Способ лечения злокачественных новообразований
Владельцы патента RU 2320364:
ЗАКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО "ЦЕНТР "ПЕПТОС" (RU)
ГУ МЕДИЦИНСКИЙ РАДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РАМН (RU)
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, конкретно к способам лечения злокачественных новообразований, способных к метастазированию. Способ лечения злокачественных новообразований включает введение лекарственного препарата, в качестве которого используется пептид формулы γ-D-Glu-D-Trp. Перед введением препарата проводят локальное облучение опухоли. 15 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, конкретно к способам лечения злокачественных новообразований, способных к метастазированию.
В последние десятилетия достигнуты значительные успехи в понимании механизмов метастазирования, однако, в области практического предотвращения этого процесса успехи весьма незначительны.
Одной из основных причин летальных исходов при лечении онкологических больных по-прежнему являются устойчивые к терапевтическому воздействию метастазы. Лечение метастазов может быть успешным только при тотальной деструкции опухолевых клеток. Но в процессе терапии рака могут сохраниться некоторые субпопуляции опухолевых клеток, имеющие большую по сравнению с исходной опухолью способность к метастазированию и повышенную устойчивость к используемому лечению. Такими клетками могут быть стволовые клетки опухоли, наличие которых продемонстрировано для лейкемии (Lapidot Т., Pflumio F., Doedens M., at all. Science. 1992. v.255. 1137-1141) и ряда солидных опухолей, например мозга и молочной железы (Singh SK, Hawkins С, Clarke ID at all. Nature 2004, v.432, p.396-401; Dontu G, Al-Hajj M, Abdallah WM, at all. Cell Prolif 2003, v.36, Suppl 1, p.59-72).
Известен способ лечения злокачественных новообразований кожной и подкожной локализации, при котором перед использованием химиотерапии вводят дозу никотиновой кислоты (Патент №2257899, A61К 38/08). Недостатком способа является рекрутирование депонированных объемов крови, что приводит к интенсификации процессов миграции, и, как следствие, может спровоцировать усиление гематогенного метастазирования.
Известен способ лечения рака предстательной железы, включающий введение химиопрепаратов и лучевую терапию, при котором в день начала лучевой терапии вводят цисплатину (Патент №2257894, А61К 38/08).
Известен способ лечения рака шейки матки, наиболее близкий к заявляемому способу, включающий наружное облучение и использование химиопрепаратов, соединенных с аутоплазмой, при котором с 1 по 4 день проводят наружное облучение, затем на 5 день вводят цисплатину с 250 мл физиологического раствора, а в последний день лечения вводят аутоплазму, инкубированную с цисплатиной. (Патент РФ №2261706, А61К 38/08).
Существенным недостатком обоих способов является отсутствие протекции в отношении начальных отделов гемопоэза, так как препаратами платины поражаются все три ростка кроветворения.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка эффективного способа лечения злокачественных новообразований - подавление процесса метастазирования солидных опухолей.
Поставленная задача решается за счет того, что в способе лечения злокачественных новообразований, включающем введение лекарственного препарата, в качестве лекарственного препарата используют пептид формулы γ-D-Glu-D-Trp, перед введением которого проводят локальное облучение опухоли или химиотерапию.
Сущность способа заключается в том, что при лечении новообразований используют в качестве лекарственного препарата синтетический пептид формулы γ-D-Glu-D-Trp, перед введением которого проводят локальное облучение опухоли или химиотерапию с использованием препарата платины - платинола. Синтетический пептид формулы γ-D-Glu-D-Trp обладает иммунорегулирующим свойством, не токсичен (Патент №2107692, 6 С07К 5/065, А61К 38/08). Эксперименты проводят на самках мышей линии С57В16 весом 20 г. В качестве моделей используют Карциному Льюис, метастазирующую в легкие; спонтанно развившуюся, перевиваемую и метастазирующую в легкие опухоль молочной железы; лейкоз Раушера (эритробластный лейкоз) и тимому EL-4. Опухолевые клетки перевивают мышам под кожу бедра. При этом вначале образуется первичный опухолевый узел, а затем возникают вторичные (спонтанные) опухолевые узлы в легких.
Технический результат заявленного способа заключается в статистически достоверном снижении количества метастазов, как при сочетании пептида с локальным облучением, так и при сочетании с химиотерапией (платинолом). Так, последовательное воздействие платинолом и пептидом формулы γ-D-Glu-D-Trp снижает количество метастазов в легкие почти в 4 раза по сравнению с контролем.
Примеры выполнения изобретения приводятся ниже.
Пример 1. (Влияние пептида γ-D-Glu-D-Trp в комплексе с радио- и химиотерапией на спонтанное метастазирование и рост Карциномы Льюис).
Спонтанные метастазы Карциномы Льюис (КЛ) в легкие развиваются после перевивки опухолевых клеток мышам-реципиентам под кожу бедра. При этом вначале образуется первичный опухолевый узел, а затем возникают вторичные (спонтанные) опухолевые узлы в легких. В такой модели метастазирования оценивается действие исследуемых препаратов на ключевые этапы взаимодействия опухоль-организм. Исследовано влияния пептида формулы γ-D-Glu-D-Trp в комплексе с радиотерапией или цитостатиком (платинолом) на спонтанное метастазирование КЛ.
Эксперименты по изучению влияния пептида γ-D-Glu-D-Trp в комплексе с радиотерапией на спонтанное метастазирование КЛ проведены с использованием двух схем терапии на самках мышей линии С57В16 весом 20 г.
Схема 1 - Опухолевые клетки прививают подкожно, на заднюю правую лапу мышей в количестве 2,0·106 кл/мышь. На 7-ые сутки роста опухоли (при среднем ее объеме 100-500 мм3) опухоль подвергают локальному облучению дважды, с интервалом 24 час в дозе 20 Гр. Пептид начинают вводить сразу после первого облучения (12,5 мкг/мышь), внутрибрюшинно (в/б), 1 раз в сутки и продолжают в течение 12 дней.
Схема 2 - Опухолевые клетки прививают подкожно, на заднюю правую лапу мышей в количестве 1,0·106 кл/мышь. На 12-14-ые сутки роста опухоли (при среднем ее объеме 700-1000 мм3) опухоль подвергают локальному облучению дважды, с интервалом 24 час в дозе 20 Гр. Препарат начинают вводить сразу после первого облучения (12,5 мкг/мышь), внутрибрюшинно, 1 раз в сутки и продолжают в течение 12 дней.
Проведено по 4 независимых эксперимента на обеих выбранных экспериментальных моделях, в каждом из которых сформированы 4 группы: 1 - контрольная - мыши с опухолью без какого-либо воздействия; 2 - Пептид γ-D-Glu-D-Trp - мыши с опухолью, получающие γ-D-Glu-D-Trp по одной из описанных схем; 3 - Облучение - мыши с облученной локально опухолью, не получающие дополнительного лечения; 4 - Облучение + пептид γ-D-Glu-D-Trp - мыши с облученной локально опухолью, получающие препарат, как в группе 2. Группа в каждом из экспериментов содержит 7-8 мышей.
При исследовании влияния пептида γ-D-Glu-D-Trp в комплексе с препаратом платины (платинолом) на спонтанное метастазирование КЛ мышам-опухоленосителям (линия С57В16, самки, вес - 20 г) инъецируют платинол 5 мг/кг, в/б, 1 раз на 6-ые сутки роста опухоли (при среднем ее объеме 250 мм3). Пептид γ-D-Glu-D-Trp начинают вводить через сутки после цитостатика, 12,5 мкг/мышь, в/б, 1 раз в сутки, в течение 12 дней. Проведено по 4 независимых эксперимента, в каждом из которых сформированы 4 группы: 1 - контрольная - мыши с опухолью без какого-либо воздействия; 2 - Пептид γ-D-Glu-D-Trp - мыши с опухолью, получающие препарат по вышеописанной схеме; 3 - Платинол - мыши с опухолью, получающие платинол, как описано выше; 4 - Платинол + пептид - мыши с опухолью, получающие платинол, как в группе 3, и пептид, как в группе 2. Группа в каждом из экспериментов содержит 7-8 мышей.
На 21-е сутки роста опухоли (облучение по схеме 1, применение платинола) или на 28-е сутки роста (облучение по схеме 2) у экспериментальных мышей определяют число метастазов в легкие. Для этого извлеченные из животных-опухоленосителей легкие помещают на сутки в раствор Буэна и затем подсчитывают количество метастазов на поверхности легких.
Данные, представленные в таблицах 1 и 2, свидетельствуют, что применение пептида γ-D-Glu-D-Trp вызывает статистически значимое снижение количества метастазов как у необлученных мышей-опухоленосителей, так и при сочетанием применении пептида с локальным облучением при обеих схемах лечения. В комплексе с цитостатиком (платинол) пептид γ-D-Glu-D-Trp снижает количество спонтанных метастазов в легкие почти в 4 раза по сравнению с контролем (таблица 3).
| Таблица 1. | |||
| Влияние пептида γ-D-Glu-D-Trp в сочетании с локальным облучением на образование спонтанных метастазов КЛ в легких (лечение по схеме 1). | |||
| Пептид γ-D-Glu-D-Trp | Облучение | Число мышей | Среднее кол-во метастазов |
| - | - | 29 | 18,3±1,3* |
| + | - | 30 | 9,0±1,3* |
| - | + | 28 | 14,4±2,2** |
| + | + | 29 | 7,7±1,2** |
| *, ** - р<0,05 | |||
| Таблица 2. | |||
| Влияние пептида γ-D-Glu-D-Trp в сочетании с локальным облучением на образование спонтанных метастазов КЛ в легких (лечение по схеме 2). | |||
| Пептид γ-D-Glu-Trp | Облучение | Число мышей | Среднее кол-во метастазов |
| - | - | 24 | 41,4±3,3* |
| + | - | 30 | 24,2±3,6* |
| - | + | 25 | 23,1±2,2** |
| + | + | 30 | 12,2±1,5** |
| *, ** - р<0,05 |
| Таблица 3. | |||
| Влияние пептида γ-D-Glu-Trp в сочетании с платинолом на образование спонтанных метастазов КЛ в легких. | |||
| Пептид γ-D-Glu-rp | Платинол | Число мышей | Среднее кол-во метастазов |
| - | - | 28 | 24,8±2,3 |
| + | - | 30 | 12,9±1,2* |
| - | + | 27 | 13,4±1,5* |
| + | + | 30 | 7,0±2,1*# |
| * - р<0,05 по отношению к контролю; # - р<0,05 по отношению ко 2-ой и 3-ей группам |
Кроме метастазирования, во всех экспериментах проводят изучение эффективности примененных схем терапии на рост солидной опухоли КЛ. Комбинированное воздействие локального облучения (схема 1 и схема 2) или цитостатика и пептида γ-d-Glu-Trp оценивают по индексу роста (ИР), который определяют как отношение объема опухоли в день очередного измерения (V) к объему опухоли в нулевой день (V0) (первое облучение или введение цитостатика) - ИР=V/V0. Объем опухоли рассчитывают по трем величинам: глубина/2 × ширина × длина (мм3), которые измеряли на 2, 5, 7, 9 и 12 день после первого облучения.
Усредненные результаты четырех независимых экспериментов (лечение по схеме 1), представленные в таблице 4, свидетельствуют, что применение пептида γ-D-Glu-Trp приводит к определенному замедлению роста опухоли у необлученных мышей (во все сроки измерения, кроме 2 суток, значения ИР статистически достоверно отличаются от контроля). Время удвоения (Т1/2) опухоли в контрольной и опытной группах близки по своим значениям (Таблица 5).
При совместном применении локального облучения и пептида γ-D-Glu-D-Trp также наблюдается определенное снижение значений ИР по сравнению с группой Облучение (значения ИР статистически достоверно отличаются от только облучения на 5-е, 9-е и 12-е сутки после начала лечения) (Таблица 4). В результате совместного применения облучения и пептида значение времени удвоения опухоли в 1,5 раза превышает таковое только для облучения. Следует также отметить сниженное значение коэффициента корреляции (r=0,6) в группе Облучение + пептид γ-D-Glu-D-Trp по сравнению только с Облучением. Такая корреляция между ИР и временем роста опухоли может свидетельствовать о более выраженном замедлении роста опухоли при комплексном применении пептида и облучения по сравнению с группой Облучение (Таблица 5).
| Таблица 4. | ||||||
| Значения индекса роста (ИР) Карциномы Льюис в условиях сочетанного применения пептида γ-D-Glu-D-Trp и локального облучения (лечение по схеме 1). | ||||||
| Группа | Значения ИР | |||||
| 0 сутки | 2 сутки | 5 сутки | 7 сутки | 9 сутки | 12 сутки | |
| Контроль | 1 | 2,6±0,3 | 4,9±0,5* | 11,3±0,7* | 14,8±1,0* | - |
| Пептид γ-D-Glu-D-Trp | 1 | 2,2±0,1 | 3,8±0,3* | 8,9±0,6* | 11,1±0,8* | - |
| Облучение | 1 | 1,5±0,06 | 1,6±0,1** | 1,8±0,1 | 2,7±0,2** | 6,0±0,6 |
| Облучение + пептид γ-D-Glu-D-Trp | 1 | 1,6±0,07 | 1,2±0,1** | 1,6±0,1 | 2,1±0,1** | 2,9±0,3** |
| **, *-р<0,05 | ||||||
| Таблица 5. | ||||||
| Значения времени удвоения Карциномы Льюис (Т1/2) и коэффициента корреляции (r) (ИР - время роста) в условиях сочетанного применения пептида γ-D-Glu-D-Trp и локального облучения (лечение по схеме 1). | ||||||
| Группа | Т1/2 (сутки) | r±m | ||||
| Контроль | 2,46 | 0,94±0,15 | ||||
| Пептид γ-D-Glu-D-Trp | 2,95 | 0,84±0,22 | ||||
| Облучение | 6,14 | 0,81±0,14 | ||||
| Облучение + пептид γ-D-Glu-D-Trp | 10,6 | 0,61±0,15 |
Усредненные результаты следующих четырех независимых экспериментов (лечение по схеме 2, начиная с 12-х суток роста) представлены в таблице 6. В данных условиях пептид γ-D-Glu-D-Trp, хотя и слабо, ингибирует рост опухоли у необлученных животных, (во все сроки измерения, кроме 2-х суток, значения ИР в экспериментальных группах статистически достоверно отличаются от контроля). Однако значение Т1/2 опухоли в опытной группе практически равно таковому в контроле (Таблица 7).
При совместном применении локального облучения и пептида γ-D-Glu-D-Trp происходит статистически достоверное снижение значений ИР по сравнению с группой Облучения, начиная с 5-х суток после начала лечения (Таблица 6). Время удвоения опухоли в данном случае в 4 раза превышает таковое для группы Облучение. Слабая корреляция между ИР и временем роста опухоли при комбинированной терапии (r=0,18) также свидетельствует о практически полном торможении опухолевого процесса с 5-х по 12-е сутки лечения (Таблица 7).
| Таблица 6. | ||||||
| Значения индекса роста (ИР) Карциномы Льюис в условиях сочетанного применения пептида γ-D-Glu-D-Trp и локального облучения (лечение по схеме 2). | ||||||
| Группа | Значения ИР | |||||
| 0 сутки | 2 сутки | 5 сутки | 7 сутки | 9 сутки | 12 сутки | |
| Контроль | 1 | 1,8±0,1 | 3,0±0,2* | 4,4±0,2* | 5,9±0,2* | - |
| Пептид γ-D-Glu-D-Trp | 1 | 1,4±0,07 | 2,0±0,2* | 3,3±0,3* | 4,8±0,3* | |
| Облучение | 1 | 1,1±0,07 | 1,3±0,2** | 1,8±0,4** | 2,7±0,3** | 3,6±0,3** |
| Облучение + пептид γ-D-Glu-D-Trp | 1 | 1,0±0,05 | 0,8±0,04** | 0,9±0,1** | 1,5±0,3** | 2,0±0,3** |
| * р<0,05, ** - р<0,01 | ||||||
| Таблица 7. | ||||||
| Значения времени удвоения Карциномы Льюис (Т1/2) и коэффициента корреляции (r) (ИР - время роста) в условиях сочетанного применения пептида γ-D-Glu-D-Trp и локального облучения (лечение по схеме 2). | ||||||
| Группа | Т1/2 (сутки) | r±m | ||||
| Контроль | 4,21 | 0,95±0,17 | ||||
| Пептид γ-D-Glu-D-Trp | 3,95 | 0,93±0,09 | ||||
| Облучение | 8,2 | 0,72±0,15 | ||||
| Облучение + пептида γ-D-Glu-D-Trp | 35,25 | 0,18±0,18 |
Таким образом, при начале лечения КЛ на 12-е сутки роста (схема 2) пептид γ-D-Glu-D-Trp слабо подавляет рост опухоли у необлученных мышей, однако при комплексном применении с локальным облучением тормозит опухолевой процесс в гораздо большей степени, чем только локальное облучение опухоли.
Проведено также исследование влияния пептида γ-D-Glu-D-Trp на рост Карциномы Льюис при применении в комплексе с препаратом платины (платинолом). На 6-е сутки роста опухоли (при среднем ее объеме 250 мм3) мышам-опухоленосителям инъецируют Платинол 5 мг/кг, в/б, 1 раз. Пептид γ-D-Glu-D-Trp начинают вводить через сутки после цитостатика, 12,5 мкг/мышь, в/б, 1 раз в сутки, в течение 10 дней. За день 0 принимают день введения платинола. Измерение параметров опухоли проводят на 2, 5, 7 и 9 день после инъекции цитостатика.
Результаты, представленные в таблице 8, демонстрируют, что совместное применение пептида γ-D-Glu-D-Trp и платинола оказывает эффект, аналогичный только цитостатику, т.е. пептид не ослабляет противоопухолевое действие платинола.
| Таблица 8. | ||||||
| Значения индекса роста (ИР) Карциномы Льюис в условиях сочетанного применения пептида γ-D-Glu-D-Trp и цитостатика (платинола). | ||||||
| Группа | Значения ИР | |||||
| 0 сутки | 2 сутки | 5 сутки | 7 сутки | 9 сутки | 12 сутки | |
| Контроль | 1 | 3,9±0,4 | 8,5±0,3* | 13,5±0,4* | 20,4±1,2* | - |
| Пептид γ-D-Glu-D-Trp | 1 | 3,3±0,2 | 6,6±0,4* | 10,6±0,7* | 15,4±0,8* | - |
| Платинол | 1 | 2,1±0,1 | 4,3±0,3 | 7,7±0,7 | 12,6±1,0 | 20,5±1,5 |
| Платинол + пептид γ-D-Glu-D-Trp | 1 | 2,0±0,09 | 4,2±0,2 | 7,5±0,5 | 11,0±1,5 | 18,9±1,4 |
| * - р<0,05 |
Таким образом, обнаружено, что пептид γ-D-Glu-D-Trp способен усиливать антиметастатическое и даже, в определенной мере, противоопухолевое действие облучения и цитостатиков.
Пример 2. (Влияние пептида γ-D-Glu-D-Trp в комплексе с радиотерапией на метастазирование и рост спонтанной метастазирующей опухоли молочной железы).
В качестве второй модели используют мышиную спонтанно развившуюся, перевиваемую и метастазирующую в легкие опухоль молочной железы у мышей линии СВА, гистологически идентифицированную как солидный трабекулярный рак.
Клетки, взятые из спонтанно развившейся опухоли молочной железы, перевивают на бедро мышей СВА. Опухоль интенсивно растет при такой перевивке и метастазирует в легкие. Таким образом проведено 9 пассажей. При 10-ом пассаже опухолевые клетки (2,0-10 кл/мышь) перевивают подкожно, на заднюю правую лапу экспериментальных мышей. На 7-е сутки роста опухоли (при среднем ее объеме 300-350 мм3) опухоль подвергают локальному облучению в дозе 30 Гр. Пептид γ-D-Glu-D-Trp начинают вводить сразу после первого облучения (12,5 мкг/мышь), внутрибрюшинно, 1 раз в сутки и продолжают в течение 12 дней.
На 20-е сутки роста опухоли у экспериментальных мышей определяют число метастазов в легкие. Для этого извлеченные у животных-опухоленосителей легкие помещают на сутки в раствор Буэна и затем подсчитывают количество метастазов на поверхности легких.
Эффекты комбинированного воздействия локального облучения и пептида γ-D-Glu-D-Trp на рост опухоли оценивают по индексу роста (ИР), который определяют как отношение объема опухоли в день очередного измерения (V) к объему опухоли в нулевой день (V0) (первое облучение) - ИР=V/V0. Объем опухоли рассчитывают по трем величинам: глубина/2 × ширина × длина (мм3), которые измеряют на 3, 6, 8, 10 и 12 день после облучения.
Проведено 2 независимых эксперимента, в каждом из которых были сформированы 4 группы: 1 - контрольная - мыши с опухолью без какого-либо воздействия; 2 - Пептид γ-D-Glu-D-Trp - мыши с опухолью, получающие пептид по вышеописанной схеме; 3 - Облучение - мыши с облученной локально опухолью, не получающие дополнительного лечения; 4 - Облучение + пептид γ-D-Glu-D-Trp - мыши с облученной локально опухолью, получающие пептид, как в группе 2. Группа в каждом из экспериментов содержит 9-10 мышей.
У экспериментальных мышей на 20-е сутки роста подсчитывают метастазы в легкие. Как видно из усредненных данных, представленных в таблице 9, применение пептида γ-D-Glu-D-Trp вызывает статистически значимое снижение в 2 раза количества метастазов у мышей-опухоленосителей при сочетанием применении пептида с локальным облучением. При этом в группе Облучение + пептид γ-D-Glu-D-Trp у 47% мышей-опухоленосителей отсутствуют метастазы в легких, в то время как в группе Облучение этот параметр составляет 7%.
| Таблица 9. | ||||
| Влияние γ-D-Glu-D-Trp в сочетании с локальным облучением спонтанной опухоли молочной железы на образование спонтанных метастазов в легких. | ||||
| Пептид γ-D-Glu-D-Trp | Облучение | Кол-во мышей | Среднее кол-во метастазов | % мышей без метастазов |
| - | - | 18 | 4,6±0,75 | 0 |
| + | - | 20 | 3,4±0,4 | 15 |
| - | + | 19 | 4,7±0,9* | 7 |
| + | + | 19 | 2,3±0,7* | 47 |
| * - р=0,004 |
Исследование влияния пептида γ-D-Glu-D-Trp на рост опухоли выявило (таблица 10), что препарат не меняет динамику роста опухолевого узла у необлученных мышей (во все сроки измерения значения ИР статистически достоверно не отличаются от контроля). При совместном применении локального облучения и пептида γ-D-Glu-D-Trp с 3-х суток после начала лечения наблюдается статистически значимое снижение значений ИР по сравнению с группой Облучение. Следует отметить, что в группе Облучение + пептид γ-D-Glu-D-Trp на 8-е сутки после облучения у 70%, а на 10-е - у 30% мышей опухоль отсутствует, в то время как в группе только облученных животных опухоль отсутствует на 8-е сутки только у 10% животных, а на 10-е - обнаруживается у всех мышей-опухоленосителей.
| Таблица 10. | ||||||
| Значения индекса роста (ИР) спонтанной опухоли молочной железы в условиях сочетанного применения пептида γ-D-Glu-D-Trp и облучения. | ||||||
| Группа | Значения ИР | |||||
| 0 сутки | 3 сутки | 6 сутки | 8 сутки | 10 сутки | 12 сутки | |
| Контроль | 1 | 3,8±0,2 | 6,7±0,5 | 10,9±0,9 | 14,5±1,2 | - |
| Пептид γ-D-Glu-D-Trp | 1 | 4,0±0,3 | 6,7±0,4 | 10,8±0,8 | 14,2±0,9 | - |
| Облучение | 1 | 2,2±0,1* | 1,5±0,2* | 2,4±0,5* | 4,8±1,5* | 5,7±1,8 |
| Облучение + пептид γ-D-Glu-D-Trp | 1 | 1,8±0,07* | 0,5±0,08* | 0,7±0,1* | 0,7±0,4* | 1,4±0,5 |
| * - р<0,005 |
Таким образом, продемонстрировано, что только в сочетании с локальным облучением спонтанной опухоли молочной железы пептид γ-D-Glu-D-Trp снижает в 2 раза количество метастазов в легкие и существенно подавляет рост опухоли. Следует отметить, что коэффициент корреляции (интенсивность роста - время роста) в этом случае представляет отрицательную величину (-0,14±0,1), что свидетельствует о регрессии опухоли.
Пример 3. (Влияние пептида γ-D-Glu-D-Trp на искусственное метастазирование Карциномы Льюис).
При использовании модели искусственного метастазирования опухолевые клетки вводят мышам-реципиентам внутривенно и они попадают непосредственно в капилляры легких, быстро образуют опухолевые узлы без наличия первичной опухоли. Эта модель метастазирования удобна для оценки воздействия препаратов на сами циркулирующие опухолевые клетки и процессы их адгезии в капиллярах легких. При этом в значительной степени удается исключить влияние факторов сложного взаимодействия опухоль - организм хозяина.
Как нами было показано, пептид γ-D-Glu-D-Trp снижает в 2 раза число спонтанных метастазов Карциномы Льюис в легкие. В связи с полученными результатами проведено исследование влияния данного препарата на искусственное метастазирование Карциномы Льюис.
Для этого опухолевые клетки (2×105) в 0,5 мл среды 199 вводят мышам внутривенно. На 16-е сутки у этих животных подсчитывают метастазы в легких. Обработку пептидом в случае (in vitro) опухолевые клетки перед инъекцией реципиентам инкубируют с препаратом (0,2 мкг/мл суспензии) 30 мин при 37°С. Во втором случае (in vivo) пептид γ-D-Glu-D-Trp вводят внутрибрюшинно (12,5 мкг/мышь), начиная с первого часа после введения опухолевых клеток, по одному разу в сутки в течение 4-х дней. В третьем случае (in vitro+in vivo) совмещают обе выше описанные обработки. Результаты экспериментов, представленные в таблице 1, свидетельствуют, что пептид γ-D-Glu-D-Trp, примененный по трем испытанным схемам, снижает число метастазов в легкие в 2 раза.
| Таблица 11. | ||||
| Влияние пептида γ-D-Glu-D-Trp на искусственное метастазирование Карциномы Льюис в легкие. | ||||
| Пептид γ-D-Glu-D-Trp in vitro | Пептид γ-D-Glu-D-Trp in vivo | Число мышей | Среднее число метастазов | Р |
| - | - | 20 | 26,5±1,5* | |
| + | - | 20 | 12,4±1,2 | <0,0001 |
| - | + | 20 | 16,7±1,6 | 0,00028 |
| + | + | 20 | 12,3±1,5 | <0,0001 |
| * - достоверность рассчитана по отношению к данной группе. |
Проведено исследование интенсивности образования метастазов в легких при внутривенном введении клеток Карциномы Льюис на фоне предварительной обработки реципиентов различными дозами пептида γ-D-Glu-D-Trp. Препарат инъецируют интактным мышам-реципиентам в дозах от 10 мкг/кг до 25 мг/кг дважды - за 48 и 24 часа до введения опухолевых клеток. Кроме того, суспензию опухолевых клеток инкубируют с пептидом γ-D-Glu-D-Trp (0,2-20 мкг/мл) при 37°С в течение 30 мин, отмывают центрифугированием и вводят интактным реципиентам, а в одном случае - обработанным препаратом. Метастазы подсчитывают на 16-е сутки.
Результаты, представленные в таблице 12, свидетельствуют, что предобработка реципиента пептидом γ-D-Glu-D-Trp приводит к снижению числа метастазов Карциномы Льюис в легкие, причем эффект имеет обратную зависимость от дозы препарата. Кроме того, непосредственное воздействие на опухолевые клетки препарата (инкубация) снижает интенсивность искусственного метастазирования. Однако в этом случае отсутствует зависимость эффекта от дозы препарата. Комплексная обработка и реципиента и опухолевых клеток пептидом γ-D-Glu-D-Trp не приводит к суммированию эффекта.
| Таблица 12. | |||
| Влияние пептида γ-D-Glu-D-Trp, примененного в спектре доз, на искусственное метастазирование Карциномы Льюис. | |||
| Обработка реципиента (пептид γ-D-Glu-D-Trp мкг/кг/на инъекцию) | Обработка клеток КЛ пептидом γ-D-Glu-Trp мкг/мл | Среднее кол-во метастазов | Р |
| - | - | 15,3±1,1* | |
| 10,0 | - | 5,3±0,9 | <0,001 |
| 100,0 | - | 5,8±1,4 | <0,001 |
| 1000,0 | - | 5,9±0,9 | 0,00001 |
| 5000,0 | - | 8,2±0,6 | 0,00002 |
| 25000 | - | 9,4±0,6 | 0,00015 |
| - | 0,02 | 6,1±1,1 | 0,00001 |
| - | 0,2 | 7,4±1,1 | 0,001 |
| - | 2,0 | 7,1±1,2 | 0,0001 |
| 1000 | 0,2 | 7,0±0,7 | 0,0001 |
Пример 4. (Влияние пептида γ-D-Glu-D-Trp на развитие лейкоза Раушера).
Исследование проведено на мышах линии BALB. Лейкоз Раушера (ЛР) (эритробластный лейкоз) развивается у мышей к 15-17 суткам после перевивки опухолевых клеток, источником которых служит селезенка больных животных. Заражение мышей проводят путем перевивки 10-12 млн кл/мышь, внутрибрюшинно. Развитие заболевания регистрируют по весу селезенок больных животных.
Исследуют влияние пептида γ-D-Glu-D-Trp на фазу инициации ЛР, а также используют его в качестве терапевтического средства при уже сформировавшемся лейкозе. Каждая экспериментальная группа содержит 10 мышей. В первом случае препарат начинают вводить через 24 часа после перевивки, инъецируют ежедневно, в течение 14 дней (10 мкг/кг, внутрибрюшинно). Контрольным животным в обоих случаях вводят физиологический раствор в те же сроки. На 17-е сутки у экспериментальных животных определяют вес селезенок. Из полученных результатов, представленных в таблице 1, можно сделать вывод, что пептид γ-D-Glu-D-Trp не интенсифицирует развитие ЛР (не оказывает влияния на фазу инициации лейкоза).
При использовании для лечения ЛР пептид γ-D-Glu-D-Trp начинают вводить с 15 суток после прививки лейкозных клеток. Инъекции проводят в течение 3 недель, ежедневно, пятидневными курсами с двухдневным перерывом между ними, 10 мкг/кг, внутрибрюшинно. На 40-й день после перевивки клеток у животных определяют вес селезенок. Полученные экспериментальные данные (таблица 13) свидетельствуют, что лечение пептидом γ-D-Glu-D-Trp приводит к статистически достоверному снижению веса селезенок больных мышей.
| Таблица 13. | ||
| Влияние пептида γ-D-Glu-D-Trp на фазу инициации (17 сутки) и развитие (50 сутки) Лейкоза Раушера (по тесту веса селезенок) | ||
| Группа | Средний вес селезенки (мг) на | |
| 17 сутки | 40 сутки | |
| Физиологический раствор | 197,5±,0 | 374,0±7,0 |
| Пептид γ-D-Glu-D-Trp | 173,0±8,0 | 149,0±6,0* |
| Вес селезенок интактных мышей - 73,3±4,8 мг | ||
| * р<0,05 по отношению к контролю. |
Таким образом, пептид γ-D-Glu-D-Trp обладает определенным лечебным и ингибирующим действием на развитие лейкоза Раушера при введении животным.
Пример 5. (Влияние пептида γ-D-Glu-D-Trp на рост тимомы EL-4)
Исследование проведено на мышах линии С57В1/6, самках. Клетки тимомы EL-4, (106 клеток/0,1 мл) прививают мышам-реципиентам под кожу спины. Пептид γ-D-Glu-D-Trp (10 мкг/кг) вводят мышам-реципиентам внутрибрюшинно, начиная с 3-х суток после прививки опухоли, пятидневными курсамис двухдневными перерывами между ними в течение 3-х недель. Каждая экспериментальная группа содержит 14 мышей. За ростом опухоли EL-4 и выживаемостью мышей-опухоленосителей наблюдают 60 суток. Данные, приведенные в таблице 15, свидетельствуют, что в результате лечения пептидом γ-D-Glu-D-Trp наблюдается уменьшение размеров опухолевого узла до 16 сут роста, однако на выживаемость и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) мышей-опухоленосителей препарат существенного влияния не оказывает.
| Таблица 15. | |||||
| Влияние γ-D-Glu-D-Тгр на рост тимомы EL-4 | |||||
| Группа | Размер опухоли мм2 | ||||
| 8 сутки | 10 сутки | 12 сутки | 14 сутки | 16 сутки | |
| Контроль | 30,8±6,2 | 90,4±11,2 | 255,5±30,5* | 487,4±74,8* | 543,4±91,5 |
| Пептид γ-D-Glu-D-Trp | 14,0±3,3 | 80,0±9,3 | 155,7±18,3* | 228,3±51,2* | 247,8±89,6 |
| * - р<0,05 |
Таким образом, использование заявленного способа приводит к статистически достоверному снижению количества метастазов в легкие по сравнению с контролем в 2-4 раза. Так, введение пептида формулы γ-D-Glu-D-Trp в сочетании с платинолом приводит к снижению количества спонтанных метастазов в легкие почти в 4 раза.
Кроме того, пептид способен усиливать в определенной мере противоопухолевое действие облучения и цитостатиков и оказывать радиопротекторное действие на начальные этапы гемопоэза при отсутствии такового в отношении клеток опухоли.
Способ лечения злокачественных новообразований, включающий введение лекарственного препарата, отличающийся тем, что в качестве лекарственного препарата используют пептид формулы γ-D-Glu-D-Trp, причем перед введением пептида проводят локальное облучение новообразования.
