold Technique: An Overview, Ultrastructural Pathology, 1989, 13:467-484). Использование данных меток позволяет визуально определять присутствие аналита как в гомогенных системах анализа (без разделения реагирующих компонентов) - например по агглютинации довольно крупных частиц (с размерами от 0,2 до нескольких микрометров) или изменению спектральных характеристик (цвета) специфически агглютинирующих коллоидов, так и в многочисленных гетерогенных системах ЭритроИммуноАдсорбции и, более широко, Седиментационно-Адсорбционном (Иммуно)Анализе; дот-, Вестерн-, Саузерн-, Нозерн-блотинге; иммуно- и гибридофильтрации (Flow-Through анализах), иммуномиграции (иммунохроматографии) и ряде других - по окрашиванию зоны специфического связывания аналита на непористом или пористом твердофазном носителе. Несмотря на возможность количественной регистрации с использованием простых колориметров, рефлектометров, денситометров, основным преимуществом перечисленных методов является прямое визуальное определение аналита, что условно выделяет их в группу так называемых безинструментальных методов.

Наиболее близким к заявляемому объекту по технической сущности и достигаемому результату является способ получения конъюгатов на основе частиц коллоидного углерода (Д.Ю.Плаксин, М.Б.Раев, Е.Т.Громаковская. Способ стереоспецифического анализа и способ получения конъюгата для стереоспецифического анализа. Патент РФ №20899212 от 10.09.1997).

В прототипе задачу повышения надежности анализа и стабильности используемых в анализе детектирующих реагентов решают путем ковалентного конъюгирования анти-аналита с частицами углерода. Для этого частицы вначале покрывают водорастворимым полимером, который является инертным амфипатическим соединением, способным относительно прочно сорбироваться на поверхности частиц. Сорбция полимера позволяет получить стабильный в растворах суспензоид. Сорбированный полимер экспонирует в водную фазу функциональные группы, способные ковалентно реагировать с гомо и/или гетеробифункциональными контролирующими соединениями. Последующая обработка полученного комплекса бифункциональным реагентом, взятым в большом молярном избытке по отношению к функциональным группам полимера, приводит к ковалентной сшивке между сорбированными молекулами полимера и одновременно - к внедрению на поверхность комплекса реакционноспособных групп бифункционального реагента. Следующим этапом является освобождение активированной метки от избытка конъюгирующего реагента. Последующее соединение с интактным (немодифицированным) анти-аналитом (аффинным соединением) завершается ковалентной пришивкой молекул анти-аналита к поверхности углеродной метки. В результате описываемый способ позволяет получать конъюгаты прочной ковалентной структуры, которые устойчивы в растворах, в том числе в присутствии высоких концентраций детергентов.

Вместе с тем, многоэтапный характер конъгирования создает ряд технологических сложностей. В первую очередь это касается необходимости проведения ряда хроматографических процедур очистки: от избытка сорбируемого полимера на первом этапе, и, как следствие, необходимость концентрирования; от избытка активирующего бифункционального реагента, за которым вновь следует процедура концентрирования. Подобная многоэталность не только удлиняет описанный в прототипе способ, но и делает его трудоемким, мало технологичным, затратным. Кроме того, использование в качестве сорбируемого на поверхности частиц инертного белка (БСА) приводит к уменьшению количества связываемого аффинного соединения, что в конечном итоге приводит к снижению чувствительности стереоспецифического анализа проводимого с использованием таких конъюгатов.

Дополнительное преимущество делает заявляемый способ более надежно воспроизводимым независимо от диапазона концентраций тех или иных антианалитов. Создаваемый способом положительный эффект в целом характеризуется существенно большей по сравнению с прототипом надежностью и универсальностью.

Целью создания изобретения является разработка одноэтапного способа получения стереоспецифических конъюгатов.

Поставленную цель достигают путем использования в качестве полимера, сорбируемого на поверхности частиц углерода, молекул аффинного соединения (антианалита), которые конъюгируют в одну стадию добавлением бифункционального реагента. Единственным этапом хроматографии является удаление из готового конъюгата конъюгирующего соединения и молекул несвязавшегося антианалита.

Заложенный в заявляемый способ принцип одноэтапного ковалентного конъюгирования представляет возможность для очень широкого выбора конкретных сорбируемых полимеров и активирующих/конъюгирующих реагентов. Данное обстоятельство вынуждает заявителя представить формулу изобретения, составленную в принципиальных терминах, попытка конкретизации которых неминуемо привела бы к сужению области действия заявляемого объекта.

В представленных ниже конкретных примерах описан способ получения детектирующих конъюгатов, осуществляемый с использованием глутарового альдегида в качестве сшивающего (гомо)бифункционального реагента. Использование данного вещества не является принципиальным для осуществления способа. Вместо глутаральдегида могут быть использованы другие известные гомо- и гетеробифункциональные соединения, которые в реакциях второго порядка способны реагировать предпочтительно с наиболее универсально представленными в возможных антианалитах и антиантианалитах первичными аминогруппами (хотя для ковалентного конъюгирования с суспензоидными метками таких антианалитов, как Fab′-фрагменты антител, более оптимальными могут оказаться, например, малеимидные реагенты, участвующие в реакциях тиол-дисульфидного обмена).

Использование глутаральдегида является предпочтительным, поскольку дополнительно отвечает требованию универсальности предлагаемого способа и является гомобифункциональным реагентом, относительно специфично реагирующим с первичными аминогруппами белков. Кроме того, немаловажным обстоятельством является доступность и практически самая низкая стоимость глутаральдегида, что также выгодно отличает его от возможных других, использование которых в рамках предлагаемого способа с экономической точки зрения очевидно является менее выгодной возможностью.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1.

I. Получение пептизированных реагентов углеродных меток.

К 20 мл раствора Белка А 1-50 мг/мл в 0,01-0,2 М Фосфатном Буферном Растворе рН 6-8,5 (ФБР) добавляют 0,1-2 грамма углерода. Смесь перемешивают на магнитной мешалке или роторном встряхивателе типа "Vortex" в течение времени, достаточного для полной предварительной пептизации (смачивания) частиц углерода. Полученную суспензию озвучивают в ультразвуковом дезинтеграторе. Условия ультразвуковой обработки суспензии (интенсивность и мощность, количество и продолжительность циклов озвучивания) подбирают таким образом, чтобы разбиваемая суспензия при одновременном (возможном) охлаждении не разогревалась до температуры свыше 40°С. Полученный в результате эффективной ультразвуковой дезинтеграции суспензоид центрифугируют при 6000 g в течение 5-10 минут с целью удаления оставшихся относительно крупных частиц. Покрытые Белком А суспензоидные частицы углерода с размерами 160-170 нм, содержащиеся в супернатанте готовы для дальнейшего конъюгирования.

Аналогичным образом готовят частицы, пептизируя их в растворах Белка G, стрептавидина, антител в тех же условиях.

II. Получение конъюгатов углеродных меток с антианалитами (Белком А, Белком G, Стрептавидином, Антителами).

На роторном встряхивателе соединяют равные объемы пептизированных Белком А частиц и раствора глутарового альдегида до конечной концентрации последнего 1-25%. Время конъюгирования от 30-120 минут. Готовый конъюгат освобождают от избытка глутарового альдегида и несвязанного антианалита 3-4-кратным центрифугированием или гель-фильтрацией на колонке с Сефарозами (6В, 4В, 2В; CL-6B, CL-4B, CL-2B), Сефакрилом S-300 или другими подходящими гелями (Тойоперлы, Ультрагели и др.), имеющими предел исключения не ниже одного миллиона Дальтон для глобулярных белков. Фракции, вышедшие в холостом объеме и содержащие конъюгат, объединяют и добавляют БСА и глицерин до конечных концентраций соответственно 1% и 20%.

Конъюгаты углеродных частиц с Белком G, стрептавидином, антителами получают аналогичным способом.

Рабочая концентрация конъюгагов, используемая в анализах, составляет 0,03% в пересчете на сухой вес метки.

Полученные конъюгаты были использованы в нижеописываемых примерах анализа.

Пример 1.

Иммунохроматографическое определение IgG человека с использованием конъюгата Белок А - Углерод в сравнении с Белком А, меченным коллоидным золотом с размерами частиц 40 нанометров.

В анализе использовали полоски нитроцеллюлозы (Millipore) с размерами пор 5 микрометров с иммобилизированными на них в виде пятен IgG человека (наносимый объем 0,001 мл) из кратных 10 разведении 1 мг/мл, 100 мкг/мл, 10 мкг/мл, 1 мкг/мл, 100 нг/мл, 10 нг/мл, 1 нг/мл. Край полоски, предварительно блокированной в растворе 1% казеина в фосфатном буферном растворе, содержащем 0,05% Твина 20 (ФБР-Тв.), помещали в раствор конъюгатов на 10-15 сек (время, достаточное для прохождения за счет капиллярных сил фронтом реагентов расстояния около 10 мм), а затем в ФБР-Тв.

По мере прохождения фронтом мигрирующего диагностикума зоны иммобилизации лиганда наблюдали проявление в виде черных пятен результатов анализа. Чувствительность системы детекции с использованием конъюгага Белок А - Углерод составляла 10 пг/пятно, с конъюгатом Белок А - Золото - 100 пг/пятно.

Пример 2.

Серологическое определение анти-ВИЧ антител на непористой твердой фазе с использованием конъюгата Белок G - Углерод.

В качестве твердой фазы использовали планшеты для серийных разведении из полистерола, внутреннюю поверхность лунок которых покрывали суммой синтетических пептидов, представляющих собой детерминанты основных структурных белков ВИЧ-1,2, на которую наносили по 0,001 мл сыворотки кролика против ВИЧ антигенов из разведений кратных двум. После 15-минутной инкубации и отмывки ФБР-ТВ, в лунки вносили конъюгат Белок G - Углерод на 15 минут, после чего, удалив конъюгат, наблюдали результаты анализа в виде четких контрастных пятен. Параллельно связанные антитела определяли Белком А, меченным коллоидным золотом с размерами частиц 40 нанометров и Белком А, меченным пероксидазой хрена. Чувствительность анализа оценивали по конечному разведению сыворотки, дающему отличное от фона пятно. В результате сравнительного анализа получили чувствительность определения при помощи Углеродного конъюгата 1/40960, с использованием ферментного конъюгата - 1/1280 (в стандартной процедуре проявления 4-хлорнафтолом) и практически неразличимые результаты определения конъюгатом Белок А - Золото.

Пример 3.

Дот-гибридизационный анализ ДНК фага лямбда с использованием конъюгата Стрептавидин-Углерод.

Кратные 10 серийные разведения денатурированной ДНК фага лямбда апплицировали в объемах по 1 мкл на нитроцеллюлозные мембраны 0,45 мкм. Иммобилизированную мишеневую ДНК припекали в течение 2-х часов при 80°С в вакууме. Гибридизацию проводили с использованием в качестве зонда химически биотинилированной ДНК фага лямбда. Отмытые мебраны обрабатывали блокирующим буфером с 0,5% коллоидного казеина и 1% желатина в течение часа и осуществляли определение инкубацией с рабочим разведением конъюгата Стрептавидина с Углеродом в течение 30 минут при комнатной температуре и мягком покачивании, с последующей 3-кратной отмывкой ФБР-ТВ перед финальным учетом результатов. Параллельно детекцию осуществляли стандартным конъюгатом Стрептавидин-Пероксидаза Хрена с визуализацией гибридизованных образцов в колориметрической реакции с о-дианизидином.

В результате описанных сравнительных экспериментов в ряде воспроизводимых серий чувствительность анализа с применением обеих систем определения с использованием как суспензоидных (4-х различных цветов), так и ферментного конъюгатов составила от 1 до 0,1 пикограммов мишеневой ДНК на точку.

Пример 4.

Двухсайтное иммунохроматографическое определение хорионического гонадотропина человека с использованием суспензоидного конъюгата Углерод-Моноклональные Антитела.

Приготовление связывающих ХГЧ пористых полосок.

На прозрачную (ПВХ) толстую (0,5 мм) жесткую клейкую ленту приклеивали полоску из 5-мкм нитроцеллюлозного фильтра с размерами 2*16 мм. Один из узких концов плотно, с помощью той же клейкой подложки, соединяли с впитывающим элементом (1*1 см квадрат толстой высокопористой хроматографической бумаги), считая в последующем данный конец верхним. На середину нитроцеллюлозной полоски тонкой линией с помощью Гамильтоновского шприца наносили моноклональные анти-ХГЧ антитела (АВ 0420), 1 мг/мл в ФБР. После подсыхания полоски через 30 минут после нанесения связывающих антител полоску блокировали замачиванием в 1% казеине в ФБР-Тв на 1 час при комнатной температуре, после чего отмывали ФБР-Тв и вновь высушивали.

Определение стандарта ХГЧ.

Стандарт ХГЧ разводили кратно 2 в ФБР-ТВ и моче здорового донора, добавленной твином-20 до 0,1%. К 50 мкл стандартных разведении ХГЧ, выполненных в лунках микротитровального планшета, добавляли по 50 мкл суспензоидного конъюгата анти-ХГЧ антитела (АВ 0421) - Углерод в рабочем разведении в ФБР-Тв. Сразу же после этого в лунки опускали нижние концы хроматографических полосок с иммобилизированными на них моноклональными анти-ХГЧ антителами. Через 2-3 минуты результаты анализа определяли визуально по наличию (положительный результат: черные полосы на белом фоне) или отсутствию (отрицательный результат) связывания суспензоидного конъюгата в зоне иммобилизации первых антител. Чувствительность анализа в нескольких сериях испытаний сконструированной системы составила 50 МЕ/л. Данная чувствительность удовлетворяет уровню диагностической потребности иммунохимического определения ранней беременности сроком в 1 неделю.

Вышеприведенные примеры демонстрируют возможности настоящего изобретения и не ограничивают как спектр возможных технологических приемов синтеза конкретных детектирующих реагентов, так и область возможного применения изобретения в целом.

Приводимые в примерах конкретные количественные параметры, даже в области указываемых диапазонов, не фиксируются формулой изобретения, потому что не являются принципиальными условиями осуществления заявляемого способа.

Технико-экономическая эффективность заявляемого способа заключается в существенном повышении технологичности синтеза стереоспецифичных детектирующих реагентов (конъюгатов) за счет одностадийности процедуры конъюгирования, а также в увеличении чувствительности и надежности стереоспецифического анализа с прямой визуализацией аналитов. Повышенная чувствительность анализа определяется использованием нового технологического приема, заключающегося в пептизации частиц углерода анти-аналитом, что приводит к увеличению числа молекул аффинных соединений, конъюгированных с углеродной меткой.

Технология получения конъюгатов углеродных меток независима от уникального или дорогостоящего оборудования и объективно дефицитных или дорогих реагентов. Универсальность и надежная воспроизводимость предлагаемого способа доказана в 12 сериях повторных синтезов конъюгатов с различными анти-аналитами.

Предлагаемые конъюгаты могут служить основой создания эффективных безинструментальных систем для упрощенного диагностического тестирования и эффективно использоваться в разнообразных "один пациент - один тест" наборах для амбулаторных, пребольничных и больничных анализов, включая срочные клинические и эпидемиологические ситуации, а также в массовых "домашних" системах, пригодных для индивидуального использования.

Способ получения конъюгата для стереоспецифического анализа, включающий соединение антианалита с суспензоидными частицами коллоидного углерода, отличающийся тем, что к антианалиту в фосфатном буфере добавляют углерод, смесь перемешивают для пептизации частиц углерода и далее обрабатывают в ультразвуковом дезинтеграторе, полученный суспензоид центрифугируют, затем добавляют раствор глутарового альдегида, полученный конъюгат освобождают от избытка глутарового альдегида и несвязавшегося антианалита путем центрифугирования или гель-фильтрации, а затем к объединенным фракциям, содержащим конъюгат, добавляют бычий сывороточный альбумин и глицерин.