Способ оценки генетического риска сердечно-сосудистых заболеваний у спортсменов



Владельцы патента RU 2322193:

Федеральное государственное учреждение "Учебно-научный медицинский центр" Управления делами Президента Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии и спортивной медицине. Способ позволяет повысить воспроизводимость, надежность и точность прогноза развития осложнений, обусловленных генетическими факторами. Проводят определение полиморфных маркеров генов-кандидатов, при этом выполняют генетическое исследование крови спортсмена, определяют предрасполагающие и защищающие аллели и генотипы полиморфных маркеров генов-кандидатов: для ишемической болезни сердца маркер Т174М гена AGT предрасполагающая аллель М и защищающая аллель Т, маркер A(-153)G гена AT2R1 предрасполагающие генотипы AG, GG и аллель G и защищающие генотип АА и аллель А, маркер А1298С гена MTHFR предрасполагающие генотип СС и аллель С и защищающая аллель А, маркер С825Т гена GNB3 предрасполагающий генотип СС, маркер Ala(-9) Val гена SOD2 предрасполагающие генотип АА и аллель А и защищающие генотип W и аллель V, маркер Т(-262)С гена CAT предрасполагающий генотип СС, маркер Cys311Ser гена PON2 предрасполагающий генотип Ser/Ser и защищающий генотип Cys/Ser, маркер I/D гена ApoB предрасполагающие генотип I/I и аллель I и защищающие генотипы ID и DD и аллель D; для гипертонической болезни маркер Ser447Ter гена LPL предрасполагающая аллель Ser и защищающая аллель Тег, маркер Рrо12Ala гена PPARG2 предрасполагающая аллель Ala и защищающие генотип Pro/Pro и аллель Pro, маркер А1298С гена MTHFR предрасполагающая аллель С и защищающие генотип АА и аллель А, маркер Т(9282) гена CAT предрасполагающий генотип ТС и защищающий генотип СС, маркер Lys198Asn гена END1 предрасполагающий генотип Lys/Lys; для гипертонического сердца маркер 4а/4b гена NOS3 предрасполагающие генотип 4b/4а и аллель 4а и защищающие генотип 4b/4b и аллель 4b, маркер А(-153)G гена AT2R1 предрасполагающие генотип AG и аллель G и защищающие генотип АА и аллель А, маркер А1298С гена MTHFR предрасполагающие генотип СС и аллель С и защищающая аллель А, маркер G7831A генаАСЕ предрасполагающие генотипы GA и АА и аллель А и защищающие генотип GG и аллель G и делают заключение о предрасположенности при количественном преобладании предрасполагающих генотипов и аллелей, а о генетической защите от развития патологии при равном значении предрасполагающих и защищающих генотипов и аллелей или количественном преобладании защищающих. 11 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике, и может быть использовано в кардиологии, спортивной медицине.

Медико-техническое решение (сущность) заключается в том, что определяют генотипы полиморфных маркеров генов АСЕ, AGT, AT2R1, АРОВ, LPL, EDN1, PON2, MTHFR, NOS3, SOD2, CAT, PPARG2, GNB3, рассчитывают относительный риск, ассоциированный с конкретным генотипом по табличным данным, выполняют оценку индивидуального риска развития сердечно-сосудистых заболеваний у спортсменов, генотип или аллель считают предрасполагающим при относительном риске больше 1,5 и защитным при относительном риске меньше 0,7.

Известны способы-аналоги предложенного изобретения. Так, для оценки риска инфаркта миокарда у молодых мужчин можно использовать полиморфный маркер I/D гена АСЕ. Показано, что носители аллеля D имеют более высокий риск инфаркта миокарда в молодом возрасте [1]. В опубликованном в 1992 г. исследовании было показано, что с помощью определения генотипа полиморфных маркеров Т174М и М235Т гена AGT можно оценивать риск развития артериальной гипертонии. В качестве одного из основных генов-кандидатов, ассоциированных с развитием спортивного сердца, рассматривается ген ангиотензиногена [2]. С большим индексом массы миокарда у спортсменов ассоциирован аллель 235Т этого гена [3].

Известен способ [4], выбранный в качестве прототипа. С помощью исследования полиморфизма гена АСЕ определяется предрасположенность к длительной физической работе. Этому способу присущи недостатки: использован только один полиморфный маркер одного гена кандидата. Определение полиморфизма гена-кандидата проводят из промывной жидкости ротовой полости. Выполнение данного способа у спортсменов с целью оценки риска сердечно-сосудистых заболеваний не позволяет по одному маркеру сделать заключение о предрасположенности к неблагоприятному воздействию интенсивных аэробных нагрузок на состояние сердечно-сосудистой системы. Кроме того, выделение ДНК из промывной жидкости ротовой полости снижает точность определения аллелей и генотипов полиморфных маркеров.

В предложенном изобретении решена задача повышения надежности, воспроизводимости и точности оценки индивидуального риска поражения сердечно-сосудистой системы.

Указанная задача решена тем, что по результатам наблюдений формируют таблицы генотипов полиморфных маркеров генов-кандидатов и определяют относительный риск развития патологии, выполняют генетическое исследование крови спортсмена, сопоставляют данные генотипов его генов-кандидатов с табличными показателями относительного риска, при относительном риске больше 1,5 делают заключение о предрасположенности, при относительном риске меньше 0,7 - о генетической защите от развития патологии.

Способ выполняют в следующей последовательности:

1. Формируют группу наблюдений

Для этого формируют группы здоровых и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. Группы набирают из спортсменов, закончивших спортивную карьеру. Для определения отношения шансов проводят сравнение частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов-кандидатов в группах здоровых и больных.

2. Формируют таблицу относительного риска

Расчет относительного риска проводят на популяционной выборке, сформированной по типу случай-контроль. В нашем исследовании было обследовано 118 бывших спортсменов, страдающих ИБС, и 229 здоровых лиц, сопоставимых по возрасту и полу и имеющих в анамнезе интенсивные аэробные нагрузки (спорт высоких достижений). По основным клиническим характеристикам группы достоверно не различались (таблица 1).

Таблица 1
Клиническая характеристика больных ИБС и контрольной группы
Клиническая характеристикаБывшие спортсмены, страдающие ИБС, N=118Контрольная группа (N=229)
Средний возраст, лет56,89±11,8356,85±0,73
Мужчины/женщины44,4%/55,6%52%/48%
Средний ИМТ, кг/м225,56±3,6625,3±0,31
ИМТ>25 кг/м248,8%44,4%
Гиперлипидемия (ОХС>5,2 ммоль/л)51,2%51,6%
Сахарный диабет, тип 26,6%6,1%
Курение24,2%26,8%
Курение в анамнезе12,9%16,2%

В группах случай и контроль проводят сравнение частот аллелей и генотипов выбранных полиморфных маркеров генов-кандидатов. Сравнение частот проводят по критерию χ2 Pearson, коррекцию Yates применяли для таблиц сопряженности с 1 степенью свободы (2×2). Относительный риск и доверительный интервал связи с заболеванием оценивали с помощью однофакторного регрессионного анализа с помощью статистического пакета программ SPSS 13.0.

Для оценка ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов с артериальной гипертонией было обследовано 211 здоровых лиц, занимавшихся интенсивными физическими нагрузками, и 202 бывших спортсмена, страдающих артериальной гипертонией. По основным клиническим характеристикам группы не различались (таблица 2).

Таблица 2
Клиническая характеристика больных АГ и контрольной группы
ПоказательЗдоровые (n=211)Больные сАГ (n=202)p
Возраст, годы59,7±0,7860,9±0,88нд
Пол (м/ж)130/81103/99нд
Индекс Кетле, более 25 кг/м2151 (73,7%)148 (78,3%)нд
Курение (n,%)61 (28,9%)40 (19,8%)нд
Креатинин, мкмоль/л82,4±3,9083,2±3,49нд
Уровень ОХ, ммоль/л5,94±0,0966,24±0,130нд
Уровень ХС ЛНП, ммоль/л4,06±0,1114,17±0,133нд
Уровень ХС ЛВП, ммоль/л1,15±0,0271,12±0,032нд
Уровень ТГ, ммоль/л2,30±0,1382,55±0,125нд

Различия частот аллелей и генотипов генов-кандидатов и относительный риск рассчитывают, как указано ранее.

Для оценки ассоциации полиморфных маркеров с гипертрофией миокарда обследуют группы больных с гипертрофией миокарда и без нее. Было обследовано 137 бывших спортсменов без ГЛЖ и 106 - с ГЛЖ. Группы были сопоставимы по основным характеристикам (таблица 3)

Таблица 3
Клиническая характеристика больных с ГЛЖ и контрольной группы
ПоказательНет ГЛЖ n=137Есть ГЛЖ n=106P
Возраст, годы53,41±0,9252,77±1,0нд
Пол (м/ж)86/5164/42нд
Индекс Кетле, кг/м227,6±0,4426,8±0,45нд
Индекс Кетле, более 25 кг/м2114(83,2%)81 (76,4%)нд
Курение23(16,8%)24 (22,6%)нд
Сахарный диабет27(19,7%)11 (10,4%)нд
Длительность АГ, годы110,9±016,75±1,92<0,001

Достоверность различий, относительный риск и доверительный интервал рассчитывают, как описано ранее.

Значения относительного риска для всех причинных генотипов приведены в таблицах 4-6.

Таблица 4
Риск ишемической болезни сердца, ассоциированный с генотипами и аллелями основных генов-кандидатов.
ГенотипОтносительный риск [95% CI]
12
Полиморфный маркер Т174М гена AGT
Генотипы
ТТ
ТМ
ММ
Аллели
Т0,43 [0,28-0,66]
М2,32 [1.51-3,55]
Полиморфный маркер A(-153)G гена AT2R1
Генотипы
АА0,13 [0,07-0,22]
AG4,76 [2.76-8,13]
GG2,83 [1,19-6,75]
Аллели
А0,26 [0,17-0,39]
G3,78 [2,53-5,67]
Полиморфный маркер А1298С гена MTHFR
Генотипы
АА
АС
СС3,23 [1,81-5,76]
Аллели
А0,61 [0,45-0,84]
С1,62 [1,18-2,21]
Полиморфный маркер С825Т гена GNB3
Генотипы
СС1,62 [1,07-2,45]
СТ
ТТ
Аллели
С
Т
Полиморфный маркер Ala(-9)Val гена SOD2
Генотипы
VV0,24 [0,13-0,45]
VA
АА2,30 [1,27-4,19]
Аллели
V0,47 [0,33-0,48]
А2,12 [1,49-3,02]
Полиморфный маркер T(-262)C гена CAT
Генотипы ТТ
TT
TC
СС1,97 [1,10-3,52]
Аллели
Т
С
Полиморфный маркер Сys311Ser гена PON2
Генотипы
Cys/Cys
Cys/Ser0,41 [0,26-0,64]
Ser/Ser1,92 [1,23-3,01]
Аллели
Cys
Ser
Полиморфный маркер I/D гена АроВ
Генотипы
I/I2,14 [1,12-4,08]
I/D0,57 [0,30-1,09]
D/D0,47 [[0,14-1,62]
Аллели
I1,81 [1,09-3,00]
D0,55 [0,33-0,92]

Таблица 5
Риск гипертонической болезни, ассоциированный с генотипами и аллелями основных генов-кандидатов
ГенотипОтносительный риск [95% CI]
Полиморфный маркер Ser447Ter гена LPL
Генотипы
Ser/Ser
Ser/Ter
Ter/Ter
Аллели
Ser1,51 [1,01-2,34]
Ter0,66 [0,42-0,99]
Полиморфный маркер Рrо12Ala гена PPARG2
Генотипы
Pro/Pro0,64 [0,41-0,98]
Pro/Ala
Ala/Ala
Аллели
Pro0,64 [0,43-0,94]
Ala1,87 [1,29-2,69]
Полиморфный маркер А1298С гена MTHFR
Генотипы
АА0,61 [0,38-0,98]
АС
СС
Аллели
А0,76 [0,58-0,99]
С1,30 [1,02-1,78]
Полиморфный маркер Т(-262)С гена CAT
Генотипы
ТТ
TC1,56 [1,01-2,48]
СС0,51 [0,29-0,86]
Аллели
Т
С
Полиморфный маркер Lys198Asn гена END1
Генотипы
Lys/Lys0,63 [0,38-0,97]
Lys/Asn
Asn/Asn
Аллели
Lys
Asn

Таблица 6
Риск «спортивного сердца», ассоциированный с генотипами и аллелями основных генов-кандидатов
ГенотипОтносительный риск [95% CI]
Полиморфный маркер 4а/4b гена NOS3
Генотипы
4b/4b0,43 [0,23-0,79]
4b/4a2,10 [1,14-3,86]
4а/4а
Аллели
4b0,59 [0,37-0,93]
1,68 [1,07-2,62]
Полиморфный маркер A(-153)G гена AT2R1
Генотипы
АА0,31 [0,13-0,71]
AG2,23 [1,02-5,26]
GG
Аллели
А0,39 [0,20-0,75]
G2,55 [1,33-4,91]
Полиморфный маркер А1298С гена MTHFR
Генотипы
АА
АС
СС3,79 [1,13-12,69]
Аллели
А0,54 [0,31-0,94]
С1,83 [1,05-3,17]
Полиморфный маркер G7831A гена АСЕ
Генотипы
GG0,29 [0,13-0,64]
GA2,82 [1,35-5,88]
АА1,25 [0,34-4,57]
Аллели
А1,86 [1,09-3,17]
G0,53 [0,31-0,91]

3. Формируют таблицы причинных генотипов и аллелей генов-кандидатов

Причинными считают аллели и генотипы, достоверно связанные с заболеванием в однофакторном регрессионном анализе (таблицы 7-9).

Таблица 7
Предрасполагающие и защитные аллели и генотипы ишемической болезни сердца у спортсменов
ПредрасполагаютЗащищают
Полиморфный маркер Т174М гена AGT
Аллель МАллель Т
Полиморфный маркер A(-153)G гена AT2R1
Генотипы AG, GGГенотип АА
Аллель GАллель А
Полиморфный маркер А1298С гена MTHFR
Генотип СС
Аллель САллель А
Полиморфный маркер С825Т гена GNB3
Генотипы СС1.62 [1.07-2.45]
Полиморфный маркер Ala(-9)Val гена SOD2
Генотип ААГенотип W
Аллель ААллель V
Полиморфный маркер Т(-262)С гена CAT
Генотип СС
Полиморфный маркер Сys311Ser гена PON2
Генотип Ser/SerГенотип Cys/Ser
Полиморфный маркер I/D гена АроВ
Генотип I/IГенотипы ID и DD
Аллель IАллель D

Таблица 8
Предрасполагающие и защитные аллели и генотипы гипертонической болезни у спортсменов
ПредрасполагаютЗащищают
Полиморфный маркер Ser447Ter гена LPL
Аллель SerАллель Ter
Полиморфный маркер Рго12Ala гена PPARG2
Генотип Pro/Pro
Аллель AlaАллель Pro
Полиморфный маркер А1298С гена MTHFR
Генотип АА
Аллель САллель А
Полиморфный маркер Т(-262)С гена CAT
Генотип ТСГенотип СС
Полиморфный маркер Lys198Asn гена END1
Генотип Lys/Lys

Таблица 9
Предрасполагающие и защитные аллели и генотипы гипертонического сердца у спортсменов
ПредрасполагаютЗащищают
Полиморфный маркер 4а/4b гена NOS3
Генотип 4b/4аГенотип 4b/4b
Аллель 4аАллель 4b
Полиморфный маркер A(-153)G гена AT2R1
Генотип AGГенотип АА
Аллель GАллель А
Полиморфный маркер А1298С гена MTHFR
Генотип СС
Аллель САллель А
Полиморфный маркер G7831A гена АСЕ
Генотипы GA и ААГенотип GG
Аллель ААллель G

4. Детальное описание способа

Выполняют исследование отдельного спортсмена

Определение аллелей полиморфных маркеров генов-кандидатов проводят с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) [5].

Для проведения исследования выполняют взятие венозной крови в стерильные пробирки типа "вакутейнер" с ЭДТА. Образцы при необходимости замораживают и до проведения исследования хранят при температуре -50÷-70°С.

Выделение геномной ДНК из венозной крови обследуемых проводят методом фенол-хлороформной экстракции. Агарозные гели окрашивают бромистым этидием, полиакриламидные - нитратом серебра.

Определение аллелей и генотипов основных генов-кандидатов проводят по описанным ниже методикам.

Полиморфный маркер G7831A гена АСЕ в интроне 7

Определение аллелей и генотипов полиморфного маркера G7831A гена АСЕ проводят с использованием следующих праймеров:

АСЕ-Р1 5'-ctcggcttgggacttcta-3' и

АСЕ-Р2 5'-agagctggtccatcgtga-3'.

После амплификации получают фрагмент ДНК длиной 800 п.н., который инкубируют с рестриктазой PstI в буфере, с последующим электрофоретическим разделением полученных фрагментов ДНК в 1,5%-ном агарозном геле. Фрагмент ДНК, содержащий аллель G, расщепляется с образованием двух фрагментов, приблизительно, 600 и 200 п.н. длиной, в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель А, не расщепляется рестриктазой PstI. Таким образом, в случае генотипа АА наблюдают одну полосу длиной 800 п.н., в случае генотипа GG наблюдают две полосы (600 и 200 п.н.) и в случае GA наблюдают 3 полосы (800, 600 и 200 п.н.).

Полиморфный маркер A(-153)G гена рецептора ангиотензина II типа 1

Для анализа ассоциации гена рецептора ангиотензина II типа 1 (AT2R1) используют полиморфный однонуклеотидный маркер, представленный двумя аллелями А и G (остаток аденина и гуанина) в позиции -153. Для амплификации фрагмента ДНК, содержащего данный полиморфный маркер, используют следующие праймеры:

AT1R-L 5`-cctgcaccatgttttgaggttgagtgac-3` и

AT1R-R 5`-aaaataacaggacaaaagcaggctagggag-3`

В результате амплификации участка ДНК, содержащего данную полиморфную последовательность, получается фрагмент ДНК длиной 352 п.н. Для идентификации аллелей маркера A(-153)G фрагмент ДНК, образующийся после амплификации, расщепляют рестриктазой BstDEI. Фрагмент ДНК, содержащий аллель (-153)G, расщепляется рестриктазой BstDEI, образуя продукты размером 114 и 238 п.н., в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель А(-153), остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 352 п.н. после обработки BstDEI соответствует генотипу АА, двух фрагментов (114 и 238 п.н.) - генотипу GG и трех (114, 238 и 352 п.н.) - гетерозиготному генотипу AG.

Полиморфный маркер Thr174Met гена ангиотензиногена (AGT)

Для определения генотипов полиморфного маркера Thr174Met гена AGT используют следующие праймеры:

AGT1 5'-gatgcgacaaggtcctg-3' и

AGT2 5'-cagggtgctgtccactggctcgc-3'.

Для идентификации аллелей полиморфного участка Thr174Met гена AGT к 15 мкл амплификационной смеси добавляют 2 мкл 10-кратного буфера Y, содержащего 33 мМ Трис-ацетат, рН 7,9; 10 мМ ацетат калия и 66 мМ ацетат натрия, 2 мкл БСА (1 мг/мл) и 0,5 мкл рестриктазы NcoI (10 ед./мкл). Пробы выдерживают в течение 3 ч при 37°С. Продукты расщепления разделяют с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Гель окрашивают бромистым этидием.

В результате амплификации получают фрагмент длиной 303 п.н. Фрагмент ДНК, содержащий аллель Met, расщепляется рестриктазой NcoI, образуя продукты размером 197 и 106 п.н., а фрагмент ДНК, содержащий аллель Thr, остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 303 п.н. после обработки NcoI соответствует генотипу ТТ, двух фрагментов (197 и 106 п.н.) - генотипу ММ и трех (106, 197 и 303 п.н.) - гетерозиготному генотипу ТМ.

Полиморфный маркер А1166С гена рецептора ангиотензина II типа 1

Для анализа ассоциации гена рецептора ангиотензина II типа 1 (AT2R1) используют полиморфный однонуклеотидный маркер, представленный двумя аллелями А и С (остаток аденина и цитозина в позиции 1166) в 3'-нетранслируемой области гена. Для амплификации фрагмента ДНК, содержащего данный полиморфный маркер, используют следующие праймеры:

AT1R-L 5`-cctgcaccatgttttgaggttgagtgac-3` и

AT1R-R 5`-aaaataacaggacaaaagcaggctagggag-3`.

В результате амплификации участка ДНК, содержащего данную полиморфную последовательность, получается фрагмент ДНК длиной 352 п.н. Для идентификации аллелей маркера А1166С фрагмент ДНК, образующийся после амплификации, расщепляют рестриктазой BstDEI. Фрагмент ДНК, содержащий аллель С1166, расщепляется рестриктазой BstDEI, образуя продукты размером 114 и 238 п.н., в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель А1166, остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 352 п.н. после обработки BstDEI соответствует генотипу АА, двух фрагментов (114 и 238 п.н.) - генотипу СС и трех (114, 238 и 352 п.н.) - гетерозиготному генотипу АС.

Полиморфный маркер 4а/4b гена эндотелиальной NO-синтетазы

Для анализа ассоциации гена эндотелиальной NO-синтетазы (NOS3) используют полиморфный маркер ecNOS4a/4b, расположенный в интроне 4 гена. Для амплификации фрагмента ДНК, содержащего этот полиморфный маркер, применяют следующие праймеры:

NOS3-VNTR1 5'-aggccctatggtagtgccttt-3' и

NOS3-VNTR2 5'- tctcttagtgctgtggtcat-3'.

Амплификацию фрагмента гена NOS3, содержащего полиморфный мини-сателлитный маркер ecNOS4a/4b, проводят в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Трис-HCl, рН 8,8; 16,7 мМ сульфат аммония, 1,0 мМ хлорид магния, по 0,2 мМ каждого dNTP, 0,1%-ный Твин-20, 10%-ный диметилсульфоксид, по 5 пикомолей каждого из праймеров, 50-100 нг геномной ДНК человека и 2 ед. полимеразы Taq. ПЦР проводят по программе: первый цикл - 94°С/3 мин, следующие 35 циклов - 94°С/1 мин, 60°С/1 мин, 72°С/1 мин, последний цикл - 72°С - 6 мин.

Идентификацию аллелей проводят после электрофоретического разделения амплифицированных фрагментов ДНК в 2%-ном агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием. Аллель 4а имеет длину 393 п.н. и аллель 4b - 420 п.н.

Полиморфный маркер Lys198Asn гена эндотелина I

Мононуклеотидный полиморфизм G/T гена эндотелина I (EDN1), расположенный в экзоне 4 в положении 9272, соответствует аминокислотному полиморфизму в положении 198 полипептидной цепи (Lys198Asn).

Для амплификации фрагмента ДНК, содержащего полиморфный маркер Lys198Asn, используют следующие праймеры:

EDN1.1F 5'-atgatcccaagctgaaaggcta-3'

EDN1.1R 5'-cagggctctccgtggaggctat-3'.

Условия амплификации: реакцию проводят в две стадии: 10 циклов при температуре отжига 57°С и 25 циклов при температуре отжига 61°С. Используется концентрация Мg2+ - 2,0 mM. В результате амплификации участка ДНК, содержащего данную полиморфную последовательность, образуется фрагмент ДНК длиной 116 п.н. Фрагмент ДНК, содержащий аллель Lys, расщепляется рестриктазой NheI, образуя продукты размером 19 и 97 п.н., в то время, как фрагмент ДНК, содержащий аллель Asn, остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 116 п.н. после обработки NheI соответствует генотипу Asn/Asn, двух фрагментов (19 и 97 п.н.) - генотипу Lys/Lys и трех (116, 97 и 19 п.н.) - гетерозиготе Asn/Lys.

Полиморфный маркер I/D гена АРОВ

Определение аллелей и генотипов полиморфного маркера I/D гена АРОВ проводят с использованием следующих праймеров:

ApoB-L 5'-cagctggcgatggacccgccga-3' и

ApoB-R 5'-accggccctggcgcccgccagca-3'.

Наличие только фрагмента длиной 92 п.н. после электрофоретического разделения соответствует генотипу II, наличие фрагмента длиной 83 п.н. - генотипу DD и наличие двух фрагментов 92 и 83 п.н. - гетерозиготному генотипу ID.

Полиморфный маркер Ser447Ter гена LPL

Полиморфный маркер представлен двумя аллелями С и G, что приводит к полиморфизму аминокислотных остатков в положении 447 (Ser и терминирующий кодон - Ter). Определение аллелей и генотипов полиморфного маркера Ser447Ter гена LPL проводят с использованием следующих праймеров:

LPL-F 5'-catccattttcttccacaggg-3' и

LPL-R 5'-tagcccagaatgctcaccagact-3'.

В обратный праймер вводят нуклеотидную замену для создания искусственного участка узнавания рестриктазы Hinf I.

После расщепления амплифицированного фрагмента рестриктазой Hinf I фрагмент ДНК, содержащий аллель С, остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 141 п.н. после обработки рестриктазой Hinf I соответствует генотипу СС, двух фрагментов (118 и 23 п.н.) - генотипу GG и трех (141, 118 и 23 п.н.) - гетерозиготному генотипу GC.

Полиморфный участок Ala(-9)Val гена SOD2

Полиморфный участок Ala(-9)Val гена SOD2 амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 50 мкл среды, содержащей 67 мМ Трис-HCl, рН 8,8; 16,7 мМ хлорид аммония, 1,0 мМ MgCl2, 0,1% Твин-20, 10% ДМСО, 0,2 мМ каждого dNTP, 2,5 ед. ДНК-полимеразы Taq, 50-100 нг геномной ДНК и по 33 нг праймеров:

SOD2-16F2 5'-ccagcaggcagctggcaccg-3'

SOD2-16R2 5'-tccagggcgccgtagtcgtagg-3'

Условия амплификации фрагмента ДНК: 94°C/3 мин - 1-й цикл; 94°С/1 мин, 60°С/1 мин, 72°С/1 мин - 35 циклов; 72°С/6 мин - последний цикл. Размер продукта амплификации: 91 п.н.

Расщепление рестриктазой AsiAl амплифицированного фрагмента ДНК проводят в буфере В+/Tango (10 мМ Трис-HCl, рН 7,5; 10 мМ хлорид магния, 1 мг/мл БСА) при 37°С в течение 3-16 часов в присутствии 0,3-1 ед. рестриктазы AsiAl.

Фрагмент ДНК, содержащий аллель Val, расщепляется рестриктазой AsiAI, образуя продукты размером 74 и 17 п.н., в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель А/а, остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 91 п.н. после обработки рестриктазой AsiAl соответствует генотипу Ala/Ala, двух фрагментов (74 и 17 п.н.) - генотипу Val/Val и трех (91, 74 и 17 п.н.) - гетерозиготному генотипу Ala/Val. Электрофоретическое разделение амплифицированных фрагментов ДНК и продуктов расщепления рестриктазы AsiAl проводят в 8% ПААГ с последующей окраской нитратом серебра,

Полиморфный участок Т(-262)С гена CAT

Полиморфный участок Т(-262)С гена CAT амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 50 мкл среды, содержащей 67 мМ Трис-HCl, рН 8,8; 16,7 мМ хлорид аммония, 2,0 мМ MgCl2, 0,1% Твин-20, 10% ДМСО, 0,2 мМ каждого dNTP, 2,5 ед. ДНК-полимеразы Taq, 50-100 нг геномной ДНК и по 33 нг праймеров:

CAT262F 5'-agagcctcgccccgccggaccg-3'

CAT262R 5'-taagagctgagaaagcatagct-3'.

Условия амплификации фрагмента ДНК: 94°С/3 мин - 1-й цикл; 94°С/1 мин, 60°С/1 мин, 72°С/1 мин - 35 циклов; 72°С/6 мин - последний цикл. Размер продукта амплификации 185 п.н.

Фрагмент ДНК, содержащий аллель С, расщепляется рестриктазой Smal, образуя продукты размером 155 и 30 п.н., в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель Т, остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 185 п.н. после расщепления рестриктазой Smal соответствует генотипу Т/Т, двух фрагментов 155 и 30 п.н. - генотипу С/С и трех (185, 155 и 30 п.н.) - гетерозиготному генотипу Т/С.

Полиморфный маркер А1298С гена MTHFR

Для амплификации фрагмента ДНК, содержащего точечную замену в положении 1298 (А1298С) в экзоне 7 гена 5,10-метилентетрагидрофолейтредуктазы, используют следующие праймеры:

MTHFR-1 5'-agatgtggggggaggagctgaccagtgcag-3' и

MTHFR-2 5'-caggccaggggcaggggatgaaccag-3'.

Условия амплификации:

Первый цикл - 94°С/3 мин;

35 циклов - 94°С/40 сек, 61,5°С/40 сек, 72°С/40 сек;

последний цикл - 72°С/7 мин.

В результате амплификации участка ДНК, содержащего данную полиморфную последовательность, получается фрагмент ДНК длиной 143 п.н. Фрагмент ДНК, содержащий аллель С 1298, расщепляется рестриктазой Fnu 4 Н1, образуя продукты размером 115 и 28 п.н., в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель А, остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 143 п.н. после обработки Fnu 4 Н1 соответствует генотипу АА, двух фрагментов (115 и 28 п.н.) генотипу СС и трех (143, 115 и 28 п.н.) - гетерозиготе АС.

Полиморфный маркер Рrо12Ala гена PPARG2

Мононуклеотидный полиморфизм C/G гена PPARG2, расположенный в 1 экзоне в положении 34, приводит к аминокислотной замене Рrо12Ala. Для амплификации фрагмента ДНК, содержащего полиморфный маркер Рrо12Ala, используют следующие праймеры:

PPARG2-01 5'-ctgggagattctcctattggc-3'

PPARG2-02 5'-ctggaagacaactacaagag-3'.

Условия амплификации. Реакцию проводили по стандартной схеме: 35 циклов при температуре отжига 55°С. Использованная концентрация Мg2+ - 2,0 mM. В результате амплификации участка ДНК, содержащего данную полиморфную последовательность, образуется фрагмент ДНК длиной 153 п.н. Фрагмент ДНК, содержащий аллель С (Pro), расщепляется рестриктазой HaeIII, образуя продукты размером 133 и 20 п.н.; в то время, как фрагмент ДНК, содержащий аллель G (А/а), остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 153 п.н. после обработки HaeIII соответствует генотипу GG, двух фрагментов (133 и 20 п.н.) - генотипу СС и трех (153, 133 и 20 п.н.) - гетерозиготе GC.

Полиморфный маркер С825Т гена, кодирующего субъединицу β3 протеина G (GNB3)

Полиморфный участок С825Т гена GNB3 (однонуклеотидный полиморфизм С/Т в экзоне 10 в положении 825 по последовательности мРНК) амплифицируют с помощью ПЦР в 50 мкл среды, содержащей 15 мМ Трис-HCl, рН 8,8; 75 мМ KCl, 2,0 мМ MgCl2, по 0,2 мМ каждого dNTP, 2,5 ед. ДНК-полимеразы Taq, 50-100 нг геномной ДНК и по 33 нг праймеров:

СNВ3F+5500 5`-gtctgatccctgacccactt-3`

GNB3R+5500 5`-ccttacccacacgctcagac-3`.

Условия амплификации: 94°С/2 мин - 1-й цикл; 94°С/10 сек, 65°С/40 сек, 72°С/20 сек - 35 циклов; 72°С/6 мин - последний цикл. Размер продукта амплификации: 260 п.н. Для идентификации аллелей полиморфного маркера С825Т гена GNB3 используют расщепление амплифицированного фрагмента ДНК рестриктазой BssECl или BseDl. Расщепление рестриктазами проводили в 20 мкл буферов, при 37°С в случае BssECl и 55°С в случае BseDl, используя 1-3 ед. рестриктазы на пробу в течение 2-3 ч. Фрагмент ДНК, содержащий аллель Т, остается нерасщепленным. Фрагмент ДНК, содержащий аллель С, расщепляется рестриктазами BssECl или BseDl, образуя продукты размером 163 и 97 п.н. Наличие фрагмента длиной 260 п.н. после обработки рестриктазами BssECl или BseDl соответствует генотипу ТТ, двух фрагментов (163 и 97 п.н.) - генотипу СС и трех (260, 163 и 97 п.н.) - гетерозиготному генотипу CT. Электрофоретическое разделение амплифицированных фрагментов ДНК и фрагментов ДНК, образующихся при действии рестриктазы BssECl или BseDl, проводят в 2% агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием.

5. Сопоставляют данные спортсмена с табличными.

6. В случае относительного риска больше 1,5 делают заключение о наличии генетической предрасположенности, при относительном риске менее 0,7 - о защитном генотипе

7. Пример 1

У пациента М., 36 лет, при типировании полиморфных маркеров генов-кандидатов получены следующие генотипы (таблица 10).

Таблица 10
Генотипы полиморфных маркеров спортсмена М
МаркерГенотипOR ИБСOR АГOR ГЛЖ
Полиморфный маркер Т174М гена AGTТМ
Полиморфный маркер A(-153)G гена AT2R1AG4,732,23
Полиморфный маркер А1298С гена MTHFRАА0,610,54
Полиморфный маркер С825Т гена GNB3СТ
Полиморфный маркер Ala(-9)Val гена SOD2АА2,30
Полиморфный маркер Т(-262)С гена CATTC1,56
Полиморфный маркер Cys311Ser гена PON2Cys/Ser0,41
Полиморфный маркер I/D гена ApoBII
Полиморфный маркер Ser447Ter гена LPLSer/Ser2,141,51
Полиморфный маркер Рrо12Ala гена PPARG2Ala/Ala1,87
Полиморфный маркер Lys198Asn гена END1Lys/Asn
Полиморфный маркер 4а/4b гена NOS34a/4a1,68
Полиморфный маркер G7831A гена АСЕGG0,29

В целом у пациента отмечается высокая предрасположенность к развитию ИБС (3 предрасполагающих генотипа и 1 защитный), артериальной гипертонии (3 предрасполагающих генотипа и 1 защитный). Риска развития спортивного сердца нет - 2 предрасполагающих генотипа и 2 протективных.

8. Пример 2

У пациентки О., 31 года, при типировании полиморфных маркеров генов-кандидатов получены следующие генотипы (таблица 11).

Таблица 11
Генотипы полиморфных маркеров спортсменки 0
МаркерГенотипOR ИБСOR АГOR ГЛЖ
Полиморфный маркер Т174М гена AGTТТ0,43
Полиморфный маркер A(-153)G гена AT2R1АА0,13
Полиморфный маркер А1298С гена MTHFRАА0,610,54
Полиморфный маркер С825Т гена GNB3СТ
Полиморфный маркер Ala(-9)Val гена SOD2VV0,24
Полиморфный маркер Т(-262)С гена CATTC1,56
Полиморфный маркер Cys311Ser гена PON2Cys/Ser0,41
Полиморфный маркер I/D гена ApoBID0,57
Полиморфный маркер Ser447Ter гена LPLTer/Ter0,66
Полиморфный маркер Рrо12Ala гена PPARG2Ala/Pro
Полиморфный маркер Lys198Asn гена END1Lys/Lys0,63
Полиморфный маркер 4а/4b гена NOS34b/4b0,43
Полиморфный маркер G7831A гена АСЕGG0,29

В целом у пациентки имеется низкий риск ишемической болезни сердца (5 протективных генотипов), артериальной гипертонии (3 протективных генотипа и 1 предрасполагающий) и развития спортивного сердца - 3 протективных генотипа.

9. Эффективность способа

Предложенный способ был проведен у 137 спортсменов. Высокая предрасположенность к артериальной гипертонии выявлена у 24 человек, к ишемической болезни сердца - у 14 человек, к развитию спортивного сердца - у 18 человек. Протективные генотипы по отношению к ИБС выявлены у 24 человек, к артериальной гипертонии - у 17 человек, к развитию спортивного сердца - у 11 человек.

Выводы

Способ позволяет

1. Повысить надежность путем определения нескольких полиморфных маркеров генов-кандидатов.

2. Повысить точность комплексной оценки генетической предрасположенности к развитию поражения сердечно-сосудистой системы у спортсменов.

Список литературы

1. Cambien, F.; Poirier, O.; Lecerf, L.; Evans, A.; Cambou, J. - P.; Arveiler, D.; Luc, G.; Bard, J.-M.; Bara, L.; Ricard, S.; Tiret, L.; Amouyel, P.; Alhenc-Gelas, F.; Soubrier, F.: Deletion polymorphism in the gene for angiotensin-converting enzyme is a potent risk factor for myocardial infarction. Nature 359: 641-644, 1992.

2. Jeunemaitre, X.; Soubrier, F.; Kotelevtsev, Y.V.; Lifton, R.P.; Williams, C.S.; Charru, A.; Hunt, S.C.; Hopkins, P.N.; Williams, R.R.; Lalouel, J.-M.; Corvol, P.: Molecular basis of human hypertension: role of angiotensinogen. Cell 71: 7-20, 1992.

3. Diet F, Graf C, Mahnke N ACE and angiotensinogen gene genotypes and left ventricular mass in athletes. Eur J Clin Invest. 2001 Oct; 31 (10): 836-42.

4. Патент Российской федерации: RU 2194982 C2. Способ выявления предрасположенности к длительной физической работе.

5. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Eriich HA, Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985 Dec 20; 230 (4732): 1350-1354.

Способ оценки генетического риска сердечно-сосудистых заболеваний у спортсменов, включающий определение полиморфных маркеров генов-кандидатов, отличающийся тем, что выполняют генетическое исследование крови спортсмена, определяют предрасполагающие и защищающие аллели и генотипы полиморфных маркеров генов-кандидатов: для ишемической болезни сердца маркер Т174М гена AGT предрасполагающая аллель М и защищающая аллель Т, маркер A(-153)G гена AT2R1 предрасполагающие генотипы AG, GG и аллель G и защищающие генотип АА и аллель А, маркер А1298С гена MTHFR предрасполагающие генотип СС и аллель С и защищающая аллель А, маркер С825Т гена GNB3 предрасполагающий генотип СС, маркер Ala(-9) Val гена SOD2 предрасполагающие генотип АА и аллель А и защищающие генотип W и аллель V, маркер Т(-262)С гена CAT предрасполагающий генотип СС, маркер Cys311Ser гена PON2 предрасполагающий генотип Ser/Ser и защищающий генотип Cys/Ser, маркер I/D гена АроВ предрасполагающие генотип I/I и аллель I и защищающие генотипы ID и DD и аллель D; для гипертонической болезни маркер Ser447Ter гена LPL предрасполагающая аллель Ser и защищающая аллель Ter, маркер Рrо12Ala гена PPARG2 предрасполагающая аллель Ala и защищающие генотип Pro/Pro и аллель Pro, маркер А1298С гена MTHFR предрасполагающая аллель С и защищающие генотип АА и аллель А, маркер Т(9282) гена CAT предрасполагающий генотип ТС и защищающий генотип СС, маркер Lys198Asn гена END1 предрасполагающий генотип Lys/Lys; для гипертонического сердца маркер 4а/4b гена NOS3 предрасполагающие генотип 4b/4а и аллель 4а и защищающие генотип 4b/4b и аллель 4b, маркер A(-153)G гена AT2R1 предрасполагающие генотип AG и аллель G и защищающие генотип АА и аллель А, маркер А1298С гена MTHFR предрасполагающие генотип СС и аллель С и защищающая аллель А, маркер G7831A генаАСЕ предрасполагающие генотипы GA и АА и аллель А и защищающие генотип GG и аллель G и делают заключение о предрасположенности при количественном преобладании предрасполагающих генотипов и аллелей, а о генетической защите от развития патологии при равном значении предрасполагающих и защищающих генотипов и аллелей или количественном преобладании защищающих.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано в фармакологии, медицине и в охране окружающей среды. .

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биоорганической химии и может быть использовано для создания ДНК-чипов. .

Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии и может быть использовано для идентификации полиморфизма +1385G/A гена RNASEL при обследовании больных вирусными инфекциями.

Изобретение относится к медицине, в частности к дерматологии. .
Изобретение относится к биологии и медицине. .

Изобретение относится к молекулярной биологии, генетической инженерии, медицине. .

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и селекции сельскохозяйственных животных. .

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике и оториноларингологии. .
Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностированию структурно-функциональных изменений миокарда и других висцеральных систем организма в динамике развития метаболического синдрома.

Изобретение относится к области медицины, в частности гепатологии и инфекционным болезням, и может использоваться при диагностике цирротической стадии хронического вирусного гепатита.

Изобретение относится к медицине, в частности к функциональной диагностике, и может быть использовано для предоперационной диагностики распространения опухоли вдоль стенки пищевода.
Изобретение относится к медицине и, в частности, к нефрологии и может быть использовано для ранней неинвазивной диагностики склероза в интерстиции почек при оксалатной нефропатии у молодых лиц, в частности у девушек до 30 лет и юношей, направленных военными комиссариатами перед призывной комиссией.
Изобретение относится к медицине, конкретно к клинической физиологии дыхания, и может быть использовано в медицинских учреждениях, оснащенных бодиплетизмографическими приборами.

Изобретение относится к области медицины, в частности к хирургии, и может быть использовано для прогнозирования срока возможного возникновения тромбоэмболии легочной артерии после операции.

Изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству, и может быть использовано для прогнозирования возможности возникновения послеоперационных гнойно-воспалительных осложнений у пациенток, родоразрешенных посредством операции кесарева сечения.
Изобретение относится к области ветеринарного акушерства. .
Изобретение относится к области медицины, а именно к эндокринологии и диабетологии, и может быть использовано для прогнозирования течения заболевания с высоким риском раннего развития микрососудистых осложнений у больных сахарным диабетом 1 типа.
Изобретение относится к медицине, а именно к ортопедической стоматологии, и может быть использовано для диагностики репаративной способности тканей зубочелюстной области при установлении дентальных имплантатов пациентам из групп повышенного риска развития дентального периимплантита.

Изобретение относится к области медицины, а именно к морфологическим исследованиям в онкологии, и может быть использовано для определения эффективности неоадъювантной паратуморальной химиотерапии на аутоплазме в сочетании с лучевой терапией меланомы кожи
Наверх