Применение гедерагенин 3-о-альфа-l-рамнопиранозил (1 2)-[бета-d-глюкопиранозил (1 4)]-альфа-l-арабинопиранозида или содержащего его экстракта из pulsatillae radix в качестве терапевтического средства для солидных опухолей

Изобретение относится к фармакологии, а именно к применению гедерагенин 3-O-α-L-рамнопиранозил(1→2)-[b-D-глюкопиранозил(1→4)]-α-L-арабинопиранозида или содержащего его экстракта Pulsatillae radix и к применению водорастроримой фракции экстракта Pulsatillae radix, содержащей гедерагенин 3-O-α-L-рамнопиранозил(1→2)-[b-D-глюкопиранозил(1→4)]-α-L-арабинопиранозида в качестве терапевтического средства для солидных опухолей. Средства обладают высокой степенью ингибирования роста опухолей на клетках солидных опухолей, имеют достаточно низкую токсичность, снижая побочные эффекты известных противоопухолевых агентов. 2 н. и 6 з. п. ф-лы, 4 ил., 3 табл.

 

Данное изобретение относится к применению гедерагенин 3-О-α-L-рамнопиранозил(1→2)-[β-D-глюкопиранозил(1→4)]-α-L-арабинопиранозида, который представлен следующей формулой (I):

или содержащего его экстракта из Pulsatillae radix в качестве терапевтического средства для солидных опухолей.

ПРОТОТИПЫ

Pulsatillae radix представляет высушенный корень вида Pulsatilla, принадлежащего к семейству Ranunculaceae (Ki Hwan Bae, Korean Medicinal Herbs, 1999). Согласно китайской медицине известно, что Pulsatillae radix обладает эффектами снятия повышенной температуры крови и детоксикации. Его также применяют в качестве противовоспалительного, вяжущего, кровоостанавливающего агента и агента против диареи и для лечения кровянистого стула, малярии, носового кровотечения и кровотечения из зубов. Его цветок называется Pulsatillae Flos и применяется для лечения малярии и оспы. Его листья называются Pulsatillae Folium и применяются для лечения боли в области талии, отеков или боли в сердце. Кроме того, сообщается, что отвар Pulsatillae radix оказывает антибактериальное действие против амебной дизентерии и пестицидное действие против Trichomonas.

Pulsatillae radix содержит около 9% сапонинов и к настоящему времени выделены такие ингредиенты, как протоанемонин, анемонин, ранункулин, гедерагенин, бетулиновая кислота, производные олеаноловой кислоты и их гликозиды, которые представлены следующими формулами (II):

Фармакологические эффекты указанных выше ингредиентов до сих пор широко не изучены, но сообщается, что протоанемонин обладает митотоксичностью (Vonderbank, F., Pharmazie 5, 210, 1950). Li и др. (Li, R. Z. и др., Yao Hsueh Hsueh Pao, 28, 326 31, 1993) сообщают также, что ранункулин обладает цитотоксичностью против КВ-клеток посредством ингибирования ДНК-полимеразы.

Гедерагенин 3-О-α-L-рамнопиранозил(1→2)-[β-D-глюкопиранозил(1→4)]-α-L-арабинопиранозид выделен из Pulsatilla cerna и P. koreana исследователями Shimozu и др. (Chem. Pharm. Bull., 26, 1666, 1978); из P. chinensis исследователями Yoshihiro и др. (J. Nat. Prod., 62, 1279, 1999) и из Serjania salzmanniana Schlecht исследователями Ekabo и др. (J. Nat. Prod., 59, 431, 1996). Kang и др. (Arch. Pharm. Res., 12(1), 42-47, 1989) также выделили его из P. koreana и подтвердили его структуру. Yoshihiro и др. в указанной выше статье сообщают, что гедерагенин и производные олеаноловой кислоты проявляют цитотоксичность против клеток HL-60 лейкемии человека. Они сообщают, что гедерагенин 3-О-α-L-рамнопиранозил(1→2)-[β-D-глюкопиранозил(1→4)]-α-L-арабинопиранозид, выделенный из китайского Pulsatillae radix (Pulsatilla chinensis) обладает слабой токсичностью, а именно 3,8 мкг/мл ED₅₀, против клеток HL-60. Однако большинство сапонинов и многие виды природных продуктов обычно демонстрируют такой же уровень цитотоксичности, и, следовательно, нельзя сказать, что указанное выше соединение имеет основанную на этом противоопухолевую активность. Таким образом, не известно, что гедерагенин 3-О-α-L-рамнопиранозил(1→2)-[β-D-глюкопиранозил(1→4)]-α-L-арабинопиранозид обладает противоопухолевой активностью, в частности против солидных опухолей.

Заявители настоящего изобретения выделили деоксиподофиллотоксин из медицинских растений, включающих Anthriscus sylvestris Hoffman, Pulsatillae radix и др. и обнаружили, что данное вещество ингибирует рост клеток солидных опухолей посредством ингибирования ангиогенеза, и получили на него патент Кореи (патент Кореи №315200). Заявители настоящего изобретения провели широкие исследования по получению противоопухолевого средства из медицинских растений. В результате они получили из Pulsatillae radix фракцию, которая слабо растворима в органическом растворителе, но легко растворима в воде, и выделили из данной фракции противоопухолевое соединение, выполнив, таким образом, настоящее изобретение.

Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение терапевтического средства для солидных опухолей, содержащего противоопухолевое соединение, выделенное из Pulsatillae radix, или фракцию из Pulsatillae radix, содержащую такое соединение в качестве активного ингредиента.

Один аспект настоящего изобретения обеспечивает терапевтическое средство для солидных опухолей, экстракт Pulsatillae radix, содержащий гедерагенин 3-О-α-L-рамнопиранозил(1→2)-[β-D-глюкопиранозил(1→4)]-α-L-арабинопиранозид в качестве активного ингредиента.

Используемое здесь выражение «солидные опухоли» обозначает любые опухоли за исключением раков крови, типичным примером которых является опухоль легких.

В настоящем изобретении экстракт Pulsatillae radix, содержащий гедерагенин 3-О-α-L-рамнопиранозил(1→2)-[β-D-глюкопиранозил(1→4)]-α-L-арабинопиранозид, можно получить экстракцией Pulsatillae radix водным раствором этанола и образованием осадков при добавлении туда ацетона с получением водорастворимой фракции (WT). Или его можно получить экстракцией Pulsatillae radix водным раствором этанола, образованием осадков при добавлении туда ацетона с получением водорастворимой фракции и пропусканием данной фракции через колонку Sephadex LH20 с получением фракции (SPX3), имеющей R_f 0,48-0,50 и дающей красное окрашивание, а затем синее окрашивание после опрыскивания серной кислотой с последующим нагреванием.

Другой аспект настоящего изобретения обеспечивает терапевтическое средство для солидных опухолей, включающее гедерагенин 3-О-α-L-рамнопиранозил(1→2)-[β-D-глюкопиранозил(1→4)]-α-L-арабинопиранозид в качестве активного ингредиента.

Здесь далее настоящее изобретение будет объяснено подробно.

Согласно настоящему изобретению экстракт Pulsatillae radix является экстрагированным при помощи 50% этанола с получением фракции WT, слабо растворимой в ацетоне, и далее данную фракцию очищают на Sephadex LH20, получая фракцию SPX3, и из фракции SPX3 в заключение получают чистый SB365. Данное соединение представляет гедерагенин 3-О-α-L-рамнопиранозил(1→2)-[β-D-глюкопиранозил(1→4)]-α-L-арабинопиранозид и проявляет более высокую противоопухолевую активность против солидных опухолей, образованных опухолевыми клетками легких мыши, клетками LLC (карцинома легких Льюиса), или опухолевыми клетками легких человека, клетками NCI-H23, чем клиническое лекарство адриамицин.

В частности, настоящий процесс получения противоопухолевой фракции из Pulsatillae radix и выделения из нее противоопухолевого вещества является следующим.

(1) Получение противоопухолевой фракции WT из Pulsatillae radix

Порошок Pulsatillae radix экстрагируют 50% водным раствором этанола и сушат при пониженном давлении. К полученному высушенному веществу добавляют ацетон в 5-10-кратном количестве. Смесь встряхивают, центрифугируют при 3000 об/мин и супернатант декантируют, получая нерастворимую часть. Указанный выше процесс повторяют дважды. Оставшаяся нерастворенная часть легко растворяется в воде, ее обозначают «фракция WT». Данная фракция демонстрирует относительно высокую противоопухолевую активность на мышах BDF1 с трансплантированными клетками LLC и на голых мышах с трансплантированными клетками NCI-H23.

(2) Получение фракции SPX3 из фракции WT

Данное количество фракции WT растворяют в данном количестве водного раствора метанола с различными концентрациями и затем фракционируют на колонке Sephadex LH20, стабилизированной тем же растворителем. В данном случае лучшего выделения достигают при использовании 80% водного раствора метанола, а подходящий размер наполненной колонки составляет 60×4 см для 500 мг фракции WT. В результате получают фракции SPX1 (номера исследовательских пробирок 26-66), SPX2 (номера исследовательских пробирок 66-91), SPX3 (номера исследовательских пробирок 91-111) и SPX4 (номера исследовательских пробирок 111-138). После опрыскивания серной кислотой фракций, полученных на пластине с силикагелем, и нагревания пластины фракция SPX3 дает с течением времени сначала красное окрашивание, а затем синее окрашивание и содержит в качестве основного ингредиента проявленное соединение с R_f 0,48-0,50. Показано, что она имеет высокую противоопухолевую активность у мышей BDF1 с трансплантированными клетками LLC и у голых мышей с трансплантированными клетками NCI-H23.

(3) Выделение SB365 из фракции SPX3

Для выделения противоопухолевого вещества из фракции SPX3, демонстрирующей противоопухолевую активность, проводят ВЭЖХ, получая чистое соединение SB365. Для идентификации структуры SB365 проводят реакцию Liberman-Burchard, исследования ИК, ¹Н-ЯМР, ¹³С-ЯМР и гидролиз смесью этанол/серная кислота. В результате подтверждают, что SB365 является гедерагенин 3-О-α-L-рамнопиранозил(1→2)-[β-D-глюкопиранозил(1→4)]-α-L-арабинопиранозидом, который представляет сапониновый ингредиент, который был выделен из Pulsatillae radix.

Экстракты Pulsatillae radix настоящего изобретения или выделенное из них чистое соединение SB365 обладают слабой цитотоксичностью против клеток солидных опухолей, но неожиданно демонстрируют превосходную противоопухолевую активность в экспериментах на животных. Таким образом, они могут решить проблемы, вызываемые предыдущими противоопухолевыми средствами при клиническом применении, например снижение иммунных реакций вследствие уменьшения клеток крови. Ожидают также, что они демонстрируют низкую токсичность относительно быстро делящихся клеток, таких как кроветворные клетки и др.

Фракции Pulsatillae radix и SB365 согласно настоящему изобретению можно объединять с обычно используемыми фармацевтически приемлемыми носителями и производить в виде различных препаратов, обычных в фармацевтической области, например препаратов для перорального приема, таких как растворы, суспензии и др.; препаратов для инъекций, таких как растворы или суспензии для инъекций, готовые к применению сухие порошки для инъекций и др.; препаратов локального применения, таких как мази, кремы и растворы. В частности, активный ингредиент настоящего изобретения растворим в воде и может быть растворен в различных растворах, таких как физиологический раствор, раствор Рингера, питательный раствор и др. Такие фармацевтические препараты можно вводить внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно или локально.

Рекомендуемая дозировка активного ингредиента настоящего изобретения человеку составляет 3,5-8,0 мг/кг веса тела в случае SB365, 20-40 мг/кг веса тела в случае фракции SPX3 или 200-300 мг/кг в случае фракции WT. Оптимальная дозировка составляет 6,5 мг/кг веса тела в случае SB365, 25 мг/кг веса тела в случае фракции SPX3 или 250 мг/кг веса тела в случае фракции WT. Однако такую дозировку можно регулировать подходящим образом в зависимости от возраста, веса тела, здоровья, тяжести заболевания пациентов.

На фиг.1 показаны образцы ТСХ на силикагеле фракции WT.

На фиг.2 показаны образцы ТСХ на силикагеле фракции SPX3, очищенной на колонке Sephadex LH20.

На фиг.3 представлена ВЭЖХ-хроматограмма фракции SPX3.

На фиг.4 представлена ВЭЖХ-хроматограмма SB365.

ЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ДАННОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение будет лучше понятно из следующих примеров. Специалист в данной области легко оценит, что описанные конкретные вещества и результаты являются только иллюстративными, не предназначены для ограничения и не должны ограничивать данное изобретение, которое описано более подробно в следующей далее формуле изобретения.

Пример 1. Получение фракции WT

50 г порошка Pulsatillae radix трижды экстрагируют 500 мл 50% водного раствора этанола и сушат экстракт при пониженном давлении, получая 22 г высушенных веществ. К полученным высушенным веществам добавляют 300 мл ацетона и смесь встряхивают и центрифугируют при 3000 об/мин. Супернатант удаляют, получая осадок. С данным осадком дважды повторяют обработку ацетоном. Ацетоновый слой отбрасывают и сушат нерастворенную часть, получая 17,8 г высушенных веществ (фракция WT). Полученную фракцию WT подвергают ТСХ на силикагеле (проявляющий растворитель: смесь бутанол:уксусная кислота:вода в соотношении 4:1:1, цветная реакция: опрыскивание серной кислотой с последующим нагреванием). Результат показан на фиг.1. На фиг.1 синее пятно, имеющее R_f в диапазоне от 0,48 до 0,50, соответствует активному ингредиенту настоящего изобретения, который описан выше. Как показано ниже в экспериментальном примере 1, фракция WT демонстрирует относительно высокую противоопухолевую активность (степень ингибирования роста опухоли: 57%) на мышах BDF1 с трансплантированными клетками LLC.

Пример 2. Получение фракций SPX

560 мг фракции WT фракционируют далее на колонке Sephadex LH20 (200 г, 60×4 см), применяя смешанный раствор метанола и воды (80:20) со скоростью потока 1 мл/мин и объемом фракции 0,5 мл/пробирку. Данные фракции наносят на тонкий слой силикагеля по порядку и проявляют, получая фракции (проявляющий растворитель: смесь бутанол:уксусная кислота:вода в соотношении 4:1:1, цветная реакция: опрыскивание серной кислотой с последующим нагреванием). Результат показан на фиг.2. На фиг.2 SPX1 (139 мг, 24,8%) получена путем сбора исследовательских пробирок с номерами от 26 до 66 и состоит из 4 основных пятен, нижнее из которых дает желтое окрашивание после взаимодействия с серной кислотой. SPX2 (344 мг, 61,4%) получена путем сбора исследовательских пробирок с номерами от 66 до 91 и состоит из 2 основных пятен. SPX3 (61 мг, 10,9%) получена путем сбора исследовательских пробирок с номерами от 91 до 111 и дает с течением времени сначала красное окрашивание, а затем синее окрашивание после опрыскивания серной кислотой и последующего нагревания. Фракция SPX3 содержит пятно, имеющее R_f в диапазоне от 0,48 до 0,50, как основной ингредиент. SPX4 (15,7 мг, 2,8%) получена путем сбора исследовательских пробирок с номерами от 111 до 138. Фракции SPX3 и SPX4 имеют относительно высокую степень чистоты, демонстрируя одно пятно на тонком слое.

Как показано ниже в экспериментальном примере 1, фракция SPX3 демонстрирует 60% степень ингибирования роста опухоли через 15 дней после введения. В противоположность этому SPX1, SPX2 и SPX4 не демонстрируют никакого действия, и, таким образом, можно предположить, что вещество, дающее синее окрашивание с серной кислотой, представляет ингредиент с противоопухолевой активностью. Данную фракцию SPX3 можно применять в качестве противоопухолевого агента саму по себе.

Пример 3. Выделение SB365

Для выделения чистого вещества из фракции SPX3 проводят ВЭЖХ следующим образом.

В качестве неподвижной фазы применяют обращенно-фазный силикагель (RP-C₁₈, 250×10 мм производства Metachem), а в качестве подвижной фазы применяют смешанный раствор метанола и воды (80:20). Длина волны детектирования составляет 210 нм, а скорость потока 1 мл/мин. Результат показан на фиг.3. Как показано на фиг.3, SPX3 состоит из 3 основных веществ. Из полученных фракционированных количеств пики при R_f 8,5 мин и 10,4 мин содержат небольшие количества ингредиентов, а пик при R_f 23,3 мин содержит основной ингредиент. Таким образом, предполагают, что последний обладает противоопухолевой активностью. Как описано выше, собирают вещество с R_f 23,3 мин, которое дает синее окрашивание с серной кислотой и является активным ингредиентом, для получения 2,8 мг SB365 из 31 мг SPX3. Собранную фракцию при R_f 23,3 мин сушат и подвергают ВЭЖХ при описанных выше условиях для определения чистоты. Результат показан на фиг.4. Фиг.4 подтверждает, что SB365 является чистым веществом. Полученное SB365 непосредственно применяют для структурной идентификации и исследования противоопухолевой активности, приведенного ниже.

Как показано ниже в экспериментальных примерах 1 и 2, SB365 демонстрирует 81% и 82,1% степень ингибирования роста опухоли на мышах BDF1 с трансплантированными клетками LLC и на голых мышах с трансплантированными клетками NCI-H23, соответственно, можно сказать, что это превосходная противоопухолевая активность.

Пример 4. Идентификация и подтверждение структуры активного соединения SB365

Выделенное выше соединение SB365 является белым аморфным веществом с т.пл. 239-241°С и [α]_D+23,6° (c, 0,2, MeOH) и положительным в реакции Libermann-Buchard и, следовательно, подтверждено, что оно является гликозидом. Кроме того, в ИК-спектре (см^-1) наблюдают пики при 3400 (широкий, -ОН), 2940 (широкий, С-Н), 1695 (С=О), 1455 и 1040 (С-О). Вещество считают гликозидом, исходя из пиков поглощения в диапазонах 1000-1100 и 3000-3400.

Согласно ¹Н-ЯМР вещество имеет спектр ЯМР, типичный для сапонинов. Шесть групп -СН₃ наблюдают при 0,91, 0,92, 0,98, 1,00, 1,07 и 1,21 м.д. и еще одну группу -СН₃ наблюдают в виде дублета при 1,64 м.д. Из данного спектра можно видеть, что соединение содержит одну группу рамнозы в своих сахарных группах. Аномерные протоны наблюдают при 6,25 (широкий), 5,11 (1Н, J=7,80 Гц) и 4,97 м.д. (1Н, J=6,66 Гц). Таким образом, SB365 подтверждено как гликозид, имеющий три сахарных группы. Согласно ¹³С-ЯМР гидроксиметильную группу наблюдают при 65,4 м.д. (С-23) и три сигнала аномерных углеродов наблюдают при 104,2 (С-1'), 106,7 (C-1"') и 101,7 м.д. (С-1'). Два олефиновых углерода наблюдают при 122,5 м.д. (С-12) и 144,8 м.д. (С-13) и один карбоксильный углерод наблюдают при 180,2 м.д. (С-28). Вообще, если сахар связан по 28 положению (180,2 м.д. → 176,2 м.д.), то проявляется сильнопольный сдвиг гликозилирования около 4 Гц. В настоящем соединении указанное выше явление не наблюдается, и, следовательно, подтверждено, что соединение не имеет сахарной группы в 28 положении.

Затем соединение гидролизуют в смеси этанол/серная кислота для идентификации его сахарных групп и структуры агликона. SB365 подтверждают как гедерагенин после сравнения физико-химических данных продукта гидролиза агликона, данных ¹³С-ЯМР и ¹Н-ЯМР. Кроме того, сравнительной ТСХ подтверждено, что гидролизованные сахара представляют рамнозу, арабинозу и глюкозу.

На основании приведенных выше результатов анализов и данных в опубликованной литературе подтверждают, что SB365 представляет гедерагенин 3-О-α-L-рамнопиранозил(1→2)-[β-D-глюкопиранозил(1→4)]-α-L-арабинопиранозид.

Данные ¹Н-ЯМР и ¹³С-ЯМР соединения SB365 показаны в следующей таблице 1.

Таблица 1
Положение	1Н (м.д.)	J (Гц)	13С (м.д.)	Положение	1Н (м.д.)	J (Гц)	13С (м.д.)
С-1			38,9	Арабиноза
С-2			26,1	С-1'	4,97 д	6,66	104,2
С-3	3,28 д	10,9	81,0	С-2'			80,4
С-4			43,5	С-3'			75,4
С-5			48,1	С-4'			76,2
С-6			18,1	С-5'			63,9
С-7			32,8	Рамноза
С-8			39,7	С-1"	6,25 шир.		101,7
С-9			47,8	С-2"			72,3
С-10			36,9	С-3"			72,4
С-11			23,9	С-4"			74,1
С-12	5,45 с		122,5	С-5"			69,6
С-13			144,8	С-6"	1,64	5,94	18,6
С-14			42,1	Глюкоза
С-15			28,3	С-1"'	5,11 д	7,80	106,7
С-16			23,8	С-2"'			75,0
С-17			46,2	С-3"'			78,5
С-18			41,9	С-4"'			71,2
С-19			46,4	С-5"'			78,8
С-20			30,9	С-6"'			62,5
С-21			34,2
С-22			33,2
С-23	4,36, 3,67	Перекрывание	65,4
С-24	1,07 с		14,0
С-25	0,91 с		16,0
С-26	0,98 с		17,4
С-27	1,21 с		26,3
С-28	-		180,2
С-29	0,92 с		32,8
С-30	1,00 с		23,7

Пример 5: противоопухолевая активность на мышах BDF1 с трансплантированными клетками LLC

В данном эксперименте используют мышей BDF1, здоровых самцов мышей с весом тела 18-25 г. Данных животных снабжают водой и пищей без ограничения на месте с температурой, регулируемой в диапазоне 23-24°С, и кормят кормом для мышей без антибиотиков. Клетки LLC культивируют подкожно на мышах C57BL/6 в течение 14 дней. Отбирают ткань, содержащую клетки LLC, и добавляют туда стерилизованный холодный физиологический раствор (5 мл/г ткани), получая суспензию клеток. 0,2 мл суспензии клеток трансплантируют подкожно в паховую область мышей BDF1.

Через 24 ч после трансплантации указанных выше мышей делят на несколько групп, состоящих из 5 мышей. Затем образцы фракции WT, фракций SPX и SB365 растворяют в физиологическом растворе и вводят внутрибрюшинно при концентрации 280 мг/кг (WT), 70 мг/кг (SPX1), 171 мг/кг (SPX2), 30,5 мг/кг (SPX3), 8,1 мг/кг (SPX4) и 6,4 мг/кг (SB365). Отрицательной контрольной группе вводят только физиологический раствор, а положительной контрольной группе вводят адриамицин (0,5 мг/кг). Инъекции назначают, начиная от 24 ч после трансплантации опухоли, вводят образцы последовательно один раз в день в течение 7 дней, прекращают введение на один день и затем продолжают в течение 6 последующих дней.

Для оценки токсичности SB365 на мышах экспериментальных мышей взвешивают дважды в неделю. Противоопухолевую активность рассчитывают после измерения объема опухолей в контрольных и исследуемых группах на 14-й и 15-й день после введения образца следующим образом:

Объем опухоли (мм³) = длина (мм) × ширина² (мм²)/2.

Степень ингибирования роста опухоли (%) = (С-Т) × 100/С.

(С: средний объем опухоли в контрольной группе; Т: средний объем опухоли в исследуемой группе). Результаты представлены в следующей таблице 2.

Таблица 2 Степень ингибирования роста опухолей (IR, %) фракциями Pulsatillae radix и SB365 на мышах BDF1 с трансплантированными клетками LLC
Фракции соединений	Количество мышей	Степень ингибирования роста опухоли (%)
14-й деньа)	15-й деньа)
WT	5	56	55
SPX1	5	10	12
SPX2	5	25	30
SPX3	5	57	60
SPX4	5	8	10
SВ365	5	82	79
Адриамицин	5	60	64
а) Дни после трансплантации опухолевых клеток

Как показано выше в таблице 2, на 15-й день после трансплантации опухолевых клеток фракции WT и SPX3 демонстрируют степень ингибирования роста опухоли 55% и 60% соответственно, а SB365 демонстрирует степень ингибирования роста опухоли 79%, выше, чем адриамицин - 64%.

Пример 6. Противоопухолевая активность на голых мышах с трансплантированными клетками NCI-H23

В данном эксперименте используют в качестве подопытных животных самок голых мышей 5-недельного возраста весом 16-25 г, полученных от Harlan Co. (USA). Мышей используют после аклиматизации в течение 1 недели в асептической комнате для животных. В данной комнате для животных поддерживают температуру 22±2°С, влажность 55±5% и 12-часовой цикл свет-темнота, которые регулируются автоматически. Твердый корм для подопытных животных радиоактивно стерилизуют, а питьевую воду стерилизуют в автоклаве. Животных снабжают пищей и питьевой водой без ограничений. Используют клеточную линию опухоли человека из National Cancer Institute (NCI), USA и хранящуюся в Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), Korea. Из опухолевых клеток человека мышам трансплантируют опухолевые клетки легких, клетки NCI-H23. Опухолевые клетки с концентрацией 3×10⁷ клеток/мл трансплантируют мышам подкожно при объеме 0,3 мл/20 г веса тела. Образцы вводят мышам внутрибрюшинно каждый день в течение 13 дней, а именно с 1-го по 14-й день, исключая 8-й день после трансплантации опухолевых клеток. Определяют размер образованной во время инъекции опухоли у каждого животного и также определяют любые изменения веса тела. На 16-й день после трансплантации опухолевых клеток голых мышей умерщвляют, а опухоль выделяют и взвешивают. Животным положительной контрольной группы вводят внутрибрюшинно адриамицин 0,5 мг/кг веса тела на 1-й, 5-й, 9-й и 14-й день. Результат показан далее в таблице 3.

Таблица 3 Степень ингибирования роста опухоли (IR, %) посредством SB365 у голых мышей с трансплантированными клетками NCI-H23
Группа	Степень ингибирования роста опухоли (%) у NCI-H23
Отриц. контроль	Адриамицин (0,5 мг/кг)	SB365 (1,6 мг/кг)	SB365 (3,2 мг/кг)	SB365 (6,4 мг/кг)
16-й деньа)	-	61,5	40,1	52,3	82,1
а) Дни после трансплантации опухолевых клеток

Как показано выше в таблице 3, SB365 в количестве 6,4 мг/кг демонстрирует высокую степень ингибирования роста опухоли 82,1% на 16-й день после трансплантации опухолевых клеток.

Пример 7. Исследование цитотоксичности

Опухолевые клетки A549, SK-MEL-2 и MCF-7 получают от KRIBB и используют в данном эксперименте. Питательную среду готовят, добавляя к стерилизованной дистиллированной воде для инъекций одну упаковку L-глутамин-содержащей среды RPMI1640, 100 мл сыворотки плода коровы (FBS), инактивированной нагреванием на водяной бане с температурой 50°С в течение 30 мин, 2 г NaHCO₃, 100000 единиц пенициллина и 100 мг стрептомицина, регулируя рН смеси посредством 0,1 н. HCl, доводя общий объем до 1 л и дезинфицируя смесь фильтрованием, и хранят до использования при температуре 4°С. Клетки сохраняют посредством размножения один раз в три дня и для отделения клеток от стенок используют раствор, содержащий 0,5% трипсина и 2% ЭДТА в физиологическом буферном растворе (PBS).

Цитотоксичность опухолевых клеток определяют согласно способу с применением сульфородамина-В (SRB), разработанному NCI в 1989 г для определения in vitro противоопухолевой активности лекарств.

В частности, клетки отделяют от стенок при помощи 0,5% раствора трипсин-ЭДТА и затем готовят суспензию клеток 3-5×10⁴ клеток/мл. Далее суспензию клеток добавляют к ячейкам 96-ячеечного планшета (180 мкл/ячейка) и инкубируют планшет в инкубаторе при 37^оС, 5% СО₂ в течение 24 ч.

Образец растворяют в диметилсульфоксиде (ДМСО) и разбавляют питательной средой или трижды дистиллированной водой, получая необходимые для эксперимента концентрации, и производят серийные разведения до конечной концентрации ДМСО 0,2% или менее. К каждой ячейке 96-ячеечного планшета добавляют 20 мкл серийно разведенных растворов образцов и затем инкубируют планшет в инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ в течение 48 ч. В момент T_z (нулевое время) при добавлении раствора образца собирают клетки на планшете. Удаляют среду из T_z-планшета и из каждого планшета по завершении инкубации и добавляют к планшетам 10% трихлоруксусную кислоту (ТСА) (50 мкл/ячейка). Полученные планшеты оставляют стоять в течение 1 ч при 4°С для иммобилизации клеток на дне планшетов. По завершении иммобилизации клеток планшеты промывают 5-6 раз водой для полного удаления оставшегося раствора ТСА и полученные пластины сушат при комнатной температуре, чтобы они не содержали воды.

К полностью высушенным планшетам добавляют 50 мкл окрашивающего раствора с 0,4% SRB в 1% уксусной кислоте, окрашивая клетки в течение 30 мин. Затем планшет промывают 5-6 раз 1% раствором уксусной кислоты для полного удаления SRB, не связанного с клетками. Планшеты сушат при комнатной температуре. Добавляют туда 100 мкл 10 мМ раствора Tris для растворения красителя. Затем измеряют OD (оптическую плотность) при помощи считывателя для микропланшетов при длине волны 520 нм.

Величину ED₅₀ образца на опухолевых клетках [50% эффективная доза (нг/мл): концентрация, при которой рост опухолевых клеток ингибируется на 50%] рассчитывают следующим образом. Величину T_z определяют как значение OD в момент начала инкубации после добавления образца, величину С (контроль) определяют как значение OD ячейки, не обработанной образцом, и величину Т (тест) определяют как значение OD ячейки, обработанной образцом. Из величин T_z, С и Т определяют цитотоксичность агента по следующей формуле:

в случае T_z≥T, (T-T_z)/(C-T_z)×100,

в случае T_z<T, (T-T_z)/T_z×100.

Из рассчитанных выше величин получают значение ED₅₀ образца, используя данные регрессионной функции программы Lotus.

В результате значение ED₅₀ для SB365 на опухолевых клетках легких человека А549, клетках меланомы человека SK-MEL2 и опухолевых клетках молочной железы человека MCF7 составляет >20 мкг/мл, >10 мкг/мл и >10 мкг/мл соответственно. Следовательно, SB365 имеет низкую цитотоксичность на клетках солидных опухолей.

Пример 8. Получение раствора для инъекций, содержащего фракцию WT

250 мг фракции WT, полученной в примере 1, растворяют в 10 мл физиологического раствора, получая раствор для инъекций.

Пример 9. Получение сухого порошка для инъекций, содержащего фракцию SPX3

25 мг фракции SPX3, полученной в примере 2, растворяют в 10 мл раствора Рингера, стерилизуют и затем сушат вымораживанием, получая готовый к применению сухой порошок для инъекций. Перед применением данный порошок восстанавливают в дистиллированной воде для инъекций.

Пример 10. Получение раствора для инъекций, содержащего SВ365

6,5 мг SВ365, полученного в примере 3, растворяют в 10 мл раствора Рингера и стерилизуют, получая раствор для инъекций.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Фракции WT и SPX3 Pulsatillae radix и SB365, гедерагенин 3-О-α-L-рамнопиранозил(1→2)-[β-D-глюкопиранозил(1→4)]-α-L-арабинопиранозид, выделенный из фракций согласно настоящему изобретению, не только обладают высокой степенью ингибирования роста опухолей на клетках солидных опухолей, но также могут быть использованы обычным образом с растворением в различных растворах, включая физиологический раствор, раствор Рингера или питательный раствор, так как они легко растворимы в воде и имеют достаточно низкую токсичность, снижая побочные эффекты разработанных ранее противоопухолевых агентов. Таким образом, ожидается, что они очень полезны в качестве терапевтических средств для солидных опухолей.

1. Применение водорастворимой фракции экстракта Pulsatillae radix, содержащей гедерагенин 3-O-α-L-рамнопиранозил(1→2)-[β-D-глюкопиранозил(1→4)]-α-L-арабинопиранозид, в качестве средства для лечения солидных опухолей.

2. Применение по п.1, где суточная доза средства, из расчета на действующее вещество, составляет от 200 до 300 мг/кг веса тела.

3. Применение по п.1, где экстракт Pulsatillae radix представляет фракцию с R_f в диапазоне от 0,48 до 0,50 и дает красное окрашивание, а затем синее окрашивание после опрыскивания серной кислотой с последующим нагреванием, и указанную фракцию получают путем экстракции Pulsatillae radix водным раствором этанола, с последующим осаждением осадка ацетоном с получением водорастворимой фракции и пропускания данной фракции через колонку Sephadex LH20.

4. Применение по п.3, где водорастворимую фракцию экстракта Pulsatillae radix вводят в суточной дозе от 20 до 40 мг/кг веса тела.

5. Применение по любому из пп.1-4, где водорастворимую фракцию экстракта Pulsatillae radix, предназначенную для введения, растворяют в растворе, выбранном из группы, состоящей из физиологического раствора, раствора Рингера и питательного раствора.

6. Применение гедерагенин 3-O-α-L-рамнопиранозил(1→2)-[β-D-глюкопиранозил(1→4)]-α-L-арабинопиранозида в качестве действующего вещества лекарственного средства для лечения солидных опухолей.

7. Применение по п.6, где суточная доза гедерагенин 3-O-α-L-рамнопиранозил(1→2)-[β-D-глюкопиранозил(1→4)]-α-L-арабинопиранозида составляет от 3,5 до 8 мг/кг веса тела.

8. Применение по п.6, где гедерагенин 3-O-α-L-рамнопиранозил(1→2)-[β-D-глюкопиранозил(1→4)]-α-L-арабинопиранозид, предназначенный для введения, растворяют в растворе, выбранном из группы, состоящей из физиологического раствора, раствора Рингера и питательного раствора.