Пара синтетических олигонуклеотидов-праймеров, используемых для выявления днк провируса лейкоза кошек эндогенного и экзогенного типа, и условия полимеразной цепной реакции с их использованием

Авторы патента:

Владельцы патента RU 2317329:

Федосов Дмитрий Валериевич (RU)
Золототрубов Алексей Петрович (RU)

Изобретение относится к генной инженерии. Пара синтетических олигонуклеотидов-праймеров, используемых для выявления ДНК провируса лейкоза кошек эндогенного и экзогенного типа и имеющих следующие последовательности: 5'TGTCTGATGT CTGGAGCC-3', 3'TTTGGCCCAT GACGGCTT-5'. Также раскрыт способ осуществления полимеразной цепной реакции с использованием указанной пары синтетических олигонуклеотидов-праймеров. Изобретение позволяет усовершенствовать существующие способы диагностики лейкоза кошек и может быть использовано в ветеринарии. 2 н.п. ф-лы.

Изобретение относится к генной инженерии, касается синтетических олигонуклеотидов-праймеров и способов выявления вируса лейкоза кошек (FeL V). Более конкретно, отличительной особенностью настоящего изобретения являются композиции и способы детектирования вируса лейкоза кошек (FeL V).

Лейкоз кошек является передаваемым заболеванием, которое вызывается онкогенным онкорнавирусом, относящемуся к ретровирусам. Онкорнавирусы кошек можно разделить на эндогенные и экзогенные. Эндогенные вирусы (штаммы ССС и RD 114) выделяются из клеток либо спонтанно, либо под действием различных индукторов передаются вертикально, неонкогенны, сенотропны. В геноме нормальных клеток содержится более 100 копий генома этих вирусов. По данным молекулярной гибридизации, вирусы RD 114 и ССС очень сходны.

Экзогенные онкорнавирусы (вирус лейкоза кошек и вирус саркомы кошек) экотропны, передаются горизонтально, высокоонкогенны.

Вирус лейкоза кошек (FeL V) W. Sarrett (Шотландия) в 1964 г. в группе кошек с развивающейся лимфосаркомой /1/.

Весьма существенная необходимость в чувствительных специфических методах скрининга и идентификации носителей и зараженных вирусом лейкоза кошек (FeL V) животных для контроля распространения вируса в популяции кошек. Распространенность вируса в популяции: бродячие кошки - 1%, в домах, где имеется только одна кошка - 1%, где более одного животного - 27% /1/.

Информация, содержащаяся в рассматриваемой заявке, предполагает наличие нескольких генотипов вируса лейкоза. То есть генетическая информация относительно вирусов может быть полностью идентичной для всех типов вируса, но охватывает группы с отличающейся генетической информацией.

Геном вируса лейкоза кошек состоит из двуспиральной положительной РНК. Полипротеин содержит в направлении от аминоконца и карбоксиконцу нуклеокапсидный протеин (gp 80), протеины оболочки (gp 70 и р15) и неструктурные протеины (НП) (протеаза, ревертаза, эндонуклеаза).

Ряд штаммов вируса лейкоза кошек и изоляторов был идентифицирован. К ним были разработаны специфические праймеры для определения вируса. При сравнении с последовательностью праймеров, полученных для определения FeL V штамм Rickard (pFRA) /2/ и эндогенного провируса FeL V штамм CFE6 /3/, первые основываются на выделении env-участка, вторые - на выделении pol-участка.

Таким образом, ранее разработанные праймеры могут использоваться для определения только одного из типов вируса, либо эндогенного, либо экзогенного.

Технический результат - определение как эндогенного, так и экзогенного типа вируса лейкоза кошек, повышение эффективности диагностики заболевания.

Технический результат достигается следующим образом.

Были подобраны синтетические олигонуклеотиды (праймеры) следующего состава:

5'TGTCTGATGT CTGGAGCC-3'

3'TTTGGCCCAT GACGGCTT-5'

Рассчитанная длина продукта ПЦР для данных праймеров составяет 238 п.н. Последовательность, приведенная в данной заявке, соответствует gag-pol-участку вирусного генома (началу gp 80 и р15) экзогенного вируса и клона CFE6 эндогенного вируса.

Реакцию проводили в следующем режиме:

40 циклов: денатурация при 95°С в течение 0.5 мин, отжиг при 53°С в течение 0.5 мин, синтез при 72°С в течение 0.5 мин.

Инкубационная смесь конечным объемом 20 мкл содержала:

10 mM Трис-HCl, рН 9.0;

50 mM KCl;

2 mM MgCl₂;

0.1% тритон Х-100;

10 mM dNTP;

2 мкл праймеров;

10 мкл ДНК-матрицы. В качестве ДНК-матрицы использовали геномную ДНК, полученную из крови и органов кошек. ДНК выделяли с помощью набора ДНК-сорб Б для цельной крови и тканей (ЦНИИ Эпидемиологии, Москва).

0.5-1 ед. ДНК-полимеразы Taq.

Поверх смеси наслаивали 40 мкл минерального масла.

В настоящем изобретении предложены такие праймеры и способы их использования, которые соответствуют последовательностям вирусного генома и определяют описанные здесь генотипы. Праймеры настоящего изобретения образуют продукты гибридизации с нуклеиновыми кислотами, соответствующими различным генотипам вируса лейкоза кошек. Вирус лейкоза кошек имеет, по крайней мере, два генотипа, соотносящихся к экзогенному и эндогенному вирусу. Экзогенный вирус подразделяется на три типа (А, В, С), различающиеся по антигенным свойствам.

Отличительной чертой настоящего изобретения являются праймеры, содержащие нуклеиновые кислоты с последовательностями, соответствующими двум последовательностям, которые представляют генотип FeL V (экзогенному и эндогенному вирусу).

Праймеры изготавливаются по известной последовательности при помощи автоматического синтезатора олигонуклеотидов. Чистота праймеров контролируется методом ВГЖХ и составляет не менее 95%.

Праймеры хранятся при -20°С не более 6 месяцев. В течение срока хранения праймеры сохраняют высокую активность и могут применяться в указанных концентрациях.

Отличительной чертой настоящего изобретения является способ получения продукта полимеразной цепной реакции с нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, соответствующую вирусу лейкоза кошек нуклеиновой кислоте. Способ включает стадию помещения специфических праймеров, соответствующих вирусу лейкоза кошек нуклеиновой кислоте, в условия, в которых может происходить амплификация. Праймеры способны образовывать продукт амплификации с вирусом лейкоза кошек нуклеиновой кислотой в условиях полимеразной цепной реакции. Этот способ включает далее стадию создания условий амплификации для образования продукта в присутствии нуклеиновой кислоты, соответствующей участку генома вирусу лейкоза кошек.

Образование продукта амплификации можно использовать для детектирования наличия генома вирусу лейкоза кошек. Предпочтительно, праймеры образуют продукт гибридизации с нуклеиновой кислотой вируса лейкоза кошек в gag-pol-участке вирусного генома (началу gp 80 и р 15) экзогенного вируса и эндогенного вируса. В результате ПЦР-концентрация этого участка многократно увеличивается. Определение продукта реакции (амплификона) производится путем очистки продукта от не вступивших в реакцию праймеров и ферментов, присутствующих в реакционной смеси, в геле легкоплавкой агарозы и окраски специфическими красителями. Образовавшийся продукт реакции соответствует началу gag-pol-участка вирусного генома, длина участка составляет 238 п.н. Продукт амплификации нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность, соответствующую последовательности в геноме вируса лейкоза кошек, можно использовать в качестве олигонуклеотидных зондов для гибридизации при определении наличия генома вируса. Для этого в реакционную смесь добавляются меченные дНТФ либо меченные праймеры.

Опыты по проверке эффективности праймеров проходили на базе лаборатории молекулярно-генетической диагностики, ЗАО НПП "Агрофарм", Воронеж, Россия.

Исследования проводились на кошках, подозрительных по заболеванию вирусным лейкозом. Диагноз ставился комплексно и подтверждался результатами клинических, гематологических, биохимических и гистологических исследований, выполненных в профильных лабораториях ЗАО НПП "Агрофарм".

Заявляемое техническое решение характеризуется примерами.

Пример 1. Для установки диагноза были проведены исследования с использованием заявляемых праймеров и известными способами. У подозрительных по заболеванию животных осуществляли взятие крови, которую стабилизировали официнальным (5000 Е/мл) раствором гепарина и исследовали в ПЦР с применением указанных праймеров. Нами было обследовано 60 кошек с подозрением на вирусный лейкоз. При клиническом осмотре регистрировали признаки хронической почечной недостаточности (полидипсия, полиурия и др.) различной степени тяжести, анемию, хронические раневые абсцессы, асцит, увеличение печени и почек, кахексию. При исследовании крови биохимическими и морфологическими методами было обнаружено: снижение уровня гемоглобина до 24,0 г/л, повышение СОЭ до 92 мм/ч, лейкопения до 1,5·10⁹%, лимфоцитоз до 99%, в мазках периферической крови количество митотических клеток достигало 4% (при норме до 0,4%), выраженная азотемия (повышение концентрации мочевины до 54 мМ/л, креатинина до 690 мкМ/л), увеличение активности аминотрансфераз (АлАТ до 240 Е/л, АсАТ до 150 Е/л), щелочной фосфатазы до 708 Е/л, снижение концентрации альбумина до 7,5 г/л, увеличение концентрации холестерола до 12 мМ/л по отношению к стандартным физиологическим показателям. При исследовании мочи обнаружено снижение плотности до 1,005 г/л, увеличение концентрации белка до 3 г/л, в некоторых случаях отмечался сдвиг рН мочи в щелочную сторону, а также обнаруживалась глюкоза и желчные кислоты.

У одного из павших животных проводилось гистологическое исследование внутренних органов. Обнаружены неопластические изменения почек (недифференцированный рак) и некроз печени.

В результате исследования 60-ти кошек диагноз - вирусный лейкоз - был поставлен в 35 случаях, при 100% подтверждении гематологическими, биохимическими и гистологическими методами.

Пример 2. Для определения специфичности пары праймеров были проведены ПЦР-реакции, в которых в качестве ДНК-матрицы были использованы пробы крови коров, больных лейкозом (диагноз подтвержден с помощью ПЦР), и крови собак, больных лейкозом и раком молочной железы (диагноз подтвержден морфологически). В результате проведенного исследования выяснилось, что праймеры специфичны только для вируса лейкоза кошек и не вступают в реакцию с ДНК родственных видов вирусов.

Таким образом, разработанный молекулярно-генетический метод идентификации вируса лейкоза кошек с использованием патентуемых праймеров для проведения ПЦР обеспечивает раннюю диагностику заболевания и выявление носителей вируса. Выбранные уникальные олигонуклеотиды не дают перекрестных реакций с родственными видами, специфичны для кошачьих, позволяют, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения реакции, быстро и надежно определять наличие или отсутствие ДНК провируса вируса лейкоза кошек эндогенного и экзогенного типа. Данная цель достигается путем ранней диагностики заболевания с использованием заявляемого изобретения, так как полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить присутствие вируса уже через 5-10 дней после инфицирования. Применение праймеров для определения вируса лейкоза кошек позволяет обнаружить как экзогенный, так и эндогенный вирус (провирус), тогда как с помощью серологических методов антитела к вирусу определяются намного позже (через 2 месяца), при этом определяется только экзогенный вирус, возможны неточные результаты из-за антигенного различия типов экзогенного вируса.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. М., ВНИТИБП, 1998, С.372-376.

2. Roy-Burman P. et al. Pathogenicity Induced by Feline Leukemia Vims, Rickard Strain, Subgroup A Plasmid DNA (pFRA). J. Virol. 1998; V.72, N.9: 7048-7056.

3. Roy-Burman P. et al. Structure and function of endogenous feline leukemia virus long terminal repeats and adjoining regions. J. Virol. 1988; 62 (10), 3631-3641.

1. Пара синтетических олигонуклеотидов-праймеров, используемых для выявления ДНК провируса лейкоза кошек эндогенного и экзогенного типа и имеющих следующие последовательности:

5'TGTCTGATGTCTGGAGCC-3'

3' TTTGGCCCATGACGGCTT-5'

2. Способ осуществления полимеразной цепной реакции с использованием указанной пары синтетических олигонуклеотидов-праймеров по п.1, при котором готовится инкубационная смесь конечным объемом 20 мкл в составе:

Трис-HCl, рН 9.0	10 mM
KCl	50 mM
MgCl₂	2 mM
тритон Х-100	0.1%
dNTP	10 mM
олигонуклеотидов-праймеров по п.1	2 мкл
ДНК-полимеразы Taq	0.5-1 ед

поверх смеси наслаивают 40 мкл минерального масла; затем под масло вносят ДНК-матрицу - 10 мкл; проводят 40 циклов реакции со следующими температурными режимами: денатурация при 95°С в течение 0.5 мин, отжиг при 53°С в течение 0.5 мин, синтез при 72°С в течение 0.5 мин.

Изобретение относится к области генной инженерии, вирусологии и ветеринарии. .

Вакцина свиней против респираторных патологий и патологий репродукции свиней // 2305559

Изобретение относится к области вирусологии. .

Рекомбинантная плазмида pci-neo-odc-nsp1 и ее варианты pci-neo-odc-e2-l и pci-neo-odc-e2-m, кодирующие белки вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей и белок орнитиндекарбоксилазы, предназначенные для разработки средств профилактики вирусных инфекционных заболеваний (на примере вируса вэл) // 2280691

Изобретение относится к области молекулярной биологии. .

Генетически модифицированный, покрытый мембраной вирусный вектор // 2218403

Изобретение относится к генной инженерии вирусов. .

Химерные флавивирусные вакцины // 2209082

Изобретение относится к медицине и касается химерного живого инфекционного аттенуированного вируса, который применяется для создания химерных флавивирусных вакцин.

Рекомбинантная плазмидная днк p31nc, кодирующая 125 аминокислотный нуклеокапсидный белок вируса репродуктивно- респираторного синдрома свиней и обеспечивающая его экспрессию в клетках бактерий e.coli // 2205218

Изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии и может быть использовано в диагностике заболеваний свиней. .

Рекомбинантная плазмидная днк pad5-f, несущая фрагмент генома аденовируса 5 типа с делецией в гене e1b-55k, и штамм мутантного аденовируса ade12, обладающий селективной противоопухолевой активностью // 2194755

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, в частности к генной инженерии. .

Неинфекционный мутированный вирус синдбис e1-ser62 и днк, кодирующая его // 2194754

Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано при производстве вакцин. .

Способ выявления вируса болезни ауески сельскохозяйственных животных // 2180115

Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для выявления заболеваний сельскохозяйственных животных, а именно: болезни Ауески.

Штамм коровьего вируса герпеса типа 1 (внv-1) сncm №1-1213, вакцина, диагностический серологический реактив, способ вакцинации, способ серологического отличия // 2170254

Изобретение относится к области вакцинации и диагностики заболеваний К. .

Вектор, обеспечивающий экспрессию антигена вируса sars на поверхности клеток, и микроорганизмы, трансформированные этим вектором // 2332457

Изобретение относится к биотехнологии

Оптимизированная экспрессия hpv 58 l1 в дрожжах // 2370538

Изобретение относится к области генетической инженерии и вирусологии

Состав полиэпитопного белка для индукции иммунного ответа против вируса ящура // 2453557

Синтетические олигонуклеотидные праймеры, способ выявления и дифференциации штаммов вируса лихорадки долины рифт на основе полимеразной цепной реакции и рестрикционного анализа // 2457255

Изобретение относится к области биотехнологии

Штамм клеток e.coli bl21(de3)plyss, клон ptt9/asfvp30, содержащий рекомбинантную плазмиду со встройкой участка гена ср204l вируса африканской чумы свиней, кодирующего конформационный эпитоп белка p30, для изготовления диагностических препаратов // 2463343

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной вирусологии

Иммуногенные композиции и способы // 2468034

Выделенная полинуклеотидная молекула, кодирующая вирус torque teno, молекула рнк и вектор экспрессии // 2502801

Представленная группа изобретений относится к области биотехнологии и касается новых нуклеотидных последовательностей вируса Torque teno (TTV) и векторов, содержащих такие последовательности. Выделенная полинуклеотидная молекула, содержит полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO:4, последовательности, комплементарной SEQ ID NO:4 и полинуклеотида, который является, по меньшей мере, на 95% идентичным SEQ ID NO:4. Представленные изобретения могут быть использованы при получении вакцин для предупреждения заболеваний свиней и других животных, вызванных вирусом Torque teno. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл., 10 пр.

Полинуклеотиды и полипептиды фага φ-mru, и их применение // 2520738

Изобретение относится к области биохимии, в частности к полипептидам, которые являются ингибиторами клетки метанопродуцента и биологическими маркерами для детекции фага φmru, а также к полинуклеотидам, которые кодируют эти полипептиды. Раскрыты векторы экспрессии и клонирующие векторы, содержащие эти полинуклеотиды, и клетки-хозяева, содержащие эти векторы. Описаны конъгированные или слитые молекулы, которые являются ингибиторами клетки метанопродуцента и биологическими маркерами для детекции фага φmru, а также антитела, которые связываются с вышеуказанными полипептидами. Также раскрыт фаг φmru, выделенный с использованием описанных полипептидов. Изобретение также охватывает фармацевтические композиции и способы ингибирования клетки-метанопродуцента, с использованием описанных полипептидов, конъюгированных или слитых молекул. Использование изобретения позволяет лизировать клетки метанопродуцентов, обитающих в рубце жвачных животных, и/или доставлять ингибиторы клеток метанопродуцентов. 18 н. и 6 з.п. ф-лы, 8 ил., 6 пр.

Бактериофаг, обладающий активностью против pseudomonas aeruginosa, белки бактериофага и способы их применения // 2580248

Настоящее изобретение относится к области бактериофаговой терапии для лечения и регулирования бактериальных инфекций. Представленная группа изобретений касается выделенного бактериофага, обладающего активностью против Pseudomonas aeruginosa, белков, кодируемых геномом такого бактериофага, фармацевтической композиции, содержащей такие белки, применяющейся для изготовления лекарственного средства для лечения инфекции, обусловленной Pseudomonas aeruginosa, способа диагностики бактериальной инфекции, вызванной Pseudomonas aeruginosa, и способа уменьшения или ингибирования колонизации или роста Pseudomonas aeruginosa на твердой поверхности. Представленная группа может быть использована в больницах для избирательного лечения инфекций, обусловленных Pseudomonas aeruginosa, не оказывая при этом влияния на нормальную окружающую флору. 12 н. и 18 з.п. ф-лы, 228 ил., 1 табл., 8 пр.

Мицелиальные грибы, имеющие фенотип измененной вязкости // 2608639

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой клетку-хозяина мицелиального гриба, полученную из родительской клетки, для получения белка, представляющего интерес, где клетка-хозяин включает генетическое изменение в гене Sfb3, которое приводит к продуцированию в клетке уменьшенного количества функционального белка Sfb3 по сравнению с родительскими клетками или его отсутствию, где клетка-хозяин продуцирует, в ходе аэробной ферментации в погруженной культуре, клеточный бульон, который (i) требует сниженного количества перемешиваний для поддержания предварительно выбранного содержания растворенного кислорода по сравнению с родительскими клетками и (ii) поддерживает содержание растворенного кислорода при предварительно выбранном количестве перемешиваний по сравнению с родительскими клетками. Изобретение позволяет уменьшить количество перемешиваний при культивировании клеток, тем самым упростить процесс получения белка, представляющего интерес. 3 н. и 24 з.п. ф-лы, 14 ил., 6 табл., 4 пр.