Штамм гриба aspergillus oryzae - продуцент кислых протеаз и ксиланазы

Изобретение относится к биотехнологии, касается штамма Aspergillus oryzae 12, обеспечивающего высокий уровень синтеза кислых протеаз и ксиланазы. Штамм получен путем многоступенчатой селекции штамма Aspergillus oryzae 387 (ВКПМ F-683) с использованием эффективных методов мутагенеза. Штамм депонирован в коллекции ВКПМ под №F-932. Изобретение обеспечивает получение ферментативного комплекса с высокой протеолитической и ксиланолитической активностью в культуральной жидкости, уровень которых превышает аналог в 2,5-2,8 раза. 2 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению нового штамма Aspergillus oryzae 12 - продуцента комплекса кислых протеаз и ксиланаз с высокой общей активностью в культуральной жидкости. Штамм получен из известного штамма Aspergillus oryzae 387 (ВКПМ F-683) путем многоступенчатой селекции с использованием эффективных методов мутагенеза. Изобретение обеспечивает высокий уровень синтеза комплекса кислых протеаз и ксиланазы.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к созданию нового штамма, используемого для получения комплекса ферментов, - кислых и слабокислых протеаз, ксиланазы. Протеолитические и ксиланолитические ферменты широко применяются в различных отраслях промышленности: спиртовой, пивоваренной, винодельческой, кормовой и других. Это обусловлено тем, что перерабатываемое сельскохозяйственное сырье содержит высокомолекулярные белковые полимеры и растительные волокна. Наиболее характерное практическое применение комплексных препаратов кислых и слабокислых протеаз и ксиланаз связано с интенсификацией биотехнологических процессов в бродильных отраслях при производстве спирта, пива, с обработкой растительного сырья с высоким содержанием белковых веществ и ксиланов при производстве кормов и в др. областях АПК. В связи с этим селекция новых грибных штаммов для получения кислых протеаз и ксиланаз актуальна.

Известны штаммы - продуценты грибных протеаз из рода Aspergillus oryzae 251-90, 824-32 (1, 2), при глубинном культивировании которых синтезируются кислые и слабокислые протеазы. Недостатком этих продуцентов является их низкая продуктивность по протеазам и отсутствие биосинтетической способности по отношению к ксиланазе.

Наиболее близким к заявляемому объекту является штамм Aspergillus oryzae 387, регистрационный номер ВКПМ F-683 (3), один из наиболее активных продуцентов протеаз. В глубинной культуре известного штамма Asp.oryzae 387 на 42 часа роста протеолитическая активность достигает 8,7-11,8 ед. ПС/см3 в зависимости от состава питательной среды; кроме того, синтезируется ксиланаза с активностью 3,4-4,3 ед. КС/см3.

Недостатком этого штамма является низкий уровень протеолитической и ксиланолитической активности культуральной жидкости (к.ж.).

Задачей, поставленной настоящим изобретением, является получение штамма гриба Aspergillus oryzae, обладающего высокой способностью к образованию комплекса протеаз, проявляющих максимальную активность в кислой и слабокислой зоне рН, а также к синтезу ксиланазы.

Технический результат, получаемый от использования нового штамма, заключается в получении ферментативного комплекса с высокой протеолитической и ксиланолитической активностью в культуральной жидкости, уровень которых превышает аналог в 2,5-2,8 раза.

Задача решается созданием нового штамма путем селекции и мутагенеза из известного штамма Aspergillus oryzae 387 (4), способного к быстрому росту на простых по составу питательных средах и активному синтезу внеклеточных протеаз и ксиланазы.

Заявляемый штамм Aspergillus oryzae 12 получен путем многоступенчатой селекции с использованием эффективных методов мутагенеза, депонирован в ВКПМ под №F-932.

В результате мутагенеза после неоднократного отбора и рассева вариантов был получен штамм Aspergillus oryzae 12 - продуцент кислых и слабокислых протеаз и ксиланазы, а также сопутствующего фермента - α-амилазы.

Изучали уровни продукции протеаз и ксиланазы в культуральной жидкости, полученной путем выращивания заявляемого штамма и известных штаммов в жидкой питательной среде с аэрацией и перемешиванием. Общую протеолитическую активность определяли модифицированным методом Ансона с использованием в качестве субстрата бычьего гемоглобина при оптимальных условиях действия протеаз, ксиланазную - по Шомоди-Нельсона, амилолитическую - по ГОСТ 20264.4-89. Сравнительные показатели уровней протеолитических активностей культуральной жидкости штамма Asp. oryzae 12 с прототипами представлены в табл.1 и 2.

Таким образом, в результате селекции и мутагенеза получен новый штамм Aspergillus oryzae 12, обладающий высоким уровнем синтеза протеаз и ксиланазы, а также α-амилазы, что позволяет повысить технологичность процесса получения комплекса ферментов кислых и слабокислых протеаз и ксиланазы с высоким уровнем их активности в культуральной жидкости. Штамм отличается от известного и по культурально-морфологическим признакам.

Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры и на косаках с сусло-агаром в отделе биотехнологии ферментных препаратов в пищевой промышленности государственного научного учреждения ВНИИ пищевой биотехнологии г. Москвы.

Штамм Aspergillus oryzae 12 характеризуется следующими свойствами.

Культуральные признаки. Через 6 суток роста на сусло-агаре образуются колонии диаметром 60×65 мм, поверхность колонии шероховатая с концентрическими окружностями, профиль колонии плоский, форма колонии неправильная, края волнистые, цвет - зеленый, края светло-желтые, с возрастом цвет колонии темнеет. Цвет с обратной стороны - серый.

При росте на агаризованной среде Чапека размер колонии через 6 суток 25×25 мм, цвет колонии оливковый, форма колоний округлая, края ровные, светло-желтые.

На всех средах наблюдается обильное спорообразование, пигменты в среду не выделяются, эксудата нет, слабый запах плесени.

Морфология штамма. Мицелий гриба септированный, разветвленный, со вздутиями, конидии формируются экзогенно; поверхность конидий гладкая, форма, в основном, округлая; толщина гиф 3-5 мкм.

Физиолого-биохимическая характеристика. Тип катаболизма - дыхание. Отношение к кислороду - аэроб. Оптимальная температура роста 30-34°С, максимальная - 50°С, минимальная - 18°С. Оптимальное значение рН среды для роста гриба и биосинтеза ферментов 5,4; рост продуцента имеет место в зоне рН от 2,5 до 10,0. Продуцент растет на средах с содержанием сухих веществ от 0,5 до 18%.

В качестве источника углерода гриб использует крахмал, глюкозу, сахарозу, ксилозу, мальтозу, маннит, глицерин, галактозу. Продуцент ассимилирует нитраты, аммонийный и аминный азот, белки.

Штамм непатогенный.

Штамм Aspergillus oryzae 12 использовали для получения кислых и слабокислых протеаз и ксиланазы, а также сопутствующего фермента - α-амилазы.

При глубинном культивировании штамма Aspergillus oryzae 12 в зависимости от состава питательной среды протеолитическая активность составляет 21,0-24,6 ед. ПС/см3, ксиланолитическая - 7,5-9,8 ед. КС/см3, амилолитическая - 13,5-14,4 ед. АС/см3.

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Aspergillus oryzae 12 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; КН2PO4 - 1,5; остальное - водопроводная вода (среда 1), рН - естественный. Ферментационную питательную среду засевают вегетативным посевным материалом в количестве 4%, выращенным при 30°С в течение 18 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см3, содержащих 50 см3, на круговой качалке (220-240 об/мин) при температуре 30-32°С в течение 40 часов. Активность внеклеточных протеаз составляет 21,2 ед. ПС/см3, ксиланазы - 9,5 ед. КС/ см3, α-амилазы - 13,5 ед. АС/см3.

Пример №2. Штамм Aspergillus oryzae 12 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; Д-ксилоза - 0,5; КН2PO4 - 1,5; остальное - водопроводная вода (среда 2), рН - естественный. Культивирование проводят, как указано в примере 1. Активность внеклеточных протеаз составляет 23,0 ед. ПС/см3, ксиланазы - 10,8 ед. КС/см3, α-амилазы - 13,0 ед. АС/см3.

Пример №3. Штамм Aspergillus oryzae 12 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; ксилан - 0,1; КН2PO4 - 1,5; остальное - водопроводная вода (среда 3), рН - естественный. Культивирование проводят, как указано в примере 1. Активность внеклеточных протеаз составляет 24,6 ед. ПС/см3, ксиланазы - 11,8 ед. КС/см3, α-амилазы - 14,4 ед. АС/см3.

Таблица 1

Сравнительная оценка физиологической активности грибов Aspergillus oryzae - продуцентов протеаз
ШтаммДлительность культивирования, чФерментативная активность, ед./см3
ПСКСAC
251-90725,008,7
3874211,84,010,8
123824,210,213,6
Таблица 2

Влияние питательных сред на ферментативную активность гриба Aspergillus oryzae шт.387 и шт.12
Штамм№ питательной средыФерментативная активность
ПСКСAC
ед./см3% увеличенияед./см3% увеличенияед./см3% увеличения
38718,7-3,4-12,5-
29,8-3,8-12,3-
39,6-4,4-13,2-
12121,21439,517913,58
223,014510,818413,06
324,615611,816814,49

Источники литературы

1. Зуева Р.В. Физиолого-биохимические исследования экспериментально полученного мутанта Aspergillus oryzae - активного продуцента кислой протеиназы. Автореферат канд. диссертации. - М.: 1971.

2. А.С. СССР №1440922, кл. С12N 1/14, 1988.

3. Патент РФ 2208633, кл. 12 N 1/20, 2001.

4. Патент РФ 2070921, кл. 12 N 1/14, 1993.

Штамм гриба Aspergillus oryzae 12, ВКПМ F-932 - продуцент кислых протеаз и ксиланазы.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано для производства этилового спирта или корма моногастральных животных. .

Изобретение относится к получению ферментных препаратов и может быть применено в микробиологической промьшшенности при получении иологически активных соединений, в сельском- Хозяйстве, кожевенной промьниленности.
Изобретение относится к биотехнологии. .
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к средствам для борьбы с личинками жуков-щелкунов. .

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к очистке серосодержащих сточных вод химической промышленности с помощью микроорганизмов. .
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения полисахарида, обладающего иммуномодулирующей активностью. .
Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к средствам защиты растений. .
Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к средствам биологической защиты растений. .
Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к средствам биологической защиты растений. .
Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к средствам биологической защиты растений от почвенных вредителей. .
Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к средствам биологической защиты растений. .
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к созданию нового штамма, используемого для получения фермента - комплекса кислых и слабокислых протеаз

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности области биотехнологической переработки лигноцеллюлозных материалов
Наверх