Способ оценки степени эндотелиальной дисфункции

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и неврологии. Для осуществления метода после центрифугирования крови на градиенте плотности фиколл-верографин ρ=1.077 с помощью фазово-контрастной микроскопии осуществляют подсчет в 10 полях зрения количества слущенных эндотелиоцитов на 100 лимфоцитов и одновременную идентификацию 100 лимфоцитов по везикуляции наружной цитоплазматической мембраны. Определяют коэффициент содержания мембранвысвобожденных микрочастиц и рассчитывают суммарный титр антител к фосфолипидам и sPECAM-1. В зависимости от значения суммарного титра sPECAM-1 и антител к фосфолипидам диагностируют степень эндотелиальной дисфункции. Использование изобретения позволяет определить содержание гуморальных маркеров по регистрации клеточных и оценить степень эндотелиальной дисфункции, что дает возможность ранней патогенетической терапии. 3 ил., 8 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и неврологии, и может быть использовано для оценки степени эндотелиальной дисфункции у пациентов с гипертонической болезнью, осложненной ишемическим инсультом.

В основе патогенеза ишемического инсульта лежит стойкое изменение нормального функционирования сосудистой стенки, что приводит к увеличению ее резистентности, снижению эластичности, увеличению гладкомышечных клеток. Все это не только стойко сужает просвет артерий, но и приводит к усугублению повреждения эндотелия.

В физиологических условиях эндотелий сосудов обеспечивает адекватную вазодилатацию, контролирует рост гладкомышечных клеток, угнетает активацию и адгезию тромбоцитов, подавляет свертывающую активность крови, препятствует воспалительным процессам. Эндотелий играет активную роль в клеточно-опосредованном иммунитете, который обусловлен, в частности, взаимодействием эндотелиоцитов с Т-лимфоцитами. Такие взаимодействия определяются презентацией эндотелиоцитами антигенов, диапедезом лимфоцитов через эндотелий в очаг воспаления, связыванием их с рецепторами эндотелиоцитов (Cines, D.B. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. / D.B. Cines, E.S. Pollak et al. // Blood - 1998 - Vol.91 - N. 10 - P. 3527-3561).

Увеличение вазоконстрикции, снижение эластичности сосудистой стенки, прогрессирование атеротромбоза формируют хроническую ишемию органов и тканей, которая является индуктором апоптоза клеток не только органов и тканей, в которых создаются условия для образования дисбаланса между потребностью в кислороде и его доставкой, но и самих эндотелиоцитов. В условиях возникновения острой сосудистой катастрофы, когда в короткий промежуток времени происходит усугубление и прогрессирование эндотелиальной дисфункции и формирование острого ишемического стресса, наряду с некротическими изменениями пораженных органов, запускаются процессы массированного апоптоза клеток пострадавшего органа и эндотелиоцитов (Flotats, A. Non-invasive in vivo imaging of myocardial apoptosis and necrosis. / A.Flotats, I.Carrio // Eur J Nucl Med Mol Imaging - 2003 - V.30 - N.4 - P. 615-630).

В качестве потенциальных гуморальных маркеров дисфункции эндотелия рассматриваются дефицит оксида азота, молекулы адгезии, инсулиноподобный фактор роста и ангиотензин II. На современном этапе существуют некоторые трудности, сопряженные с определением концентрации маркеров эндотелиальной дисфункции, таких как оксид азота. Это связано с чрезвычайной нестойкостью молекулы NO. NO-продуцирующая активность по биохимическим критериям может быть оценена лишь косвенно - путем регистрации метаболитов NO, что приближенно отражает действительность. В связи с этим большинство исследователей, изучающих эндотелиальную дисфункцию при различных кардиоваскулярных заболеваниях, предлагают оценивать концентрацию молекул адгезии в качестве достоверных маркеров дисфункции эндотелия. По современным представлениям нарушение функции эндотелия прямо коррелирует с резким увеличением экспрессии молекул адгезии sPECAM-1 (Курбанов, Р.Д. Гуморальные маркеры дисфункции эндотелия при эссенциальной гипертонии. / Р.Д.Курбанов, М.Р.Елисеева, P.P.Турсунов и др. // Кардиология - 2003 - №7 - С.61-64).

Роль РЕСАМ - трансмембранная передача сигнала межклеточного взаимодействия, что, в частности, приводит к тромбозу, диапедезу лейкоцитов через сосудистую стенку в очаг воспаления. В статье Neta Ilan et al., опубликованной в 2001 году, сообщается, что РЕСАМ-1 способен усиливать апоптотические процессы в эндотелии (Ilan, N. РЕСАМ-1 shedding during apoptosis generates a membrane-anchored truncated molecule with unique signaling characteristics. / N. Ilan, A. Mohsenin, L. Cheung et al // The FASEB journal - 2001 - V.15 - P.362-370). Антитела к РЕСАМ проявляют высокую чувствительность и специфичность к эндотелиальным клеткам в норме и патологии (эндотелиальная дисфункция). Для определения титра sPECAM-1 в плазме крови используется метод ИФА (human sPECAM-1 ELISA, Bender Med Systems GmbH, Vienna, Austria).

Другим маркером эндотелиальной дисфункции, предложенным и запатентованным Красновой Л.Г. и др. (Патент РФ №2234094; G01N 33/49, 08.10.2004), является определение количества десквамированных эндотелиоцитов в периферической крови способом Hladovec J. (Hladovec, J. Circulating endothelial cells in acute myocardial infarction and angina pectoris. / J.Hladovec, I.Prerovsky, V.Stanek, J.Fabian // Klin Wochenschr - 1978 - №56 - P.1033-1036). По способу, предложенному авторами, эндотелиальную дисфункцию диагностируют при значении показателя, превышающем 2,77·10⁵ в 1 л плазмы. Недостатком способа является уже указанная автором неточность способа Hladovec J., заключающаяся в определении нормального количества эндотелиоцитов, циркулирующих в периферической крови, в то время как инструментально не подтверждается эндотелиальная дисфункция. Авторы усовершенствовали способ, предложив предварительно перед забором крови создавать на 4 минуты положительное давление в области плеча, превышающее систолическое артериальное давление на 40-50 мм рт.ст. При сравнении с исходным количеством эндотелиоцитов, согласно трактовке авторов, можно выявить скрытую эндотелиальную дисфункцию. Однако, учитывая технически сложную процедуру, которая в большинстве клиник должна выполняться без участия врача, временные затраты и длительность самого способа Hladovec J., предложенный способ представляется трудно применимым в условиях клинико-лабораторных исследований.

Dignat-George F. et al. в 2003 году опубликовали результаты исследования содержания циркулирующих эндотелиоцитов в крови у больных различными заболеваниями, в том числе острым коронарным синдромом и у пациентов после ангиопластики. С помощью иммуномагнитноцитохимического связывания CD 146 (моноклональные антитела, отвечающие за межклеточное взаимодействие) с рецепторами слущенных эндотелиоцитов, авторами выявлено, что при остром коронарном синдроме в 1 мл крови обнаруживается в среднем 7,5 циркулирующих эндотелиоцитов, в то время как после ангиопластики - от 6 до 10 слущенных эндотелиоцитов. В контрольной группе (здоровые люди), по данным авторов, количество циркулирующих эндотелиоцитов в среднем составило менее 3 клеток на 1 мл крови (Dignat-George, F.Circulating endothelial cells: realities and promises in vascular disorders. / F.Dignat-George, J.Sampol, G.Lip, A.D.Blann // Pathophysiol Haemost Thromb - 2004 - №33 - P.495-499). Способ является дорогостоящим, что ограничивает его применение в клиниках и поликлиниках.

В последнее время активно изучаемым маркером окислительного стресса является блеббинг плазматической мембраны клеток. Следует особо отметить, что в качестве доступного объекта изучения степени выраженности эндотелиальной дисфункции и действия окислительного стресса можно рассматривать лимфоциты периферической крови, которые отвечают следующим необходимым условиям: обладают высокой чувствительностью к действию апоптогенных и активационных факторов, являются субстратом иммунного ответа (асептическое воспаление и формирование иммунных синапсов); популяция лимфоцитов обладает динамичностью в связи с относительно непродолжительным пребыванием в системном кровотоке лимфоцитов; участвуют в инициации апоптоза клеток-мишеней и формировании эндотелиальной дисфункции.

Исходом блеббинга плазматической мембраны лимфоцитов, в особенности на его начальных, обратимых этапах, может быть высвобождение мембранных микрочастиц, образующихся путем слущивания везикул - блеб. Однако в периферической крови также содержатся мембранвысвобожденные активные микрочастицы лейкоцитарного, тромбоцитарного, эндотелиального происхождения. В последнее время мембранвысвобожденным микрочастицам отводится значимая роль в развитии таких типовых патологических состояний, как воспаление, гиперкоагуляция, а также презентация антигенов. Чем выше степень дисфункции эндотелия, тем больше содержание мембранвысвобожденных микрочастиц в периферической крови (Preston, R.A. Effects of severe hypertension on endothelial and platelet Microparticles. / R.A.Preston, W.Jy, J. R.A.Preston et all // Hypertension. - 2003 - №41 - P.211-213).

Эндотелиальная дисфункция сопровождается увеличением титра антител к фосфолипидам. Антифосфолипидные антитела обладают способностью перекрестно реагировать с компонентами мембран клеток эндотелия и внеклеточного матрикса, включая фосфатидилсерин, подавляют синтез простациклина, стимулируют прокоагулянтную активность. Связывание антифосфолипидных антител и эндотелиальных клеток приводит к гиперэкспрессии клеточных молекул адгезии и апоптозу эндотелиальных клеток. Для определения суммарного количества антител к фосфатидилсерину, фосфатидил-инозитолу, кардиолипиду и фосфатидиловой кислоте используется метод Anti-phospholipid Screen IgG/IgM, ORGENTEC, Germany.

Способ Anti-phospholipid Screen не позволяет диагностировать антифосфолипидный синдром, но антитела к фосфолипидам представляют собой косвенный маркер дисфункции эндотелия, нарушения реологических свойств крови. Однако этот способ также является дорогостоящим и не позволяет исследовать кровь у одного пациента (набор рассчитан для одновременного исследования плазмы крови у 96 пациентов). Тем не менее, увеличение содержания антител к фосфолипидам и sPECAM-1 является наиболее точным современным маркером дисфункции эндотелия.

Задача изобретения: повышение чувствительности оценки эффективности гипотензивной терапии.

Поставленную задачу осуществляют за счет того, что после центрифугирования крови больного на градиенте плотности фиколл-верографин ρ=1.077 с помощью фазово-контрастной микроскопии осуществляют подсчет в 10 полях зрения количества слущенных эндотелиоцитов на 100 лимфоцитов и одновременную идентификацию 100 лимфоцитов по везикуляции наружной цитоплазматической мембраны, а также рассчитывают коэффициент содержания мембранвысвобожденных микрочастиц с помощью программы Adobe Photoshope CS, затем проводят расчет суммарного титра sPECAM-1 и антител к фосфолипидам по формуле sPECAM+a/тФЛ=6,9913+0,1043 ×c×(b+m), где sPECAM - титр молекул межклеточной адгезии sPECAM-1 (нг/мл), а/тФЛ - титр антител к фосфолипидам (Ед/мл), с - количество слущенных эндотелиоцитов (шт.), b -степень выраженности блеббинга лимфоцитов (оценочное значение), m - коэффициент содержания мембранвысвобожденных микрочастиц (оценочное значение), 6,9913 и 0,1043 - расчетные поправочные коэффициенты; при оценочных значениях суммарного титра sPECAM-1 и антител к фосфолипидам 7-8 - диагностируют 1 степень эндотелиальной дисфункции; 8,15-10,0 - 2 степень; 10,5-17,0 - 3 степень; 17,5 и выше - 4 степень; промежуточные значения оценивают как переходную степень эндотелиальной дисфункции; крайне тяжелому поражению эндотелия соответствует оценочное значение 26,5 и выше.

Способ осуществляют следующим образом: забор венозной крови в объеме 5 мл проводят толстой иглой из локтевой вены пациента в пластмассовую пробирку с ризками, содержащую 0,15 мл гепарина; затем тщательно перемешивают кровь с гепарином в пробирке. Допустимо хранение пробирки с кровью в холодильнике при +5С° в течение 3-4 часов. В условиях лаборатории проводят повторное ресуспензирование крови в пробирке.

Для выделения лимфоцитарной фракции периферической крови используют градиент плотности фиколл-верографин. Для этого в отдельную пластмассовую пробирку вносят 2 мл фиколл-верографина (Pharmacia hemical, Uppsala, Sweden) плотностью ρ=1.077; после чего по стенке пробирки осторожно, медленно дозатором на фиколл-верографин наслаивают 4 мл ресуспензированной крови и центрифугируют при комнатной температуре в течение 15 минут со скоростью 3000 оборотов/мин.

После центрифугирования на границе раздела фаз пастеровской пипеткой собирают кольцо клеток в отдельную пластмассовую пробирку. Пробирку с выделенным клеточным кольцом центрифугируют при комнатной температуре в течение 5 минут со скоростью 3000 оборотов/мин. После центрифугирования убирают супернатант, к осадку добавляют 500 мкл PBS (фосфатный буфер) или раствора Хенкса, тщательно ресуспензируют дозатором с большим наконечником.

Перед микроскопированием на предварительно обезжиренное предметное стекло наносят 50 мкл суспензии клеток, на покровное стекло - небольшое количество эмерсионного масла.

Микроскопируют в 10 полях зрения с использованием фазово-контрастной насадки; увеличение х900. В поле зрения микроскопа видны эндотелиоциты (клетки полигональной формы, размером 20-50 мкм), лимфоциты (клетки округлой формы, размером 9-10 мкм), мембранвысвобожденные микрочастицы до 0,3 мкм (отличительный признак от тромбоцитов).

По морфологии цитоплазматической мембраны дифференцируют следующие виды лимфоцитов: 1) интактные клетки (с визуально неизмененной плазматической мембраной: круглой, ровной поверхностью); 2) клетки в состоянии начального блеббинга (мелкие везикулы на мембране - до 1/3 радиуса клетки); 3) клетки в состоянии терминального блеббинга (крупные пузыри мембраны - более 1/3 радиуса клетки); 4) некротизированные лимфоциты.

Расчет проводят на 100 лимфоцитов.

По содержанию лимфоцитов с интактной мембраной и в состоянии терминального блеббинга определяют степень выраженности блеббинга (табл.1)

Таблица 1
Шкала оценки степени выраженности блеббинга лимфоцитов
Идентифицированная категория клеток	Количество лимфоцитов, %
IV степень	III степень	II степень	I степень
Интактная плазматическая мембрана	10-20	21-40	41-60	>60
Терминальный блеббинг	>60	51-60	31-50	10-30

С помощью программы Adobe Photoshope CS проводят количественную оценку содержания изображений мембранвысвобожденных микрочастиц в поле зрения в пикселях. Затем вычисляют процентное соотношение изображения микрочастиц по отношению ко всему полю зрения и переводят значения в коэффициент содержания мембранвысвобожденных микрочастиц (табл.2).

Таблица 2
Шкала интерпретации содержания мембранвысвобожденных микрочастиц в лимфоцитарной фракции периферической крови
Коэффициент содержания мембранвысвобожденных микрочастиц	Содержание мембранвысвобожденных микрочастиц в процентах по отношению к полю зрения
0	<0,1%
1 (низкое содержание)	0,1-3%
2 (среднее содержание)	4-9%
3 (высокое содержание)	10-19%
4 (очень высокое содержание)	≥20%

Связь между отдельными показателями и их композициями можно оценить с помощью корреляционного анализа между изучаемыми клеточными (блеббинг лимфоцитов, мембранвысвобожденные микрочастицы, слущенные эндотелиоциты) и гуморальными (sPECAM-1, антитела к фосфолипидам) показателями эндотелиальной дисфункции (табл.3).

Таблица 3
Корреляционный анализ между клеточными и гуморальными маркерами эндотелиальной дисфункции
Изучаемый параметр	Показатель корреляции
(b)	(m)	(с)	sPECAM	а/тФЛ	sPECAM x а/тФЛ	sPECAM +а/тФЛ	b+m	b+m+с	(b+m)×c
бл	1
мвм	0,771	1
сэ	0,853	0,918	1
sPECAM	0,871	0,897	0,967	1
а/тФЛ	0,817	0,879	0,954	0,981	1
sPECAM×а/тФЛ	0,803	0,833	0,927	0,967	0,994	1
sPECAM+а/тФЛ	0,847	0,892	0,964	0,995	0,995	0,986	1
бл+мвм	0,901	0,945	0,917	0,921	0,871	0,832	0,900	1
бл+мвм+сэ	0,878	0,941	0,996	0,970	0,951	0,922	0,965	0,945	1
(b+m)×с	0,897	0,932	0,984	0,971	0,963	0,942	0,972	0,938	0,991	1
бл (b) - степень выраженности блеббинга (оценочное значение) мвм (m) - коэффициент содержания мембранвысвобожденных микрочастиц (оценочное значение) сэ (с) - количество слущенных эндотелиоцитов (шт.) а/тФЛ - антитела к фосфолипидам (Ед/мл) sPECAM - молекула межклеточной адгезии sPECAM-1 (нг/мл)

Тесные корреляционные связи наблюдаются между отдельными анализируемыми показателями. Наиболее плотные связи имеют комплексные, образованные путем сложения и/или произведения отдельных известных и предлагаемых нами показателей. Клеточные маркеры патологии гомеостаза и эндотелиальной дисфункции находятся в тесной корреляции с гуморальными маркерами.

Наибольший коэффициент корреляции (0,97) наблюдается между суммой известных показателей sPECAM+а/тФЛ и предлагаемым нами обобщенным показателем в виде (b+m)×с.

На фиг.1. представлен график функциональной зависимости между суммой показателей sPECAM-1 и антител к фосфолипидам и обобщенным показателем [(степень блеббинга + коэффициент содержания мембранвысвобожденных микрочастиц) х количество слущенных эндотелиоцитов]. Согласно выявленной линейной зависимости между указанными параметрами, суммарный титр sPECAM-1 и антител к фосфолипидам можно рассчитать по формуле: sPECAM+а/тФЛ=6,9913+0,1043×c×(b+m), где с - количество слущенных эндотелиоцитов, b - степень выраженности блеббинга, m - коэффициент содержания мембранвысвобожденных микрочастиц, а/тФЛ - антитела к фосфолипидам; расчетные поправочные коэффициенты равны 6,9913 и 0,1043.

В табл.4. представлен расчет адекватности способа по критерию Фишера (F).

Таблица 4
Расчет адекватности способа
Показатели	Наблюдаемые значения	Расчетные значения
Среднее	17,33	17,34
Дисперсия	19,55	18,47
F расчетный	1,06
F табличный	1,59

Расчетный критерий Фишера меньше табличного для принятого уровня значимости, то есть предложенный способ адекватно описывает сумму показателей sPECAM-1 и антител к фосфолипидам.

Способ расчета суммарного титра sPECAM-1 и антител к фосфолипидам позволяет произвести экспресс-диагностику степени эндотелиальной дисфункции по разработанной нами шкале (табл.5).

Таблица 5
Шкала перевода расчетных значений суммы гуморальных маркеров в степень эндотелиальной дисфункции
Степень эндотелиальной дисфункции	Расчетный суммарный титр (оценочное значение)sPECAM+a/тФЛ=6,9913+0,1043×c×(b+m)
1 степень	7-8
2 степень	8,15-10,0
3 степень	10,50-17,0
4 степень	≥17,5

При этом крайне тяжелому поражению эндотелия соответствует расчетный индекс ≥26,5.

Гуморальные маркеры sPECAM-1 и антитела к фосфолипидам отображают эндотелиальную дисфункцию. Однако каждый показатель по отдельности показывает степень повышения содержания биологически активных веществ, сопряженных с эндотелиальной дисфункцией. Так, титр sPECAM-1 - это концентрация молекул клеточной адгезии, ответственных за связь с эндотелием и диапедез через него. Антитела к фосфолипидам - дисфункция клеточных мембран, гиперкоагуляция (коэффициент корреляции 0,46) и нарушение липидного спектра крови (коэффициент корреляции 0,59).

На фиг.2. представлена диаграмма соотношения содержания суммарного титра sPECAM-1 и антител к фосфолипидам (ось Z) с количеством слущенных эндотелиоцитов (ось Y) и со степенью выраженности блеббинга лимфоцитов периферической крови (ось X), наибольшему суммарному титру sPECAM-1 и антител к фосфолипидам соответствует наибольшее содержание слущенных эндотелиоцитов и высокая степень выраженности блеббинга лимфоцитов.

На фиг.3. представлен график соотношения расчетного титра гуморальных маркеров sPECAM-1 и антител к фосфолипидам (ось Y) со степенью эндотелиальной дисфункции (ось X), чем больше суммарный титр sPECAM-1 и антител к фосфолипидам, тем выше степень эндотелиальной дисфункции.

Таким образом, наиболее достоверным способом диагностики эндотелиальной дисфункции является определение титра гуморальных маркеров (sPECAM-1 и антитела к фосфолипидам) в плазме периферической крови, которые отображают патологию функционирования эндотелия в совокупном виде, включающем гиперкоагуляционные, дислипидемические, иммунные сдвиги; повышение адгезивных свойств эндотелия. В нашем исследовании мы выявили высокие корреляционные отношения (0,97) между суммарным титром гуморальных маркеров эндотелиальной дисфункции (sPECAM-1 и антитела к фосфолипидам) и совокупностью клеточных маркеров эндотелиальной дисфункции [(степень выраженности блеббинга + балл содержания мембранвысвобожденных микрочастиц) × количество слущенных эндотелиоцитов]. По предложенному нами способу суммарное содержание гуморальных маркеров рассчитывают по совокупности клеточных маркеров:

sPECAM+а/тФЛ=6,9913+0,1043×c×(b+m)

Себестоимость определения маркеров эндотелиальной дисфункции (здесь и далее выкладки в ценах 2006 года) в плазме периферической крови для одного пациента равна 2000 рублей (с учетом стоимости реактива, расходного материала, амортизации оборудования). Набор реактивов для определения sPECAM-1 и антител к фосфолипидам, стоимостью 947 евро, рассчитан на одновременное проведение анализа плазмы крови у 96 человек. Себестоимость расчета содержания суммарной концентрации указанных гуморальных маркеров эндотелиальной дисфункции по клеточным маркерам равна 30 рублям для одного пациента (с учетом реактива, расходного материала, амортизации оборудования). Предложенный нами способ позволяет экономить время и средства, а также определять наличие эндотелиальной дисфункции индивидуально у одного пациента.

Приводим примеры - выписки из истории болезни.

1. Больной 3., 56 лет, поступил в неврологическое отделение с диагнозом: ОНМК по ишемическому типу в бассейне правой средне-мозговой артерии с левосторонним гемипарезом. Фон: гипертоническая болезнь III, риск 4.

При поступлении: состояние тяжелое, АД 220/140 мм рт.ст., ритм синусовый с ЧСС 80 в мин.

По данным компьютерной томографии головного мозга (КТ) определяется очаг ишемического инсульта вблизи тела правого бокового желудочка и в теменной доле размером 53×30 мм.

Биохимический анализ крови: дислипидемия за счет увеличения содержания липопротеидов низкой плотности, гиперкоагуляция.

Проводилась стандартная нейротропная терапия. Гипотензивная терапия включала периндоприл 4 мг по 1 таб. × 2 раза в день, гипотиазид 12,5 мг утром.

Через 7 дней: состояние средней степени тяжести, АД 130/70 мм рт.ст., ЧСС 70 в мин, сила в левой руке восстановлена - 5 баллов, в левой ноге - 3 балла, сухожильные рефлексы слева больше, чем справа.

Через 20 дней: состояние удовлетворительное, АД 130/80 мм рт.ст., ЧСС 68 в мин, нервные функции восстановлены.

Анализируемые нами параметры представлены в табл.6.

Таблица 6
Показатели клеточных и гуморальных маркеров эндотелиальной дисфункции и степени тяжести пациента
b 1 сут	b 7 сут	b 20 сут	m 1 сут	m 20 сут	с 1 сут	с 20 сут	sP 1 сут	sP 20 сут	а/тФЛ 1 сут	а/тФЛ 20 сут
4	3	2	4	1	17	1	15,78	5,68	5,40	1,62
b - степень выраженности блеббинга (оценочное значение) m - коэффициент содержания мембранвысвобожденных микрочастиц (оценочное значение) с - количество слущенных эндотелиоцитов (шт.) sP - sPECAM-1 (титр, нг/мл) а/тФЛ - антитела к фосфолипидам (титр, Ед/мл)

Рассчитаем суммарный показатель гуморальных маркеров на основании значений клеточных маркеров эндотелиальной дисфункции:

sPECAM+a/тФЛ=6,9913+0,1043×c×(b+m)=6,9913+0,1043×17(4+4)=21,18

Полученное расчетное значение соответствует экспериментальному и принадлежит 4 степени эндотелиальной дисфункции на 1 сутки госпитализации пациента.

На 20 сутки госпитализации у больного по расчетному показателю гуморальных маркеров диагностируют 1 степень эндотелиальной дисфункции. Полученные результаты указывают на эффективность действия гипотензивного препарата на сосудистую стенку и реологические свойства крови, в то время как восстановление обменных процессов на уровне сосудистой стенки и мозговой ткани продолжается еще несколько месяцев после стационарного лечения.

2. Больная К., 53 года, поступила с диагнозом: ОНМК по ишемическому типу в бассейне левой средне-мозговой артерии с правосторонним гемипарезом, моторной афазией. Фон: гипертоническая болезнь III, риск 4.

При поступлении: состояние тяжелое, АД 190/100 мм рт.ст., ритм синусовый с ЧСС 84 в мин.

По данным КТ мозга определяется очаг ишемического инсульта в левой гемисфере в височно-теменной области размером 25×46 мм.

Биохимический анализ крови: гиперхолестеринемия (8,4 ммоль/л), гиперфибриногенемия (6,8 мг/литр), угнетение фибринолиза.

Проводилась стандартная нейротропная терапия (см. выше). Гипотензивная терапия включала эналаприл 20 мг по 1 таб.×2 раза в день, гипотиазид 12,5 мг утром.

Через 7 дней: состояние средней степени тяжести, АД 130/80 мм рт.ст., ЧСС 75 в мин, элементы моторной афазии, сила в правой руке - 4 балла, в правой ноге - 3 балла, сухожильные рефлексы справа больше, чем слева.

Через 20 дней: состояние ближе к удовлетворительному, АД 130/80 мм рт.ст., ЧСС 78 в мин, остаточные явления моторной афазии, сила в правой ноге - 4 балла, в правой руке - 5 баллов, нарушение когнитивных функций.

Анализируемые нами параметры представлены в табл.7.

Таблица 7
Показатели клеточных и гуморальных маркеров эндотелиальной дисфункции и степени тяжести пациентки
b 1 сут	b 7 сут	b 20 сут	m1 сут	m 20 сут	с 1 сут	с 20 сут	sP 1 сут	sP 20 сут	а/тФЛ 1 сут	а/тФЛ 20 сут
4	3	2	3	1	23	10	17,54	6,56	6,24	3,56
b - степень выраженности блеббинга (оценочное значение) m - коэффициент содержания мембранвысвобожденных микрочастиц (оценочное значение) с - количество слущенных эндотелиоцитов (шт.) sP - sPECAM-1 (титр, нг/мл) а/тФЛ - антитела к фосфолипидам (титр, Ед/мл)

Полученное расчетное значение (sPECAM+a/тФЛ=6,9913+0,1043 ×c×(b+m)=23,78) соответствует экспериментальному и принадлежит 4 степени эндотелиальной дисфункции на 1 сутки госпитализации пациентки. На 20 сутки госпитализации у больной по расчетному показателю гуморальных маркеров определяется переходное значение между 2 и 3 степенью эндотелиальной дисфункции. На 20 сутки госпитализации у больной диагностируют 3 степень эндотелиальной дисфункции. Это можно интерпретировать как недостаточный эффект примененного гипотензивного средства на восстановление функции эндотелия, что сохраняет риск возникновения нового осложнения гипертонической болезни, в то же время проводимая сердечно-сосудистая и нейротропная терапия оказала достаточный репаративный эффект по восстановлению кровоснабжения пораженного очага головного мозга, т.е. риск инвалидизации низкий.

3. Больной А., 59 лет, поступил с диагнозом: ОНМК по ишемическому типу в бассейне правой средне-мозговой артерии с грубым левосторонним гемипарезом. Фон: гипертоническая болезнь III, риск 4.

При поступлении: состояние тяжелое, АД 160/100 мм рт.ст., ритм синусовый с ЧСС 70 в мин; дизартрия, адверсия взора вправо, девиация языка влево, парез лица слева, грубый левосторонний гемипарез.

По причине тяжести состояния КТ головного мозга не проводилась.

Биохимический анализ крови: гиперхолестеринемия (9,2 ммоль/л), дислипидемия, гиперфибриногенемия (7,4 мг/литр), гипертромбинемия, угнетение фибринолиза.

Назначена интенсивная нейротропная терапия, через желудочный зонд - эналаприл 10 мг по 1 таб.×2 раза в день, гипотиазид 12,5 мг утром.

Через 7 дней: состояние крайне тяжелое, оглушение III степени, АД 150/90 мм рт.ст., ЧСС 95 в мин.

Больной умер на 13 сутки госпитализации. Патолого-анатомический диагноз: Инфаркт головного мозга в правом полушарии, отек и дислокация ствола головного мозга. Генерализованный атеросклероз артерий.

Анализируемые нами параметры представлены в табл.8.

Таблица 8
Показатели клеточных и гуморальных маркеров эндотелиальной дисфункции и степени тяжести пациента
b 1 сут	b 7 сут	m 1 сут	m 7 сут	с 1 сут	с 7 сут	sP 1 сут	sP 7 сут	а/тФЛ 1 сут	а/тФЛ 7 сут
4	4	3	4	25	26	16,09	19,49	9,15	9,53
b - степень выраженности блеббинга (оценочное значение) m - коэффициент содержания мембранвысвобожденных микрочастиц (оценочное значение) с - количество слущенных эндотелиоцитов (шт.) sP - sPECAM-1 (титр, нг/мл) а/тФЛ - антитела к фосфолипидам (титр, Ед/мл)

У больного на 1 сутки госпитализации расчетное значение (sPECAM+a/тФЛ=6,9913+0,1043×c×(b+m)=25,24) соответствует экспериментальному и принадлежит 4 степени эндотелиальной дисфункции.

На 7 сутки госпитализации у больного по расчетному показателю гуморальных маркеров (28,69) диагностируют крайне тяжелое поражение эндотелия.

Полученные результаты соответствуют клинической картине: исходно пациент поступил с тяжелой степенью эндотелиальной дисфункции, тяжелым поражением нервной ткани. В динамике заболевания эндотелиальная дисфункция прогрессировала, адекватная перфузия мозговых тканей не была восстановлена, в результате чего произошли отек и дислокация ствола головного мозга с последующим летальным исходом.

Использование заявляемого способа позволяет определить содержание гуморальных маркеров по регистрации клеточных, при этом способ является специфичным, чувствительным, малозатратным и дает возможность начать раннюю патогенетическую терапию эндотелиальной дисфункции и сопряженных с ней патологических состояний, оценить эффективность применяемой гипотензивной терапии по воздействию на восстановление функции эндотелия, снизить риск развития осложнений гипертонической болезни и инвалидизации на фоне развившегося ишемического инсульта.

Способ оценки степени эндотелиальной дисфункции, включающий забор периферической венозной крови у больного в объеме 5 мл, отличающийся тем, что после центрифугирования крови больного на градиенте плотности фиколл-верографин ρ=1,077 с помощью фазово-контрастной микроскопии осуществляют подсчет в 10 полях зрения количества слущенных эндотелиоцитов на 100 лимфоцитов и одновременную идентификацию 100 лимфоцитов по везикуляции наружной цитоплазматической мембраны, а также рассчитывают коэффициент содержания мембран-высвобожденных микрочастиц с помощью программы Adobe Photoshope CS, затем проводят расчет суммарного титра антител к фосфолипидам и sPECAM-1 по формуле

sPECAM+а/тФЛ=6,9913+0,1043·c·(b+m),

где sPECAM - титр молекул межклеточной адгезии sPECAM-1, нг/мл; а/тФЛ - титр антител к фосфолипидам, Ед/мл; с - количество слущенных эндотелиоцитов, шт; b - степень выраженности блеббинга лимфоцитов, оценочное значение; m - коэффициент содержания мембран-высвобожденных микрочастиц, оценочное значение; 6,9913 и 0,1043 - расчетные поправочные коэффициенты; при оценочных значениях суммарного титра sPECAM-1 и антител к фосфолипидам 7-8 диагностируют 1 степень эндотелиальной дисфункции; 8,15-10,0 - 2 степень, 10,5-17,0 - 3 степень; 17,5 и выше - 4 степень; промежуточные значения оценивают как переходную степень эндотелиальной дисфункции; крайне тяжелому поражению эндотелия соответствует оценочное значение 26,5 и выше.