Питательная среда для выделения стрептококков

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, наиболее эффективно может быть использовано для диагностики стрептококков. Питательная среда содержит панкреатический гидролизат казеина, пептон ферментативный, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, экстракт хлебных дрожжей, лактозу, бромкрезоловый пурпуровый, глюкозу, L-цистин, сульфит натрия, цитрат натрия, азид натрия, кристаллический фиолетовый, агар микробиологический, дистиллированную воду. Изобретение позволяет повысить ростовые свойства питательной среды, придать питательной среде дифференцирующие свойства, снизить стоимость препарата. 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и может быть использовано для диагностики стрептококковых инфекций.

Постановка достоверного этиологического диагноза стрептококковых глоточных и кожных инфекций во всех случаях, кроме скарлатины, требует проведения микробиологических исследований, предусматривающих выделение и видовую идентификацию стрептококков.

До настоящего времени, в отечественной клинической практике отсутствуют коммерческие питательные среды для выделения стрептококков. Единственная коммерческая среда - среда для выделения гемокультур и культивирования стрептококков («Аллерген», г.Ставрополь) сейчас не выпускается. В клинической практике страны для выделения стрептококков используются среды лабораторного приготовления: питательный агар или триптиказо-соевый агар с добавлением 3-5% дефибринированной крови [3], питательный бульон с добавлением сыворотки крупного рогатого скота (10%) или глюкозы (0,2%) [10], мясопептонный агар с 5-7% дефибринированной крови кролика или барана [7]. Для подавления роста посторонней микрофлоры в процессе приготовления среды в лабораторных условиях добавляют антибиотики [4, 5]. Как правило, качество и стандартность таких сред, с добавлением биологических жидкостей, не всегда отвечают предъявляемым требованиям.

За рубежом разработаны питательные среды для выделения стрептококков, в которых в качестве селективного агента используется азид натрия [8, 13, 14]. Но не каждая практическая лаборатория в состоянии купить их в силу высоких цен, отсутствие же коммерческого выпуска ограничивает их применение для расшифровки стрептококкозов.

По своей направленности и совокупности признаков наиболее близкой к заявляемому изобретению является Streptosel agar, содержащий в качестве источников азотистого питания панкреатический гидролизат казеина, папаиновый гидролизат соевой муки, источника углеводного питания - глюкозу, в качестве ингибиторов грамположительной и грамотрицательной микрофлоры - азид натрия, цитрат натрия, сульфит натрия, кристаллический фиолетовый, а также L-цистин, хлорид натрия, агар [13]. Недостатками данной среды, принятой за прототип, являются следующие: Streptosel agar является зарубежной средой, дорог и недоступен для многих лабораторий страны; во-вторых, Методическими рекомендациями по микробиологической диагностике стрептококковых инфекций выделена (п.7) необходимость дифференциации гемолитических и зеленящих стрептококков с энтерококками [10]. Причиной, препятствующей достижению вышеуказанного технического результата при использовании этой среды, принятой нами за прототип, является то, что она не обладает дифференцирующими свойствами и предполагает дальнейшую идентификацию выделенных культур стрептококков по дополнительным тестам. Последнее удлиняет сроки постановки диагноза.

Задача предлагаемого изобретения - повышение ростовых и придание дифференцирующих свойств среде.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что в качестве стимуляторов роста стрептококков она дополнительно содержит пептон ферментативный, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, экстракт хлебных дрожжей [9, 11, 12]. Для придания дифференцирующих свойств в состав препарата дополнительно введена индикаторная система, состоящая из лактозы и красителя бромкрезолового пурпурового. Среда содержит также панкреатический гидролизат казеина (триптон) [9], глюкозу, цитрат натрия, сульфит натрия, L-цистин, азид натрия, кристаллический фиолетовый, агар при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды:

панкреатический гидролизат казеина	29,0-31,0
пептон ферментативный	19,0-21,0
глюкоза	2,4-2,6
лактоза	9,0-10,1
экстракт хлебных дрожжей	4,9-5,2
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов	9,0-10,1
цитрат натрия	0,9-1,1
L-цистин	0,19-0,21
сульфит натрия	0,19-0,21
азид натрия	0,19-0,21
кристаллический фиолетовый	0,0019-0,0022
бромкрезоловый пурпуровый	0,15-0,17
агар микробиологический	11,0-12,5

Предлагаемая пропись отличается от прописи прототипа по следующим принципам.

1. Введена индикаторная система, включающая лактозу и индикатор бромкрезоловый пурпуровый. Методические рекомендации предлагают расширенную схему дифференциации гемолитических и зеленящих стрептококков с энтерококками, занимающую 3 и более дней и необходимость наличия нескольких питательных сред и тест-систем для последующей видовой идентификации стрептококков. Предлагаемая среда для выделения стрептококков (Стрептококк-азид-агар) благодаря введенному в состав углеводу и красителю обеспечивает четкие дифференцирующие свойства и в результате этого позволяет идентифицировать по крайней мере 3 вида стрептококков. На малинового цвета агаровой пластинке сконструированной среды наблюдается уже через 18-36 часов инкубации рост серых блестящих полупрозрачных колоний пиогенного стрептококка. Колонии зеленящего стрептококка - голубые, с влажным блеском; колонии фекального стрептококка - крупные, плотные, серо-желтого цвета. Таким образом среда для выделения стрептококков сокращает сроки выделения чистой культуры и определение ее видовой принадлежности, что ускоряет постановку диагноза.

2. В составе препарата сбалансированная питательная базовая основа среды, состоящая из комбинации панкреатического гидролизата казеина, пептона ферментативного и обогащенная стимуляторами роста (стимулятор роста гемофильных микроорганизмов и экстракт хлебных дрожжей).

В отличие от "классических" питательных сред для выделения стрептококков, требующих введения крови или сыворотки [1], питательная базовая основа способствует оптимальному росту стрептококков, увеличивая размеры колоний, улучшая морфологию и, следовательно, дифференцирующие свойства, без добавления биологических жидкостей. Все составные части рецептуры - гостированные ингредиенты отечественного производства.

Среду получают следующим образом.

Пример 1. В 1 л дистиллированной воды вносят 29,0 г панкреатического гидролизата казеина, 19,0 г пептона ферментативного, 2,4 г глюкозы, 9,0 г лактозы, 4,9 г экстракта хлебных дрожжей, 9,0 г стимулятора роста гемофильных микроорганизмов, 0,9 г цитрата натрия, 0,19 г L-цистина, 0,19 г сульфита натрия, 0,19 г азида натрия, 0,0019 г кристаллического фиолетового, 11,0 г агара микробиологического, 0,15 г бромкрезолового пурпурового. Тщательно перемешивают, полученную суспензию доводят до кипения и кипятят до полного расплавления агара. рН среды 7,4±0,2. Среду охлаждают до температуры 45-50°С и разливают в стерильные чашки Петри слоем 4,0-5,0 мм, оставляют до застывания. Перед посевом чашки со средой подсушивают в термостате в течение 40-60 минут при температуре 37°С. Отбор клинических проб, подготовку их к исследованию и посеву на среду проводят в соответствии с рекомендациями, изложенными в "Микробиологической диагностике стрептококковых инфекций" (М., 1996). Инкубацию проводят в "свечном" сосуде в атмосфере, содержащей углекислый газ. Результат учитывают через 24-48 часов инкубации.

Пример 2. В 1 л дистиллированной воды вносят 30,0 г панкреатического гидролизата казеина, 20,0 г пептона ферментативного, 2,5 г глюкозы, 10,0 г лактозы, 5,0 г экстракта хлебных дрожжей, 10,0 г стимулятора роста гемофильных микроорганизмов, 0,2 г L-цистина, 1,0 г цитрата натрия, 0,2 г сульфита натрия, 0,2 г азида натрия, 0,002 г кристаллического фиолетового, 0,16 г бромкрезолового пурпурового, 11,75 г агара микробиологического. Далее согласно примеру 1.

Пример 3. В 1 л дистиллированной воды вносят 31,0 г панкреатического гидролизата казеина, 21,0 г пептона ферментативного, 2,6 г глюкозы, 10,1 г лактозы, 5,2 г экстракта хлебных дрожжей, 10,1 стимулятора роста гемофильных микроорганизмов, 0,21 г L-цистина, 1,1 г цитрата натрия, 0,21 г сульфита натрия, 0,21 г азида натрия, 0,0022 г кристаллического фиолетового, 0,17 г бромкрезолового пурпурового, 12,5 г агара микробиологического. Далее согласно примеру 1.

Биологические показатели среды для выделения стрептококков (Стрептококк-азид-агар) и прототипа представлены в таблице.

Из таблицы видно, что предлагаемая среда имеет преимущество по сравнению с прототипной средой. На предлагаемой среде колонии стрептококков более крупные, что немаловажно для визуальной видовой индикации колоний стрептококков, имеющих на нашей среде разную окраску. На прототипной среде колонии стрептококков мельче, белые, дифференциация отсутствует.

Таблица
Культуры	Предлагаемая среда (Стрептококк-азид-агар)	Среда-прототип (Streptosel-agar)
морфология колоний	дифференциация	морфология колоний	дифференциация
S.pyogenes	блестящие, полупрозрачные, диаметр - 2,5-3 мм	колонии серого цвета	полупрозрачные, блестящие, диаметр - 1-1,5 мм	колонии белого цвета
S.viridans	слизистые, непрозрачные, диаметр- 2-2,5 мм	колонии голубого цвета	полупрозрачные, диаметр - 1,5-2 мм	колонии белого цвета
S.faecalis	крупные, плотные, диаметр - 3-5 мм	колонии серо-желтого цвета	плотные, диаметр - 2,5 мм	колонии белого цвета

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ

1. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М.: Медицина, 1982, с.255-256.

2. Брико Н.И. Болезни, вызываемые стрептококками группы А в начале 21 века: проблемы и перспективы профилактики. Вестник АМН, 2001, №2.

3. Брико Н.И., Ещина А.С., Ряпис Л.А. Лабораторная диагностика стрептококковых инфекций. Пособие для врачей и научных работников. М.: Хризосом, 2000, с.26.

4. Зациорская С.Л. Оценка различных питательных сред при выделении стрептококков группы В из клинических материалов. Лабораторное дело, 1989, №3, с.15-17.

5. Игонина Ю.А., Шевчук М.С., Бочков И.А., Османов С.К. Подбор питательных сред для лабораторной диагностики стрептококков группы В. Журн. микробиол., эпидемиол. и инфекц. бол., 1983, №9, с.21-24.

6. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. М., 1980.

7. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней. Под ред. Матвеева К.И. и Соколова М.И., М., 1964, с.452.

8. Руководство по применению продукции фирмы Himedia в лабораторной практике. 2003, с.75.

9. Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней. Под ред. Жукова-Вережникова Н.Н., т.1, М., 1962, с.347-348, 354-355.

10. Стрептококковые инфекции. II. Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций. Методические рекомендации. Издательство «Грантъ», 1999, с.15.

11. Телишевская Л.Я. Белковые гидролизаты. М., 2000, с.246-247.

12. Физико-химические методы контроля ингредиентов питательных сред и биопрепаратов. Под ред. Колесова С.Г. М., 1970, с.63-65.

13. Manual of BBL. Products and laboratory procedures. Sixth Edition. Cat. №5200, 1988, p.254.

14. Microbiology Manual Merck. Darmstadt, 1990, p.192.

Питательная среда для селективного выделения стрептококков, содержащая питательную основу, глюкозу, L-цистин, сульфит натрия, цитрат натрия, азид натрия, кристаллический фиолетовый, агар микробиологический, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что дополнительно в качестве источника азотистого питания она содержит пептон ферментативный, в качестве стимуляторов роста - стимулятор роста гемофильных микроорганизмов и экстракт хлебных дрожжей, а в качестве индикаторной системы - лактозу и бромкрезоловый пурпуровый при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды:

панкреатический гидролизат казеина	29,0-31,0
пептон ферментативный	19,0-21,0
глюкоза	2,4-2,6
лактоза	9,0-10,1
экстракт хлебных дрожжей	4,9-5,2
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов	9,0-10,1
цитрат натрия	0,9-1,1
L-цистин	0,19-0,21
сульфит натрия	0,91-0,21
азид натрия	0,19-0,21
кристаллический фиолетовый	0,0019-0,0022
бромкрезоловый пурпуровый	0,15-0,17
агар микробиологический	11,0-12,5