Способ получения днк-чипов (варианты)

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биоорганической химии и может быть использовано для выявления и идентификации биологического материала. ДНК-чип получают путем иммобилизации олигонуклеотида, содержащего концевую нуклеофильную группу, на поверхности полимера, обработанного растворами гидроксида металла различной концентрации. Причем иммобилизацию олигонуклеотида проводят как в присутствии, так и в отсутствие конденсирующего агента. Применение изобретения позволяет получить ДНК-чипы высокого качества. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 1 табл., 8 ил.

 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биоорганической химии, а точнее к способу ковалентной иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности полимерных материалов, содержащих этерифицированные карбоксильные группы.

Предшествующий уровень техники

Технологии с использованием биологических чипов, активно развиваемые в мире, являются мощнейшим из существующих инструментов для выявления и идентификации биологических материалов. Биологические микрочипы представляют собой ту или иную твердую подложку, на которой нанесены или определенные фрагменты нуклеиновых кислот, или белки, или углеводы, или какие-либо иные молекулы-зонды, способные быть узнанными или проявлять биологическую активность.

В качестве твердой подложки могут выступать стекло, кремний, золото, мембранные фильтры, гидрогели на основе полиакриламида. Однако недостатками этих материалов является их высокая стоимость, а также технические трудности, возникающие при изготовлении подложки сложной геометрической формы, например, имеющей лунки, на дне которых иммобилизованы олигонуклеотиды (подобные конструкции крайне удобны, в частности, в клинических анализах для размещения на одном микрочипе нескольких образцов разных анализируемых жидкостей). Этих недостатков лишены подложки из пластмасс, легко подвергающихся термоформовке и производимых в больших объемах. Данное изобретение направлено на создание более совершенных и дешевых способов иммобилизации олигонуклеотидов на поверхности полимерных подложек, в частности, содержащих этерифицированные карбоксильные группы.

Из всего набора крупнотоннажных промышленных пластмасс наиболее удобными для химической иммобилизации молекул-зондов представляются полимеры, содержащие сравнительно высокореакционноспособные сложноэфирные группы, например полиметилметакрилат. Большинство других пластмасс являются химически инертными, что затрудняет их модификацию.

Ранее известные способы иммобилизации олигонуклеотидов или других молекул на поверхности полиметилметакрилата имеют ряд недостатков.

Известен способ модификации сложноэфирных групп на поверхности полимера, который заключается в их аминолизе под действием полиаминов [1,2], в частности гексаметилендиамина [3] или моноаниона гексаметилендиамина [4]. На полученной таким образом аминированной поверхности проводят иммобилизацию зонда в присутствии подходящих кросс-линкеров или конденсирующих агентов.

Главным недостатком этого подхода является высокая неспецифическая сорбция олигонуклеотидов, являющихся полианионами, на положительно заряженной аминированной поверхности, обладающей гидрофобными свойствами, что также увеличивает возможность неспецифической сорбции. Следствиями неспецифической сорбции являются снижение чувствительности анализа и необходимость жестких условий отмывки чипа в ходе работы.

Известен метод [5], состоящий следующих стадий:

1) проведение переэтерификации поверхностных сложноэфирных групп полимера действием поливинилового спирта в растворе;

2) расщепление нанесенного поливинилового спирта периодатом натрия с получением на поверхности носителя высокоактивных альдегидных групп;

3) проведение их конденсации с аминогруппами в составе молекулы зонда;

4) восстановление образующейся азометиновой группы действием боргидрида натрия для предотвращения гидролитического расщепления сшивки.

Очевидными недостатками данного метода являются сложность, применение дорогостоящих реагентов, невозможность длительного хранения активированной подложки вследствие легкого окисления альдегидных групп на воздухе.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является изобретение [6], в котором описан способ модификации поверхности полиметилметакрилата (РММА) для последующего ковалентного связывания с полинуклеотидами в диагностических целях. По данному способу поверхность РММА обрабатывают раствором щелочи в концентрации от 2-15М NaOH или КОН в диапазоне температур от 10°С до 100°С, причем полинуклеотиды перед иммобилизацией на поверхность РММА предварительно нагревают до 70-100°С в течение от 5 минут до 4 часов и затем добавляют гидрохлорид диметиламинопропилэтилкарбодиимида. Затем раствор наносят на модифицированную поверхность РММА и затем охлаждают до 4°С в течение 16 часов. Таким образом, общее время нанесения полинуклеотида на поверхность составляет до 20 часов.

Недостаток данного изобретения связан с тем, что одностадийный процесс обработки поверхности РММА приводит либо к грубому воздействию на поверхность полимера и значительной эрозии поверхности при одновременном воздействии высокой концентрации щелочи и высокой температуры (15М при 100°С), или к значительно более длительному воздействию на поверхность (2М при 10°С), что значительно увеличивает общее время модификации поверхности.

С другой стороны, указанный в изобретении температурный диапазон от 10°С до 100°С не позволяет использовать для быстрой модификации поверхности полимера высококонцентрированные растворы щелочи, соответствующие по составу расплавам кристаллогидратов щелочей. Например, расплав моногидрата гидроксида калия, получаемый при температуре 140°С, имеет концентрацию КОН 20М [7].

С целью упрощения процесса печати ДНК-чипов был предложен метод, включающий получение на поверхности подложки высокореакционноспособных групп, образующих ковалентные связи с модифицированными олигонуклеотидами в мягких условиях и в отсутствие дополнительных реагентов. Однако описанные пути реализации этого метода трудоемки из-за большого числа стадий и предполагают использование дорогостоящих реактивов. Например, в работе [3] активированная поверхность полиметилметакрилата получается в результате обработки аминированной поверхности (способ модификации указан выше) гетеробифункциональным кросс-линкером сложного строения, а именно N-гидроксисукцинимидил-3-N-сульфомалеимидопропионатом.

Технической задачей, решаемой в данном изобретении, является разработка более быстрого и эффективного способа модификации поверхности для последующей иммобилизации олигонуклеотидов на поверхность полимеров, содержащих сложноэфирые группы.

Раскрытие изобретения

Одним из объектов изобретения является усовершенствованный способ получения ДНК-чипов, который характеризуется повышенной эффективностью формирования модифицированной поверхности за счет постадийной модификации поверхности, включающей:

а) стадию выбора типа полимера и формы слайда исходя из условий его последующего применения в качестве ДНК-чипа,

б) стадию выбора условий модификации, по крайней мере, части поверхности ДНК-чипа, в соответствии с которой определяют диапазон изменения концентрации гидроксида металла и/или диапазон изменения температур, в котором происходит модификация и длительность стадий,

в) стадию предварительной обработки поверхности полимера ДНК-чипа, в процессе которой используют комбинированное воздействие водного или водно-спиртового раствора гидроксида металла в выбранном температурном и временном режиме,

г) стадию формирования эффективной модифицированной поверхности, в процессе которой на модифицированной поверхности ДНК-чипа формируют достаточное количество карбоксильных групп, полученных из сложноэфирных групп полимера.

Сущность изобретения заключается в выборе условий для оптимальной модификации поверхности полимера для последующей эффективной иммобилизации олигонуклеотидов, имеющих концевую нуклеофильную группу, на поверхность модифицированного полимера, содержащего карбоксильные группы, образованные в процессе реакции щелочного гидролиза из сложноэфирных групп, входящих в состав полимера.

Предлагаемый метод является простым и надежным, в нем не используются дорогостоящие реагенты.

Изобретение поясняется с помощью чертежей.

На фиг.1 показана схема модификации полимера.

На фиг.2 показана схема проверки эффективности модификации.

На фиг.3 показаны результаты иммобилизации олигонуклеотида методом, описанным F.Fixe [3].

На фиг.4-8 показаны результаты иммобилизации описываемым методом.

Условия модификации и иммобилизации приведены в примерах.

Перечень сокращений

РММА - полиметилметакрилат

ПЦР - полимеразная цепная реакция

Варианты осуществления изобретения

Способ получения ДНК-чипов с улучшенными характеристиками состоит из следующих этапов.

На первом этапе осуществляют выбор типа полимера, его форму, режимы модификации его поверхности. Затем проводят модификацию поверхности, по крайней мере, одного образца.

На втором этапе проводят диагностику качества проведенной модификации. С этой целью получают или приобретают олигонуклеотиды с концевой нуклеофильной группой. В соответствии с первым вариантом изобретения получают композицию, состоящую из олигонуклеотидов и конденсирующего агента, и наносят ее на поверхность модифицированного полимера для получения иммобилизованного зонда. В соответствии со вторым вариантом изобретения на поверхности модифицированной подложки получают активированные сложноэфирные группы, на которых иммобилизация модифицированных олигонуклеотидов протекает в отсутствие конденсирующего агента. Затем проводят гибридизацию иммобилизованного зонда с комплементарным олигонуклеотидом, содержащим биотиновую метку, с последующим нанесением на поверхность конъюгата стрептавадин-пероксидаза и визуализацией метки с помощью пероксидазной реакции окисления диаминобензидина. Сравнивают интенсивность окраски точек, нанесенных указанным способом, и точек, нанесенных известными методами. В случае неудовлетворительного результата, например из-за специфики применяемого полимера, проводят коррекцию условий модификации.

На третьем этапе проводят модификацию поверхности и формирование партии ДНК-чипов по первому или второму варианту иммобилизации олигонуклеотидного зонда.

Для получения более эффективной модификации поверхности важно выбрать баланс между глубиной проникновения модифицирующего агента, в качестве которого используют щелочь, и эффективностью формирования достаточного количества карбоксильных групп, полученных из сложноэфирных групп полимера.

Учитывая это обстоятельство, было предложено неочевидное техническое решение, которое позволяет обеспечить образование более развитой поверхности полимера за счет глубокого проникновения на первом этапе модифицирующего агента в жестких условиях воздействия на поверхность полимера и формирование в более мягких условиях на заключительном этапе модификации достаточного количества карбоксильных групп. При гидролизе сложноэфирных групп образуются карбоксильные группы, придающие поверхности полимера отрицательный заряд и гидрофильность. За счет этого неспецифическая сорбция молекул зонда на поверхности оказывается существенно ниже, чем в случае применения описанных выше известных методов, включающих получение аминированной поверхности. Снижение неспецифической сорбции позволяет сократить время отмывки чипа после гибридизации с нескольких десятков до 1-2 минут.

В качестве модифицирующего агента для гидролиза полимера используют, по крайней мере, один тип гидроксида металла, входящий в группу, состоящую из NaOH, КОН, Ва(ОН)₂, LiOH. В качестве полимера используют полиметилметакрилат или другой полимер, содержащий сложноэфирные группы. В качестве полимеров можно использовать полимеры, содержащие акриловые и/или метакриловые мономеры. К ним, в частности, относятся полиметилметакрилат, полиэтилметакрилат, полиметилакрилат, а также их сополимеры в комбинации друг с другом и с другими мономерами.

На первой стадии предварительной обработки поверхности полимера используют максимальное значение концентрации гидроксида металла от 15 до 20М и необязательно максимальную температуру модификации в диапазоне от 80 до 140°С, а на заключительной стадии используют минимальное значение выбранного диапазона концентрации гидроксида металла от 1 до 15М и необязательно минимальную температуру модификации в диапазоне от 15 до 80°С.

В качестве растворителя для щелочи используют воду или спирт, выбираемый из группы, состоящей из метилового, этилового, пропилового спирта, или композицию из водно-спиртовой смеси в соотношении вода:спирт в пределах от 1:20 до 20:1. Применение органических растворителей облегчает смачивание исходной гидрофобной поверхности полимера реагентом, что приводит к ускорению реакции.

Для сокращения времени обработки поверхности можно использовать растворы щелочей с концентрацией, превышающей растворимость при комнатной температуре. Для удобства можно применить кристаллогидраты щелочей различного состава, образующие при плавлении высококонцентрированные растворы до 20М. Например, на стадии предварительной обработки используют расплав кристаллогидрата гидроксида металла при температуре от 100 до 140°С в течение 10-200 секунд.

Температурные условия проведения модификации выбираются исходя из типа полимера, условий его получения и требуемых условий иммобилизации олигонуклеотидного зонда к поверхности полимера. Возможные варианты выбирают из: а) проведения модификации при постоянной температуре, выбранной из диапазона от 15 до 140°С, б) проведения модификации, при которых температура изменяется в выбранном диапазоне от максимального до минимального значения при переходе от первой стадии модификации ко второй. Выбранные границы изменения температур лежат в пределах основного диапазона от 15 до 140°С. Причем предпочтительно устанавливать верхнюю границу выбранного диапазона в пределах от 80 до 140°С, а нижнюю границу выбирать в пределах от 15 до 60°С. Временной период стадии предварительной обработки поверхности составляет от 10 сек до 5 мин, а временной период заключительной стадии модификации составляет от 30 мин до 12 часов. Применение на первом этапе модификации раствора гидроксида металла с концентрацией, превышающей его растворимость при комнатной температуре (18 моль/л для NaOH и КОН), позволяет сократить время проведения гидролиза до 10-20 секунд и получать удовлетворительные результаты иммобилизации даже в отсутствие второй стадии модификации.

Для иммобилизации олигонуклеотидных зондов на модифицированной поверхности полимера в рамках данного изобретения рассматривается два варианта, которые включают, но не ограничивают других вариантов иммобилизации зондов. В соответствии с первым вариантом предлагается использовать композицию, в состав которой входят олигонуклеотиды, модифицированные нуклеофильной группой, и раствор конденсирующего агента. В качестве 5' модифицирующих групп олигонуклеотидов используют нуклеофильные группы, входящие в набор амино-, гидрокси-, тио-, гидразо-, гидразино-, аминоокси-, в концентрации от 0.5 до 100 мкмоль/л.

В качестве конденсирующего агента предлагается использовать соединения, входящие в группу, состоящую из гидрохлорида диметиламинопропилэтилкарбодиимида,карбонилдиимидазола, мезитилсульфонилтетразола,мезитилсульфонилнитротриазола, триизопропилфенилтетразола, триизопропилфенилнитротриазола в концентрации от 1 до 200 ммоль/л.

Реакции активированной различными конденсирующими агентами карбоксильной группы с нуклеофильными соединениями являются известньми, однако возможность применения этого метода к карбоксильным группам, образующимся при гидролизе указанных полимеров, неочевидна вследствие стерических затруднений, возникающих вблизи карбоксильных групп, непосредственно связанных с объемными фрагментами полимерной цепи. Такие композиции позволяют формировать надежную связь с полимером, устойчивую в широком диапазоне рН среды (2-12) и температуры (до 100°С).

В соответствии со вторым вариантом на поверхности модифицированной подложки получают активированные сложноэфирные группы, способные реагировать с олигонуклеотидами, имеющими концевую нуклеофильную группу, без конденсирующего агента. Для этого на поверхность модифицированного полимера наносят раствор, по меньшей мере, одного реагента, образующего с карбоксильной группой активный сложный эфир, в присутствии конденсирующего агента. В перечень таких реагентов входят, но не ограничивают перечень: N-гидроксисукцинимид, пара-нитрофенол, пентафторфенол или N-гидроксибензотриазол. Допустимый диапазон концентраций - от 1 до 200 ммоль/л. Конденсирующий агент выбирают из группы, состоящей из гидрохлорида диметиламинопропилэтилкарбодиимида, карбонилдиимидазола, мезитиленсульфонилтетразола, мезитиленсульфонилнитротриазола, триизопропилфенилтетразола, триизопропилфенилнитротриазола. Допустимый диапазон концентраций - от 1 до 200 ммоль/л.

После отмывки избытка реагента наносят раствор олигонуклеотида, имеющего концевую нуклеофильную группу. В качестве модифицирующих групп олигонуклеотидов используют нуклеофильные группы, входящие в набор амино-, гидрокси-, тио-, гидразо-, гидразино-, аминоокси-, в концентрации от 0.5 до 100 мкмоль/л.

Проверку эффективности иммобилизации осуществляляют путем гибридизации иммобилизованного зонда с комплементарным олигонуклеотидом, содержащим биотиновую метку, с последующим нанесением на поверхность конъюгата стрептавадин-пероксидаза и визуализацией метки с помощью пероксидазной реакции окисления диаминобензидина (см. пример 12). Визуально сравнивая интенсивность окраски точек, нанесенных указанным способом, и точек, нанесенных методом, предложенным [3] F.Fixe (см фиг. 3), можно сделать вывод о правильности выбора условий.

Примеры, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Приведенные далее примеры предназначены лишь для подтверждения возможности осуществления изобретения и не ограничивают объем защиты изобретения.

В таблице 1 приведены примеры модификации поверхности полиметилметакрилата в различных условиях.

Примеры	Стадии модификации	Условия модификации
Тип гидроксида и концентрация М/л	Тип растворителя	Температура, °С	Время (мин, час)	Перечень фигур
Пример 1	1 стадия	2M NaOH	С	20°С	20 часов	4
Пример 2	1 стадия	10M NaOH	В	20°С	1 мин	5
2 стадия	2M NaOH	В	20°С	1 час
Пример 3	1 стадия	10M NaOH	В/С=2/1	20°С	1 мин	6
2 стадия	2M NaOH	В/С=4/1	20°С	1 час
Пример 4	1 стадия	10M NaOH	В/С=2/1	120°С	1 мин	7
2 стадия	2M NaOH	В/С=4/1	60°С	30 мин

Где: В - вода, С - этанол.

После обработки поверхность промывают дистиллированной водой в течение 5 минут.

Пример 5. Модификация образцов полиметилметакрилата с помощью расплава кристаллогидрата гидроксида металла.

Модификация образцов полиметилметакрилата проводилась действием расплава моногидрата гидроксида калия при температуре 140°С в течение 60 секунд. После обработки поверхность промывают дистиллированной водой в течение 5 минут. Результаты представлены на фиг.8.

Пример 6. Иммобилизация модифицированного олигонуклеотида на поверхности полимера.

Ниже приведен включающий, но не ограничивающий, пример нанесения аминомодифицированного олигонуклеотида. К раствору А, содержащиму 20 мкмоль/л аминомодифицированного олигонуклеотида в воде, приливают водный раствор Б, содержащий 0.2 моль/л гидрохлорида диметиламинопропилэтилкарбодиимида и 0.2 моль/л N-метилимидазола, рН 7.0 в объемном соотношении А:Б=1:1. Смесь наносили на поверхность модифицированного согласно примера 1 полимера с помощью игольчатого споттера (модель Xpress Lane). Объем капель составлял от 10 до 200 нл. Образец ДНК-чипа с нанесенным массивом капель инкубируют во влажной атмосфере 2 часа. Образец ДНК-чипа отмывают дистиллированной водой (2 раза по 2 минуты) и сушат в беспылевой атмосфере при комнатной температуре.

Пример 7. Иммобилизация модифицированного олигонуклеотида на поверхности полимера.

Нанесение аминомодифицированного олигонуклеотида осуществляют в соответствии с примером 6, где в качестве конденсирующего агента используют карбонилдиимидазол в концентрации 0.1 моль/л.

Пример 8. Иммобилизация модифицированного олигонуклеотида на поверхности полимера.

Нанесение модифицированного олигонуклеотида осуществляют в соответствии с примером 6, где в качестве модифицированного олигонуклеотида используют гидразомодифицированный олигонуклеотид в концентрации 20 мкмоль/л.

Пример 9. Получение активированной поверхности полиметилметакрилата. Поверхность модифицированного согласно примера 4 полимера обрабатывали раствором, содержащим 0.1 моль/л N-гидроксисукцинимида, 0.1 моль/л гидрохлорида диметиламинопропилэтилкарбодиимида и 0.1 моль/л N-метилимидазола, рН 7.0, в течение 2 часов, отмывали дистиллированной водой (2 раза по 2 минуты) и сушили на воздухе.

Пример 10. Иммобилизация аминомодифицированного олигонуклеотида на активированной поверхности полиметилметакрилата.

На поверхность активированного согласно примера 3 полимера наносили раствор аминомодифицированного олигонуклеотида с концентрацией 10 мкмоль/л с помощью игольчатого споттера, отмывали дистиллированной водой (3 раза по 2 минуты) и сушили на воздухе.

Пример 11. Гибридизация меченного биотином олигонуклеотида и визуализация нанесенных точек.

На поверхность ДНК-чипа, полученного согласно примеру 4, наносили смесь продуктов ПЦР, меченных биотином, в концентрации мкмоль/л в 5 мкл × SSC буфера следующего состава: 150 ммоль/л NaCl, 15 ммоль/л цитрата натрия, рН 7.0. Продукты ПЦР содержали последовательность, комплементарную последовательности иммобилизованного по примеру 2 олигонуклеотида. Проводили инкубацию во влажной атмосфере при 40°С в течение 1 часа, отмывали дистиллированной водой (2 раза по 2 минуты), наносили раствор конъюгата стрептавидин-пероксидаза в концентрации моль/л в буфере PBS следующего состава: 1.7 ммоль/л КН₂PO₄, 5.2 ммоль/л Na₂HPO₄, 150 ммоль/л NaCl, рН 7.4 и инкубировали во влажной атмосфере в течение 30 минут. Отмывку несвязавшегося конъюгата проводили буфером PBS в течение 2 минут, а затем раствором 0,5М NaCl, PBS в течение 10 минут. Для "проявления" нанесенных точек чип затем обрабатывали раствором 0.5М диметиламинобензидина, содержащим 0.1% пероксида водорода. При этом в тех местах, где был успешно иммобилизован олигонуклеотид, в течение нескольких минут появлялось коричневое окрашивание.

На фиг.4-8 приведены результаты гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе, полученном по вышеприведенной методике, для разных условий модификации поверхности полиметилметакрилата. Сигнал меньшей интенсивности и большей неравномерности окраски - на фиг. 4, соответствующий одностадийной обработке полимера спиртовой щелочью.

Приведенные результаты демонстрируют эффективность описанного метода иммобилизации олигонуклеотидов на полимерной поверхности.

Предлагаемый способ позволяет приготовлять ДНК-чипы различного формата как для научных исследований, так и для медицинских тестов, тестов для проверки качества продукции и т.д. Форма чипа может представлять собой плоский слайд, или на поверхности могут быть выполнены лунки с глубиной от 0.5 до 10 мм прямоугольной, круглой, овальной или другой формы. Причем модификация поверхности слайда может быть проведена как на всей поверхности, так и только в лунках. ДНК-чип может быть выполнен методом отливки или штамповки в форме плашки с числом лунок от 1 до 100. ДНК-чип может быть также изготовлен другими известными способами, используемыми при изготовлении плашек из других полимеров. Например, ДНК-чип формируют в виде пластиковых планшетов, гранул, оптических волокон.

Описанный способ модификации может быть также использован при приготовлении гранул, волокон для применения при изготовлении биосенсоров, медицинских приборов, диагностических наборов.

Способ обеспечивает прочное связывание олигонуклеотида с подложкой: промывание ДНК-чипов буфером 5×SSC в течение часа не приводит к заметному уменьшению интенсивности сигнала.

Промышленная применимость

Предлагаемый способ приготовления ДНК-чипов обладает простотой и воспроизводимостью, позволяет получать ДНК-чипы с заданной поверхностной плотностью иммобилизованных олигонуклеотидных зондов.

Литература

1. Buchardt, et al. Polymer modification. US Patent 5,077,344 December 31,1991.

2. Roger M.S. Methacrylate polymer coating composition modified with an alkylenimine. US Patent 3,290,416, Dec. 6, 1966.

3. F.Fixe, M.Dufva, P.Telleman and С.В.V.Christensen, Functionalization of poly(methyl methacrylate) (PMMA) as a substrate for DNA microarrays, Nucleic Acids Research, 2004, Vol.32, No.1.

4. Henry. A.C., Tutt J.J., Galloway. M., Davidson. Y.Y., McWhorter, C.S., Soper, S.A. and McCarley, R.L. (2000) Surface modification of poly(methyl methacrylate) used in the fabrication ofmicroanalytical devices. Anal. Chem., 72, 5331-5337.

5. Bulmus. V., Ayhan. H. and Piskin, E. (1997) Modified PMMA monosize microbeads for glucose oxidase immobilizatiоп. Chem. Eng. J., 65, 71-76.

6. Holmberg et al. Poly I: C covalently bonded to polymer for diagnostic purposes. US Patent 4,767,701, August 30, 1988.

7. Химическая Энциклопедия, том 2, с.287, M., "СЭ", 1990.

1. Способ получения ДНК-чипов, включающий модификацию поверхности полимера, содержащего сложноэфирные группы, с помощью раствора, содержащего щелочь, и нанесение на поверхность модифицированного полимера композиции, в состав которой входит олигонуклеотид, содержащий концевую нуклеофильную группу, отличающийся тем, что для модификации используют водный или водно-спиртовой раствор щелочи, модификацию поверхности полимера проводят в две стадии, причем на первой стадии поверхность полимера обрабатывают раствором с концентрацией щелочи от 15 до 20 М в течение периода времени от 10 с до 5 мин, а на второй стадии поверхность полимера обрабатывают раствором с меньшей концентрацией щелочи, которую выбирают равной от 1 до 15 М, в течение периода времени от 30 мин до 12 ч, температуру процесса модификации либо поддерживают постоянной в диапазоне от 15 до 140°С, либо снижают от верхней границы указанного диапазона до его нижней границы на второй стадии, смену стадий модификации осуществляют путем периодической, по крайней мере, однократной замены раствора в реакционном объеме, а в композицию, в состав которой входит олигонуклеотид, добавляют конденсирующий агент.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве полимера, содержащего сложноэфирные группы используют полиметилметакрилат.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве щелочи используют щелочь, выбранную из группы, состоящей из NaOH, КОН, Ba(OH)₂, LiOH.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что, когда используют водно-спиртовую смесь, спирт выбирают из группы, состоящей из метилового спирта, этилового спирта, пропилового спирта.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что используют водно-спиртовую смесь с содержанием воды и спирта от 1:20 до 20:1.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют олигонуклеотид, содержащий в качестве концевой нуклеофильной группы либо амино-, либо гидрокси-, либо тио-, либо гидразо-, либо гидразино-, либо аминооксигруппу.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют композицию, содержащую олигонуклеотид в концентрации от 0,5 до 100 мкмоль/л.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют конденсирующий агент, выбранный из группы, состоящей из: гидрохлорида диметиламинопропилэтилкарбодиимида, карбонилдиимидазола, мезитилсульфонилтетразола, мезитилсульфонилнитротриазола, триизопропилфенилтетразола, триизопропилфенилнитротриазола.

9. Способ по пп.1-8, отличающийся тем, что ДНК-чип формируют в виде слайдов, пластиковых планшетов, гранул, оптических волокон.

10. Способ получения ДНК-чипов, включающий модификацию поверхности полимера, содержащего сложноэфирные группы, с помощью раствора, содержащего щелочь, и нанесение на поверхность модифицированного полимера композиции, в состав которой входит олигонуклеотид, содержащий концевую нуклеофильную группу, отличающийся тем, что используют водный или водно-спиртовой раствор щелочи, модификацию поверхности полимера проводят в две стадии, причем на первой стадии поверхность полимера обрабатывают раствором с концентрацией щелочи от 15 до 20 М в течение периода времени от 10 с до 5 мин, а на второй стадии поверхность полимера обрабатывают раствором с меньшей концентрацией щелочи, которую выбирают равной от 1 до 15 М, в течение периода времени от 30 мин до 12 ч, а затем на поверхности модифицированного полимера получают активированные сложноэфирные группы, температуру процесса модификации либо поддерживают постоянной в диапазоне от 15 до 140°С, либо снижают от верхней границы указанного диапазона до его нижней границы на второй стадии, смену стадий модификации осуществляют путем периодической, по крайней мере, однократной замены раствора в реакционном объеме.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что в качестве полимера, содержащего сложноэфирные группы, используют полиметилметакрилат.

12. Способ по п.10, отличающийся тем, что в качестве щелочи используют щелочь, выбранную из группы, состоящей из NaOH, КОН, Ba(OH)₂, LiOH.

13. Способ по п.10, отличающийся тем, что используют водно-спиртовую смесь, спирт выбирают из группы, состоящей из метилового спирта, этилового спирта, пропилового спирта.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что используют водно-спиртовую смесь с содержанием воды и спирта от 1:20 до 20:1.

15. Способ по п.10, отличающийся тем, что используют олигонуклеотид, содержащий в качестве концевой нуклеофильной группы либо амино-, либо гидрокси-, либо тио-, либо гидразо-, либо гидразино-, либо аминооксигруппу.

16. Способ по п.10, отличающийся тем, что используют композицию, содержащую олигонуклеотид в концентрации от 0,5 до 100 мкмоль/л.

17. Способ по п.10, отличающийся тем, что для формирования активированных сложноэфирных групп применяют реагент, входящий в группу, которая состоит из N-гидроксисукцинимида, паранитрофенола, пентафторфенола, N-гидроксибензотриазола, и, по крайней мере, один конденсирующий агент, выбирают из группы, состоящей из гидрохлорида диметиламинопропилэтилкарбодиимида, карбонилдиимидазола, мезитиленсульфонилтетразола, мезитиленсульфонилнитротриазола, триизопропилфенилтетразола, триизопропилфенилнитротриазола.

18. Способ по пп.10-17, отличающийся тем, что ДНК-чип формируют в виде слайдов, пластиковых планшетов, гранул, оптических волокон.