Способ получения бад из низкомолекулярных катионных белков молока и полученная этим способом бад

Изобретение относится к молочной, биотехнологической, медицинской, фармацевтической и косметологической промышленности. Биологически активную добавку получают путем очистки молочного сырья центрифугированием, сорбции белков на ионообменнике, хроматографического их разделения, элюирования, определения фракций с оптической плотностью при длине волны 280 нм более 0,1 ед., диализа, стабилизации и фасовки. В качестве сырья используют нативные катионные белковые вещества молочного происхождения. Хроматографическое разделение проводят на СМ-целлюлозе, а диализ - против дистиллированной воды или фосфатного буфера. Стабилизацию и микробиологическую очистку осуществляют микрофильтрацией через полупроницаемые мембраны с селективностью 0,22-0,45 мкм. Полученную БАД фасуют, подвергают замораживанию до температур минус 20-25°С и последующей сублимационной сушке при температуре сублимации минус 20±4°С и максимальной температуре досушки плюс 37±2°С. БАД содержит в нативном виде фракцию катионных белков молочного происхождения, обогащенную лизоцимом, ангиогенином, панкреатической РНКазой, лактопероксидазой, лактоферрином. Предлагаемая БАД обладает антимикробными, антиоксидантными, иммуномодуляторными, противострессорными свойствами, что позволяет использовать полученную БАД в качестве основы препаратов парафармацевтического действия. 2 с.п. ф-лы, 2 табл.

 

Изобретение относится к молочной, биотехнологической, медицинской, фармацевтической, косметической промышленности, а именно к способам получения биологически активных веществ, которые могут использоваться в качестве биологически активных добавок (БАД).

Известны способы переработки молока и получения белкового полисахаридного концентрата, которые заключаются в том, что с целью повышения биологической ценности и создания безотходной технологии обезжиренное молоко в количестве 5-100% с кислотностью 15-23Т обрабатывают при 2-40°С полисахаридом с молекулярной массой 20000-80000 до разделения на казеиновую и полисахаридную фазу [Патент №1725803 (Россия). Способ переработки молока. / Молочников В.В., Толстогузов В.Б.]. И получают концентрат натурального казеина (КНК), содержащий около 97% казеина и безказеиновую фракцию, содержащую всю водорастворимую часть молока и полисахарид. В дальнейшем безказеиновую фазу сгущают, получая при этом концентрат структурирующий пищевой (КСП) [Патент №181876 (Россия). Способ получения белкового полисахаридного концентрата. / Молочников В.В., Щанов В.Ю., Анисимов С.В., Храмцов А.А.]. КСП рекомендован для использования в качестве добавки к молочным и кондитерским изделиям как структурообразующий компонент, а также для регулирования содержания в продуктах растворимых биологически активных компонентов, повышающих устойчивость организма к вредным воздействиям окружающей среды [ТУ 49 1171-85 Концентрат структурирующий пищевой КСП]. Недостатком данных способов является содержание в готовом продукте (КСП) биологически активных веществ в неконцентрированном состоянии, а также содержание наряду с белковыми компонентами минеральных веществ, лактозы и пектина, а кроме того, КСП подвергается технологической обработке, в результате которой нативные свойства биологически активных веществ молока снижаются.

Японскими учеными запатентован в России способ получения продукта, содержащего «активные молочно-белковые компоненты», и продукт, полученный этим способом (варианты) [Патент №21-6785 (Россия). Способ получения продукта, содержащего активные молочно-белковые компоненты, и продукт, полученный этим способом (варианты). / Йосиказу Юки (JP), Кумико Теразава (JP), Томойо Накагава (JP), Казуо Кате (JP)]. Целью разработанного способа является получение для недоношенных детей продуктов, получаемых из грудного или коровьего молока и содержащих активные молочные белковые компоненты, а именно иммуноглобулины, лактоферрин и лизоцим. Эти продукты также могут быть использованы в качестве добавки к грудному молоку и как фармацевтические продукты, например, при терапии неподдающегося поноса. Авторы патента термин «активные белковые компоненты» используют для обозначения любого белка, который в минимальных количествах проявляет физиологические и фармакологические свойства. Продукты получают по способу, состоящему из стадий добавления к молочной плазме или сыворотке сахарного спирта, или дисахарида, или стабилизатора, состоящего из дисахарида и аминокислоты (глицин), и проведения термообработки полученной смеси при рН 6-8, при примерно 60°С в течение около 10 ч; продукты, содержащие активные компоненты молочного белка, представляют собой осадок, образовавшийся при добавлении сульфата аммония в концентрации 30-60% (мас./объем) к термообработанной смеси. Термообработанную смесь охлаждают, а осажденную фракцию собирают центрифугированием и растворяют в изотоническом солевом растворе, подвергают адекватному диализу и стерилизации с помощью мембранной фильтрации. Недостатком данного способа является использование длительной (10 ч) термообработки, в результате которой уничтожаются не только вирусы, но и нативные вещества молока.

В Японии запатентован способ выделения из молока препарата ангиогенина, обладающего физиологической активностью [Патент №2-296000 (Япония)]. Благодаря наиважнейшей функции ангиогенина - способности индуцировать рост кровеносных сосудов предлагается использовать его для обработки поврежденных тканей, язв, при имплантации органов.

Запатентован способ выделения ангиогенина, который представляет собой трехэтапный метод хроматографической очистки ангиогенина от белков молока с помощью ионообменной хроматографии на СМ-целлюлозе и гидрофобной хроматографии на CM Toyopearl 650 S Butyl Toyopearl 650 S [Патент №2109784 (РФ). Способ выделения ангиогенина / Рогов И.А., Шалыгина A.M., Комолова Г.С., Михайлов A.M., Тихомирова Н.А.].

Наряду с ним запатентован способ получения биологически активного концентрата, обогащенного панкреатической рибонуклеазой А, ангиогенином и лизоцимом, из молочного ультрафильтрата [Патент №2204262 (РФ). Способ получения биологически активного концентрата, обогащенного панкреатической рибонуклеазой А, ангиогенином и лизоцимом, из молочного ультрафильтрата / Рогов И.А., Шалыгина A.M., Тихомирова Н.А., Комолова Г.С., Федорова Т.В., Машков А.Е., Цуман В.Г., Пыхтеев Д.А., Плаксина Г.В.] Способ заключается в том, что молочное сырье, в качестве которого используют ультрафильтрат, сначала концентрируют в 10-12 раз посредством обратного осмоса через мембрану с размером пор 1000-5000 Д при давлении 0,4-0,7 МПа и температуре 4-10°С, затем производят очистку белкового раствора от лактозы и минеральных веществ добавлением калий-фосфатного буфера с рН 6,7-7,0, посредством диафильтрации, полученный белковый концентрат стерилизуют, подвергая его микрофильтрации через мембрану с размером пор 0,10-0,45 мкм при давлении 0,2-0,7 МПа и температуре 4-10°С.

Известен способ получения биологически активной добавки на основе ангиогенина, панкреатической РНКазы, лизоцима и полипептидов, полученной методом катионно-обменной хроматографии на СМ-целлюлозе [Патент №2183935 (РФ). Способ получения биологически активной добавки «МИЛКАНГ» и полученная этим способом БАД «МИЛКАНГ» / Рогов И.А., Титов Е.И., Шалыгина A.M., Тихомирова Н.А., Комолова Г.С., Рогов С.И.]. Способ заключается в том, что сначала белки молочного происхождения отделяют от жировой фракции, затем проводят сорбцию и хроматографическое разделение, элюирование, определение фракций с оптической плотностью при длине волны 280 нм более 0,1 ед., диализ против физиологического раствора, стабилизируют ее путем проведения микрофильтрации через полупроницаемую мембрану с селективностью более 50 кДа, после чего полученную БАД, включающую ангиогенин, панкреатическую РНКазу, лизоцим и полипептиды, направляют на фасовку. Данный способ является прототипом. Недостатком этого способа является невозможность получения в нативном виде полной композиции биологически активных ферментов, входящих в состав защитного комплекса молока. Кроме того, к недостаткам данного способа можно отнести получение БАД в жидкой форме, что значительно снижает сроки ее хранения.

Таким образом, в результате патентного и литературного поиска установлено, что получение биологически активных веществ из молока является актуальной задачей, а использование белков ангиогенина, лактоферрина, лактопероксидазы, панкреатической рибонуклеазы, лизоцима в виде биологически активного препарата находит широкое распространение не только в медицине, фармакологии, но и в косметологии.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является разработка способа получения БАД из молочного сырья, в том числе не используемого рационально, а именно вторичного сырья молочной промышленности, и получения этим способом БАД, содержащей в концентрированном виде защитный комплекс молока, включающий катионные белковые вещества (лактопероксидазу, лактоферрин, лизоцим, ангиогенин, панкреатическую рибонуклеазу), обладающие парафармацевтическими свойствами.

Это достигается тем, что для получения БАД катионные белки молочного происхождения отделяют от жировой фракции путем центрифугирования молочного сырья, далее проводят их сорбцию и хроматографическое разделение, элюирование, определение фракций с оптической плотностью при длине волны 280 нм более 0,1 ед., подвергают диализу и согласно изобретению сорбцию и хроматографическое разделение проводят на СМ-целлюлозе, а диализ полученной белковой фракции проводят против дистиллированной воды, фосфатного буфера, при этом осуществляют ее микробиологическую очистку путем проведения микрофильтрации через полупроницаемую мембрану, после чего полученную БАД, включающую лактопероксидазу, лактоферрин, молочный лизоцим, ангиогенин, панкреатическую РНКазу, направляют на расфасовку. После расфасовки в стерильную тару для обеспечения длительных сроков хранения композицию подвергают замораживанию до температуры минус 20-25°С и последующей сублимационной сушке при температуре сублимации минус 20±4°С, температуре досушки 37±2°С.

Технический результат, полученный согласно данному способу производства, заключается в том, что БАД содержит в нативном виде лактопероксидазу, лактоферрин, лизоцим, ангиогенин, панкреатическую РНКазу, которые обладают ангиогенным, антимикробным, иммуномодуляторным, антиоксидантным, противострессорным и общеукрепляющим действием.

Разработан достаточно простой современный способ получения БАД на основе катионных белков молока, обладающих биологической активностью. Впервые получена фракция катионных белков молочного происхождения, обогащенная наряду с лизоцимом, ангиогенином, панкреатичекой РНКазой уникальными белками лактопероксидазой, лактоферрином, которые обладают антимикробным, антиоксидантным, иммуномодуляторным, противострессорными свойствами. Благодаря получению фракции белков в нативном состоянии данную композицию целесообразно использовать в качестве основы БАД к пищевым продуктам или в технологиях производства медицинских, фармацевтических и косметических препаратов. Для получения фракции катионных белковых веществ молока применена ионообменная хроматография на СМ-целлюлозе. Для стерилизации, микробиологической очистки БАД использована микрофильтрация через полупроницаемые мембраны. Для обеспечения длительных сроков хранения полученной БАД применяют сублимационную сушку. В качестве источника катионных белковых веществ молока, обладающих антимикробным, антиоксидантным, ранозаживляющим, иммуномодуляторными, общеукрепляющими свойствами, использовано сырое молоко, а также вторичное молочное сырье молочной промышленности (обезжиренное молоко). Молоко, в частности вторичные молочные ресурсы, является перспективным источником получения биологически активных веществ [Н.А.Тихомирова, Г.С.Комолова, И.И.Ионова. Биологически активные белки молока: Учеб. пособие - М.: МГУПБ, 2004, - 80 с.], которые могут быть использованы в качестве активной основы БАД для получения продуктов специального назначения и препаратов лечебно-профилактической направленности широкого спектра действия. В частности, представляют интерес практически не используемые в традиционных технологиях катионные белки, обладающие многофункциональными свойствами: лактопероксидаза (78 кДа, обладает антимикробной активностью), лактоферрин (78-80 кДа, полифункциональный белок: бактерицидная и бактериостатическая активность, стимулирует клеточный рост, белок острой фазы, ингибирует иммунные и воспалительные реакции, участвует в процессах внутреннего пищеварения, иммуномодулятор), лизоцим (около 14 кДа, обладает бактерицидным действием), ангиогенин (14,5 кДа, полифункциональный белок: фактор роста кровеносных сосудов, активный фактор костеобразования, иммунорегулятор, бактерицидное действие, белок острой фазы, участвует в передаче пассивного иммунитета), панкреатическая РНКаза (12 кДа, противовирусное действие). Разработанный способ позволяет получать БАД, содержащую в концентрированном, но при этом нативном виде вышеперечисленные катионные белки молока. Благодаря сохранности их нативных свойств БАД обладает антимикробным, антиоксидантным, иммуномодуляторным, ангиогенным свойствами, что позволяет использовать ее как непосредственно, так и в виде добавки к молочным и другим продуктам питания, которые могут быть рекомендованы в качестве диетического, функционального, лечебно-профилактического питания.

Белковый состав БАД проверяют электрофоретически в ПААГ, а нативность белков - по ферментативной активности (лактопероксидаза, лизоцим, пРНКаза, лактоферрин) и по взаимодействию с плацентарным ингибитором (ангиогенин).

Способ осуществляют следующим образом. Для получения БАД берут молочное сырье с нативными катионными белковыми веществами, обезжиривают центрифугированием, далее обезжиренную белковую фракцию наносят на колонку с сорбентом СМ-целлюлозой и проводят ионообменную хроматографию, элюируют, собирая фракции с А₂₆₀>0,1. Фракции объединяют и проводят диализ против дистиллированной воды, фосфатного буфера. Полученный диализат подвергают микрофильтрации через полупроницаемые мембраны с селективностью 0,22-0,45 мкм. В результате получают БАД в жидкой форме, которую затем направляют на фасовку. С целью обеспечения более длительных сроков хранения полученную БАД после фасовки подвергают замораживанию до температур минус 20-25°С и последующей сублимационной сушке при температуре сублимации минус 20±4°С и максимальной температуре досушки плюс 37±2°С, получая тем самым сухую форму БАД. Ферментный состав полученной БАД представлен в таблице 1.

Таблица 1
Ферментный состав БАД из низкомолекулярных катионных белков молока
№ п/п	Фермент	Выход из 1 л молока
мг	мг/мг белка*
1	Лактоферрин	10,3±1,4	0,269
2	Лактопероксидаза	17,9±1,2	0,471
3	Панкреатическая РНКаза	2,7±0,1	0,070
4	Ангиогенин	0,9±0,1	0,023
5	Лизоцим	0,09±0,01	0,018
6	Общий белок	38,2±4,9
* - в расчете на 1 мг общего белка катионной белковой фракции.

Пример 1.

Цельное молоко в количестве 5 л обезжиривают центрифугированием, далее обезжиренную фракцию наносят на колонку с сорбентом СМ-целлюлозой и проводят ионообменную хроматографию, элюируют, собирая фракции с A₂₈₀>0,1. Фракции объединяют и проводят диализ против дистиллированной воды. Полученный диализат подвергают микрофильтрации через полупроницаемые мембраны. В результате получают 50 мл БАД, состав которой в сравнении с прототипом представлен в таблице 2. Готовую БАД в жидкой форме фасуют в стерильную тару. В сухой форме БАД получают с применением сублимационной сушки с предварительным замораживанием готовой БАД.

Пример 2 осуществляют по примеру 1, при этом в качестве сырья используют обезжиренное молоко и получают БАД, состав которой представлен в таблице 2.

Пример 3 осуществляют по примеру 1, при этом диализ полученной фракции катионных белков молока проводят против физиологического раствора и получают БАД, состав которой представлен в таблице 2.

Пример 4 осуществляют по примеру 1, при этом диализ полученной фракции катионных белков молока проводят против фосфатного буфера и получают БАД, состав которой представлен в таблице 2.

Таким образом, в сравнении с прототипом в состав БАД входит более широкий спектр биологически активных веществ, обладающий кроме ранозаживляющего и общеукрепляющего эффектов также антимикробным, антиоксидантным и иммуномодуляторным свойствами за счет дополнительного содержания лактопероксидазы и лактоферрина, что позволяет использовать полученную БАД в качестве основы препаратов парафармацевтического действия.

Таблица 2
Состав БАД в сравнении с прототипом
Образец	Прототип	Пример 1	Пример 2	Пример 3	Пример 4
Ангиогенин, мг/мл	0,1-0,3	1,0±0,1	0,9±0,09	1,5±0,5	0,97±0,09
пРНКаза, мг/мл	0,7-2,4	2,7±0,3	2,4±0,15	2,9±0,1	2,5±0,1
Лизоцим, мг/мл	0,001-0,004	0,09±0,01	0,083±0,01	0,095±0,01	0,086±0,01
Лактопероксидаза мг/мл	-	17,9±1,2	17,1±1,3	18,01±1,3	17,6±1,1
Лактоферрин, мг/мл	-	10,5±1,4	9,9±1,4	10,2±1,3	10,3±1,0

1. Биологически активная добавка, содержащая ангиогенин, лизоцим и панкреатическую РНКазу, лактопероксидазу и лактоферрин при следующем соотношении, мг/мл:

Лактопероксидаза	17,9±1,2
Лактоферрин	10,3±1,4
Ангиогенин	0,9±0,1
Панкреатическая РНКаза	2,7±0,1
Лизоцим	0,09±0,01

2. Способ получения биологически активной добавки (БАД) по п.1, включающий очистку молочного сырья центрифугированием, сорбцию белков на ионообменнике, хроматографическое их разделение, элюирование, определение фракций с оптической плотностью при длине волны 280 нм более 0,1 ед., диализ, при этом диализ полученной белковой фракции проводят против фосфатного буфера или дистиллированной воды, стабилизацию и микробиологическую очистку осуществляют микрофильтрацией через полупроницаемые мембраны с селективностью 0,22-0,45 мкм, полученную БАД расфасовывают в стерильную тару, подвергают сублимационной сушке при температуре сублимации минус 20±4°С и максимальной температуре досушки плюс 37±2°С.