Способ определения генетического потенциала крупного рогатого скота по качеству молока

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и селекции сельскохозяйственных животных. Генетический потенциал КРС оценивают путем ДНК-тестирования (ПЦР-ПДРФ метод) генотипов животных по RsaI-маркеру гена пролактина и AluI-маркеру гена гормона роста и выявлении сопряженных генотипов по локусам пролактина и гормона роста, определяющих повышенное или пониженное содержание жира и белка в молоке, согласно разработанному перечню генотипов. Способ позволяет проводить ранний отбор перспективных телок для молочного животноводства и принимать решение о целесообразности использования быков-производителей до появления у них лактирующего потомства, а также осуществлять подбор пар в селекционной работе по улучшению молочных пород. 6 табл.

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к способу определения генетического потенциала крупного рогатого скота (КРС) по содержанию (в %) жира и белка в молоке с целью раннего отбора телок для молочного животноводства и решения вопроса о целесообразности использования быков-производителей до появления у них лактирующего потомства, а также для подбора пар в селекционной работе по улучшению молочных пород.

Известен способ отбора телок с желательным содержанием белка и жира в молоке будущих лактации по родословным, общему развитию и экстерьеру, отбора быков-производителей - по показателям молочной продуктивности дочерей. Однако эти традиционные методы отбора животных малоэффективны, связаны с большими временными затратами и материальными издержками.

Развитие молекулярно-генетических методов анализа, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволило разработать новые маркерные системы, обеспечивающие определение генотипов животных непосредственно на уровне генетического материала клетки (на уровне ДНК) независимо от пола и возраста, сократить время анализа и повысить его точность.

Известен также способ оценки генетического потенциала коров на жирномолочность на основе анализа ДНК-полиморфизма гена гормона роста (MspI-полиморфизм). Однако корреляция MspI(-)-аллеля с жирномолочностью носит противоречивый характер: по данным одних авторов MspI(-)-аллель коррелирует с высоким содержанием жира в молоке [Falaki M., Gengler N., Prandi A. et al. Relationships of polymorphism for growth hormon and growth hormone reseptor genes with milk production for Italian Holstein-Friesian bulls // Journal of Dairy Science. 1993. V.76, p.149], по данным других авторов - с низким [Yao J., Aggerey S.E., Zadworny D. et al. Sequence variations in the bovine gene characterized by single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis and their association with milk production traits in Holsteins // Genetics. 1996. V.144. p.1809-1816], что не позволяет рассматривать предложенный маркер как надежный маркер жирномолочности у КРС. Такая же противоречивая картина наблюдается и при использовании в качестве способа определения генетически обусловленного уровня белка и жира в молоке коров на основе Rsal-полиморфизма гена пролактина и AluI-полиморфизма гена гормона роста [Chrenek P., Huba J., Hetenyi L., Peskovieova D., Bulla J. Genotypes of bGH and bPRL genes in relationships to milk production // Proceedings of the 50^th Annual Meeting of the EAAP. Zuerich. Book of Abstracts. 1999, p.40; Dybus A. Assaciations of growth hormone (GH) and prolactin (PRL) genes polymorphisms with milk production traits in Plish Black-and-White cattle // Animal Skiense Papers and Reports. 2002. V.20. N.4, p.203-212].

Более перспективны способы оценки генетического потенциала коров по показателям молочной продуктивности, учитывающие совместное влияние двух или нескольких генов, участвующих в формировании признака молочной продуктивности.

В качестве прототипа выбран способ определения животных с улучшенными показателями молочной продуктивности на основе анализа полиморфизма генов транскрипционного фактора Pit-1 и каппа-казеина. Выявлены генотипы, обеспечивающие повышенный уровень удойности, содержания жира и белка в молоке, по отдельным локусам: генотипы ТТ и АА по гену Pit-1 и генотип ВВ по гену каппа-казеина, а также сопряженные генотипы по двум локусам: ТТВВ и ААВВ [WO 2003076657, 18.09.2003 Renaville, Robert et al. Method for identifying animals for milk production qualities by analysing the polymorphism of the Pit-1 and kappa-casein genes]. Однако в патенте не представлены данные по продуктивности групп животных с гетерозиготными генотипами, не приведены абсолютные значения параметров продуктивности для групп животных с гомозиготными генотипами (данные представлены только в виде относительных величин, как разница в продуктивности между группами гомозиготных животных). В патенте не даны также оценки достоверности различий между показателями молочной продуктивности у животных с хозяйственно-ценными гомозиготными генотипами и остальными группами животных. Все вышеперечисленное не позволяет оценить диагностическую ценность предложенной маркерной системы. Кроме того, маркерные гены (каппа-казеин и транскрипционный фактор гормона роста Р/М) не относятся к одной метаболической цепи, что не исключает случайный характер выявленной авторами взаимосвязи этих генов и ставит под сомнение обоснованность рассмотрения их генотипов как сопряженных.

Задача изобретения - создание эффективного способа определения генетического потенциала по параметрам молочной продуктивности КРС (содержание жира и белка) для раннего выявления перспективных животных в молочном животноводстве и племенной работе, значительно сокращающего временные и экономические затраты.

Сущность изобретения - способ определения генетического потенциала КРС по уровню содержания жира и белка в молоке с использованием тест-системы, основанной на RsaI-изменчивости экзона III гена гормона роста и AluI-изменчивости экзона V гена пролактина, и выявлении сопряженных генотипов, ассоциированных с указанными параметрами молочной продуктивности. Использование в предлагаемом способе генов пролактина и гормона роста, участвующих в одной метаболической системе, а именно в формировании молочной продуктивности, более адекватно по сравнению с прототипом отражает существующие ассоциации с параметрами молочной продуктивности КРС.

RsaI-рестрикционный полиморфизм в экзоне III гена пролактина (bPRL) обусловлен молчащей A-G транзицией, возникающей в 103 кодоне аминокислоты и приводящей к появлению полиморфного RsaI-сайта. Рестрикционный AluI-полиморфизм в экзоне V гена гормона роста (bGH) обусловлен трансверсией C-G, что приводит к аминокислотной замене в позиции 127 (2141 нуклеотидная позиция) аминокислоты лейцин на аминокислоту валин (Leu на Val, кодон CTG на кодон GTG) в белковом продукте и исчезновению AluI-сайта (AG|CT) в нуклеотидной последовательности гена. Аминокислота лейцин соответствует AluI(+) (аллель L), а валин - AluI(-) (аллель V).

Способ основан на ПЦР с последующим рестрикционным анализом продуктов амплификации (метод ПЦР-ПДРФ) и включает в себя выделение ДНК, амплификацию фрагмента экзона III гена пролактина и фрагмента экзона V гена гормона роста с использованием специфичных праймеров, рестрикционный анализ полученных ампликонов RsaI- и AluI-эндонуклеазами, соответственно, установление генотипов по каждому гену с последующим выявлением сопряженных генотипов по обоим генам. Полученные сопряженные генотипы сравнивают с перечнем установленных генотипов, обуславливающих повышенное (или пониженное) содержание жира и белка в молоке (табл.1).

Таблица 1.
Перечень генотипов, обуславливающих повышенное или пониженное содержание жира и белка в молоке коров.
Генотипы, определяющие повышенное или пониженное содержание жира в молоке	Генотипы, определяющие повышенное или пониженное содержание белка в молоке
повышенное	пониженное	повышенное	пониженное
		aaVV	aaLL
abVV	abLL	abLL	abVV
bbVL	bbVV	bbLL	bbVV
Примечания: а и b - аллели гена пролактина, RsaI(+) и RsaI(-) соответственно;
V и L - аллели гена гормона роста, AluI(-) и AluI(+) соответственно;

Способ осуществляют следующим образом.

1. Выделяют ДНК из образцов крови (200 мкл) животного с применением набора реагентов DIAtom^TM DNA Prep (фирма "Биоком", Москва) или любым другим стандартным методом. Возможно использование других тканей или клеток животного (луковицы волос, сперма и др.).

2. Амплификацию фрагмента (156 п.н.) экзона III гена bPRL проводят с использованием праймеров PRL-1 (5'-CGAGTCCTTATGAGCTTGATTCTT-3') и PRL-2 (5'-GCCTTCCAGAAGTCGTTTGTTTTC-3') [Mitra A., Schlee P., Balakrishnan C.R., Pirshner F. Polymofphisms at growth hormone and prolactin loci in Indian cattle and buffalo // Journal of Animal Breeding and genetics. 1995. V.112, p.71-74] в следующем режиме: предварительная денатурация при 94°С - 4 мин; 35 циклов по схеме: денатурация при 94°С - 30 с, отжиг при 58°С - 30 с, синтез 72°С - 30 с; заключительный синтез при 72°С - 7 мин.

Амплификацию фрагмента (223 нуклеотида) гена bGH проводят с использованием праймеров Р1: 5'-GCTGCTCCTGAGGGCCCTTCG-3' и Р2: 5'-GCGGCGGCACTTCATGACCCT-3' в следующем режиме: предварительная денатурация при 94°С - 4 мин, 30 циклов: 94°С - 45 с, 67°С - 45 с, 72°С - 45 с; заключительный синтез при 72°С - 7 мин [Mattos K.K., Lama S.N.D., Martinez M.L.M., Freitas A.F. Association of bGH and Pit-1 gene variants with milk production traits in dairy Gyr bulls // Pesq. agropec. bras. 2004. V.39. № 2, p.147-150; Хатами С.Р., Лазебный О.Е., Максименко В.Ф., Сулимова Г.Е. ДНК-полиморфизм генов гормона роста и пролактина у ярославского и черно-пестрого скота в связи с молочной продуктивностью // Генетика. 2005. Т.41. N 2, с.229-236].

Размер полученных фрагментов определяют методом электрофореза в 2% агарозном геле.

3. Проводят рестрикцию амплифицированного фрагмента экзона III гена bPRL эндонуклеазой рестрикции RsaI, а фрагмента гена bGH - рестриктазой AluI в стандартных условиях.

4. Размер полученных рестрикционных фрагментов определяют методом электрофореза в 6%-ном полиакриламидном геле.

5. Определяют генотипы по каждому гену (согласно табл.2) и затем сопряженные генотипы по обоим генам, возможные варианты которых приведены в табл.3.

Таблица 2.
Генотипирование особей по результатам электрофореза отдельно по каждому гену
Размеры фрагментов (п.н.)	ПЦР-RsaI генотипы экзона III гена пролактина
	аа	ab	bb
	156	156 82 74	82 74
	ПЦР-AluI генотипы экзона V гена bGH
	VV	VL	LL
223	223 171 52	171 52

Таблица 3.
Перечень возможных сопряженных генотипов по локусам пролактина и гормона роста*
aa VV	ab VV	bb VV
aa VL	ab VL	bb VL
aa LL	ab LL	bb LL

6. Сравнивают выявленные у животных сопряженные генотипы с генотипами, определяющими повышенное или пониженное содержание жира и белка в молоке (согласно табл.1).

7. Принимают решение о целесообразности использования животного с данным сопряженным генотипом в молочном производстве и селекционной работе.

Пример 1. Данным способом был проведен анализ коров Ярославской породы (113 особей из хозяйств "Михайловское" и "Горшиха" Ярославской области). Определены генотипы животных по отдельным локусам (пролактина и гормона роста) и сопряженные генотипы по обоим локусам.

Методом двухфакторного дисперсионного анализа оценено влияние генов пролактина (RsaI-маркер) и гормона роста (AluI-маркер), а также их совместное влияние (RsaI*AluI) на параметры молочной продуктивности ярославского скота (табл.4).

Значение уровня достоверности указывает на наличие или отсутствие влияния исследуемых факторов (в данном случае генотипов по отдельным локусам и сопряженных генотипов) на параметры молочной продуктивности. Достоверные значения (выделены в табл.4 жирным шрифтом) получены при оценке влияния на содержание белка и жира в молоке только для сопряженных генотипов. По генотипам отдельно рассматриваемых генов достоверной зависимости не выявлено. Не было выявлено также влияния генотипов по отдельным исследуемым локусам и их сопряженным генотипам на удойность ярославского скота. В связи с этим в дальнейших расчетах рассматривалось только влияние определенных сопряженных генотипов на содержание (в %) белка и жира в молоке коров.

Сравнительный анализ параметров молочной продуктивности исследованных животных с различными сопряженными генотипами показал достоверные различия по содержанию жира (%) в молоке между животными с генотипами 1 и 2 (см. табл.5) и группой животных с генотипами 3 и 4, а по содержанию белка (%) - между животными с сопряженными генотипами, обозначенными в таблице цифрами 1*, 2*, З* и группой генотипов 4*, 5*, 6*. На основе полученных результатов были установлены группы генотипов с повышенными и пониженными показателями исследованных признаков, достоверно отличающиеся друг от друга (табл.5).

Таблица 5.
Достоверность различий между генотипом, определяющим повышенное значение признака продуктивности (жира и белка в %) и группой генотипов, определяющей их пониженное содержание
Генотипы, определяющие повышенное или пониженное содержание жира в молоке	Генотипы, определяющие повышенное или пониженное содержание белка в молоке
повышенное	пониженное	повышенное	пониженное
		aaVV (1*) P1*(4*, 5*, 6*)=0,017	aaLL (4*)
abVV (1) Р1(3, 4)=0,008	abLL (3)	abLL (2*) Р1*(4*, 5*, 6*)=0,008	abVV (5*)
bbVL (2) Р2(3, 4)=0,009	bbVV (4)	bbLL(3*) Р1*(4*, 5*, 6*)=0,020	bbVV (6*)
Примечание: Р - достоверность различий между генотипом, определяющим повышенное значение параметра продуктивности (жира, белка) с группой генотипов, определяющих их пониженное содержание, рассчитанная с помощью F-критерия методом спланированных сравнений (анализ контрастов).

В табл.6 приведены средние значения содержания жира (%) и белка (%) в молоке крупного рогатого скота и их стандартные ошибки для названных групп генотипов.

Таблица 6.
Средние значения содержания (%) /жира и белка в молоке крупного рогатого скота с различными генотипами по локусам пролактина и гормона роста с указанием стандартной ошибки
Генотипы, определяющие содержание жира в молоке	Генотипы, определяющие содержание белка в молоке
повышенное	пониженное	повышенное	пониженное
		aaVV	aaLL
3,42±0,08	3,22±0,06
abVV	abLL	abLL	abVV
4,72±0,13	4,29±0,09	3,39±0,05	3,22±0,08
bbVL	bbVV	bbLL	bbVV
4,72±0,13	4,26±0,18	3,47±0,10	3,18±0,10

Согласно данным таблицы 6 у животных с генотипами, определяющими повышенное содержание жира (%) в молоке, средние значения данного показателя отличаются от таковых у животных с генотипами, определяющими пониженное содержание жира в молоке, примерно на четыре десятых процента, что является существенным при расчете на объем молока по всем лактациям. По содержанию белка (%) разница между генотипами, определяющими повышенное и пониженное его содержание в молоке составляет примерно две десятых процента, что также является экономически значимым [Zhou G.L, Jin H.G., Liu С., Guo S. L., Zhu Q. and Wu Y.H. Association of genetic polymorphism in GH gene with milk production traits in Beijing Holstein cows //J. Biosci. 2005. V.30, p.595-598; Zwierzchowski L., Krzyzewski J., Strzalkowska N., Siadkowska E., Ryniewicz Z. Effect of polymorphism of growth hormon (GH), Pit-1, and leptin (LEP) genes, cow's age, lactation stage and somatic cell count on milk yield and composition of Polish Black-and-White cows// Animal Science Papers and Reports. 2002. V.20. N4, p.213-227].

Таким образом, выявлены сопряженные генотипы по локусам генов пролактина и гормона роста, определяющие повышенное и пониженное содержание жира и белка в молоке крупного рогатого скота. Использование предложенного способа позволяет на ранних этапах жизни животных оценивать их потенциал по признакам молочной продуктивности (жир и белок), что значительно ускоряет отбор животных при формировании высокопродуктивного молочного стада, а также повышает эффективность селекционной работы по улучшению молочных пород.

Способ определения генетического потенциала крупного рогатого скота по качеству молока, включающий выделение ДНК, амплификацию с использованием специфичных праймеров, рестрикционный анализ полученных ампликонов с установлением генотипов отдельно по каждому гену, а затем сопряженных генотипов по обоим генам, которые сравнивают с установленными генотипами, определяющими качество молока, отличающийся тем, что в качестве праймеров используют праймеры, специфичные для фрагмента экзона III гена пролактина и фрагмента экзона V гена гормона роста, анализ полученных ампликонов проводят RsaI- и AluI-рестриктазами соответственно, а в качестве установленных генотипов, обуславливающих повышенное содержание жира и белка в молоке, используют генотипы abVV, bbVL и aaVV, abLL, bbLL соответственно, а генотипов, обуславливающих пониженное содержание жира и белка в молоке, - генотипы abLL, bbVV и aaLL, abVV, bbVV соответственно.