Штамм lecanicillium sp. 347а - продуцент комплекса биологически активных соединений
Владельцы патента RU 2322491:
Общество с ограниченной ответственностью "Сириус" (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии, фармакологии, микробиологии, точнее к получению медицинского препарата с использованием микроорганизмов - продуцентов. Штамм Lecanicillium sp. Г16 выделен из почвенного образца Тебердинского заповедника. Депонирован в Коллекции культур микроорганизмов ГНЦА под номером 347А. Изобретение позволяет получить комплексный препарат, обладающий высокой гиполипидемической и противоопухолевой активностью и пролонгирующим действием при низких концентрациях 3 табл.
Изобретение относится к области фармакологии, микробиологии, биотехнологии, точнее к получению медицинского препарата с использованием микроорганизмов - продуцентов.
Предшествующий уровень техники
Культуры мицелиальных грибов являются источником биологически активных соединений. В клинике широко используются препараты с гиполипидемической, иммуносупрессивной, иммуностимулирующей и другими активностями. Установлена тесная связь иммунных реакций организма с его липидтранспортной системой. Большое значение имеет применение для медицинских целей липидов грибов, как эссенциальных, так и регулирующих гомеостаз макроорганизма.
Известно биологически активное соединение "ловастатин", получаемый из штамма P.cetrinum (Endo A., Kuroda M., Tsujita Y. ML-236A, ML-236B and ML-236C, new inhibitors of cholesterogenesis produced by P.cetrinum. J.Antibiot / 1976, v.29, pp. 1346-1348), который проявляет гиполипидемическую активность. Однако, его концентрация при использовании достаточно велика и он не обладает пролонгирующим действием.
Сущность изобретения
Целью изобретения является использование штамма Lecanicillium sp. 347A для получения комплексного препарата, обладающего высокой гиполипидемической и противоопухолевой активностью и пролонгирующим действием при низких концентрациях.
Штамм Lecanicillium sp. Г16 выделен из почвенного образца Тебердинского заповедника и депонирован в Коллекцию культур микроорганизмов ГНЦА под номером 347A.
Указанный штамм относится к мезофильным аэробам, его рост наблюдается в диапазоне температур 10-32°С. Хорошо сохраняется при температурах 4-8°С. Штамм сохраняет жизнеспособность при pH 3,0-8,0. При комнатной температуре и чередующемся освещении указанный штамм в течение 2 недель сохраняет способность продуцировать вторичные метаболиты.
Оптимальными для роста штамма Lecanicillium sp. 347A и образования им вторичных метаболитов являются температуры в пределах 24-26°С и pH 6,0-7,0.
Штамм Lecanicillium sp. 347A через 2 недели роста при 24°С характеризуется следующими морфологическими свойствами.
Солодовый агар: образует белые, опушенные ватообразные колонии Д=90 мм. Воздушный мицелий достигает высоты 10 мм и выше. Центр колонии более плотный, слегка приподнят. Обратная сторона - желтовато-кремовая.
На среде Райстрика - колонии белые, опушенные, ватообразные. Обратная сторона желтовато-кремовая. Д=90 мм.
Среда Чапека - колонии белые, ватообразные, несколько приплюснутые. Центр колонии слегка приподнят. Наблюдаются центрические кольца. Обратная сторона также с центрическими кольцами, кремоватая с зеленоватыми полосами. Д=40-45 мм.
Сусло-агар: Колонии белые, высокие, образуют центрические кольца: плотные в центре и к периферии более рыхлые. Высота более 10 мм, Д=40-45 мм. Обратная сторона колонии центрическими кольцами - буровато-кремовые.
Овсяный агар: колонии белые, опушенные, ватообразные Д=90 мм. Воздушный мицелий достигает высоты 10 мм. Центр колонии более плотный, слегка приподнят. Обратная сторона кремовая.
Гаузе 1: Колонии белые, рыхлые, ватообразные. Д=45-50 мм. Высота 6-8 мм. Спороносный слой в середине колонии более плотный, центр вдавлен, к периферии разреженный.
Рост и развитие культуры на агаризованных средах происходит по мицелиальному типу с образованием типичных разветвленных конидиеносцев с фиалидами, которые встречаются как единичные, так и в мутовках. На концах фиалид находятся склеенные в капельках конидии. Конидии цилиндрические с закругленными концами размером 3-5×1-2 μm, собранные в округлые головки. Хламидоспоры не наблюдаются.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.
Комплексный препарат биологически активных соединений получают выращиванием штамма в глубинных условиях на посевной и ферментационной среде одного и того же состава, содержащей органический азот (может быть представлен гороховой или соевой мукой, БВК и т.д.), углеводы (меласса, солод, сахароза, глюкоза, крахмал картофельный и т.д.), минеральные соли (хлорид натрия, фосфорнокислый калий 1 и 2-х замещенный, аммоний сульфат) и воду, pH среды 6,5-7,2. Посевная стадия длительностью 48-72 часа, объем инокулята 5-15%. Процесс ферментации осуществляют в течение 10-14 суток при 24°С в условиях аэрации. Объем среды в колбах емкостью 750 мл составляет 100-200 мл.
По окончании ферментации отделяют мицелий от нативного раствора и экстрагируют препарат органическим растворителем (ацетон, спирт). Растворитель удаляют на роторном испарителе и целевой сырец реэкстрагируют из водной взвеси петролейным эфиром. Реэкстракт осушают безводным сульфатом натрия и концентрируют до окрашенного сиропообразного продукта. Комплексный препарат осаждают гексаном.
Пример: От одного литра культуральной жидкости отделяют мицелий центрифугированием или фильтрованием. Полученный влажный мицелий (80% влажности) экстрагируют 3-х кратным объемом ацетона (по отношению к объему мицелия) в течение часа. Экстракт отделяют от мицелия фильтрованием и удаляют растворитель на роторном испарителе при 45°С. Целевой сырец реэкстрагируют из водной взвеси петролейным эфиром (2 раза по 1/4 объема от объема водной взвеси). Петролейный реэкстракт сушат безводным сульфатом натрия и концентрируют на роторном испарителе до окрашенного сиропообразного продукта. Получают 0,5 г комплексного препарата.
Биологическая активность комплексного препарата биологически активных соединений
Комплексный препарат биологически активных соединений проявляет высокую гиполипидемическую активность.
При использовании стандартной методики определения синтеза стеролов клетками культуры гепатоцитов Нер G2 по включению 3H-ацетата натрия в стеролы. Установлено, что ловастатин в дозе 200 мг/мл подавляет синтез стеролов на 50±6 (%). Комплексный препарат биологически активных соединений в разведении 1:1000 подавлял синтез стеринов на 60±2 (%).
На модели гиперлипидемии кроликов in vivo под действием комплексного препарата 347А в дозе 0,04 мг/кг показано максимальное снижение общего холестерина (ОХ) в крови кроликов на 55%, триглицеридов (ТГ) на 40%, липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) на 98% и увеличение уровня липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) на 30%. При действии контрольного препарата ловастатина в дозе 4 мг/кг наблюдается снижение ОХ на 53%, ТГ на 46‰, ЛПНП на 97% и повышение ЛПВП 18%. Под влиянием комплексного препарата 347А эффект сохраняется в течение 5 часов, в то время как действие контрольного препарата ловастатина прекращается. Сравнительные данные действия ловастатина и комплексного препарата биологически активных соединений приведены в таблице 1.
| Таблица 1 Максимальное влияние ловастатина и комплексного препарата биологически активных соединений на уровень ОХ, триглицеридов, ЛПНП и ЛПВП в сыворотке крови кроликов | |||||
| Препарат | Конц. препарата (мг/кг) | Максимальное снижение уровня ОХ (%) | Максимальное снижение уровня ТГ (%) | Максимальное увеличение уровня ХС ЛПВП (%) | Максимальное снижение уровня ХС ЛПНП (%) |
| ловастатин | 4 | 53,5 | 45,8 | 17,7 | 97,1 |
| препарат | 0,04 | 54,9 | 39,3 | 30,1 | 98,6 |
Комплексный препарат биологически активных соединений подавляет фитогемагглютинин (ФГА) индуцированную пролиферацию лимфоцитов крови доноров в концентрации 0,01-1 мкг/мл на 92-98%, что проиллюстрировано примером в таблице 2.
| Таблица 2. Подавление ФГА-индуцированной пролиферации лимфоцитов комплексным препаратом биологически активных соединений | ||||||||||
| № | Контроль (имп/мин) | Опыт (имп/мин) Жизнеспособность лимфоцитов | ||||||||
| Спонт. | ФГА | ФГА+препарат (мкг/мл) | Контроль | Опыт ФГА+препарат | ||||||
| Спонт | ФГА | |||||||||
| 1 | 0,1 | 0,01 | 0,1 | 0,01 | ||||||
| 1 | 1752 | 45673 | 1067 | 1102 | 4314 | 3 | 14 | 21 | 0,7 | 22 |
| 2 | 2483 | 53966 | 1265 | 1765 | 4491 | 0,5 | 0,9 | 14 | 14 | 15 |
| 1 | Процент подавления | 97,7 | 97,6 | 90,6 | ||||||
| 2 | Процент подавления | 97,7 | 96,7 | 91,7 |
Комплексный препарат биологически активных соединений индуцирует апоптоз трансформированных лимфоидных клеток линии Yurkat в концентрации 1-100 нг/мл на 15-20%, что проиллюстрировано примером в таблице 3.
| Таблица 3. | ||||
| Контроль | Комплексный препарат биологически активных соединений | |||
| 100 (нг/мл) | 10 (нг/мл) | 1 (нг/мл) | ||
| Гипердиплоидные | 29,79 | 32,58 | 36,35 | 28,35 |
| Диплоидные | 30,72 | 27,86 | 24,24 | 25,88 |
| Апоптоз | 16,04 | 17,77 | 19,99 | 14,13 |
| Некроз | 23,82 | 22,24 | 27,82 | 23,99 |
Таким образом, заявленный комплексный препарат биологически активных соединений проявляет гиполипидемическую активность, которая проявляется в снижении содержания в крови животных общего холестерина, триглицеридов, нормализации соотношения ЛПВП и ЛПНП, и противоопухолевую активность, индуцируя апоптоз трансформированных лимфоидных клеток линии Yurkat, при этом обладая свойством длительного действия при низкой концентрации.
Штамм Lecanicillium sp. 347A, депонирован в Коллекции культур микроорганизмов ГНЦА - продуцент комплекса биологически активных соединений, проявляющих гиполипидемическую и противоопухолевую активность и обладающих пролонгирующим действием при низких концентрациях.
