Гликоформы фактора vii

Изобретение относится к области медицины и касается гликоформ фактора VII и к композициям, содержащим фактор VII, имеющим измененные конфигурации на основе аспарагинсвязанных олигосахаридных цепей. Изобретение также включает способ определения гликоформ полипептидов фактора VII, способ их получения, а также способ лечения заболеваний. Преимущество изобретения заключается в идентификации биологически активных форм рекомбинантного фактора VII. 20 н. и 33 з.п. ф-лы, 6 табл.

 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим фактор VII и другие факторы системы свертывания крови, имеющим измененные конфигурации аспарагинсвязанного гликозилирования.

Предпосылки изобретения

Белки, вовлеченные в систему свертывания, включая, например, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X и белок C, как показано, являются терапевтическими агентами, пригодными для лечения разнообразных патологических состояний. В соответствии с этим существует все возрастающая потребность в препаратах, содержащих эти белки, которые являются фармацевтически приемлемыми и демонстрируют однородную и предсказуемую клиническую эффективность.

Из-за множества недостатков, связанных с использованием плазмы крови человека в качестве источника фармацевтических продуктов, является предпочтительным получение этих белков в рекомбинантных системах. Белки системы свертывания крови, однако, подвергаются множеству ко- и посттрансляционных модификаций, включая, например, аспарагинсвязанное (N-связанное) гликозилирование; O-связанное гликозилирование; и γ-карбоксилирование остатков glu. Эти модификации могут различаться качественно или количественно, когда в качестве хозяев для промышленного получения белков используются гетерологичные клетки. В частности, продуцирование в гетерологичных клетках часто приводит к получению ряда различных гликоформ, которые представляют собой идентичные полипептиды, содержащие различные ковалентно-связанные конфигурации олигосахаридов.

В различных системах различия в конфигурации олигосахаридов терапевтических белков связаны, inter alia, с изменениями в иммуногенности и с клиренсом in vivo. Таким образом, в данной области существует потребность в композициях и способах, которые обеспечивают препараты белков системы свертывания крови, в частности, препараты, содержащие рекомбинантный фактор VII человека, модифицированный фактор VII или полипептиды, родственные фактору VII, которые содержат заданные конфигурации гликоформ.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к препаратам, содержащим полипептиды фактора VII или полипептиды, родственные фактору VII, которые демонстрируют предопределенные конфигурации гликоформ. Как используется здесь, препарат фактора VII или препарат, родственный фактору VII, относится к множеству полипептидов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, включая варианты и химически модифицированные формы, а также формы, которые активируются протеолитически (например, фактор VIIa), которые выделяются из клетки, в которой они синтезируются. Конфигурация гликоформ относится к распределению в препарате олигосахаридных цепей, имеющих различные конфигурации, которые являются ковалентно-связанными с полипептидами фактора VII или полипептидами, родственными фактору VII.

В одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает препарат, содержащий множество полипептидов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, где полипептиды содержат аспарагинсвязанные олигосахаридные цепи и где выполняется одно или несколько из следующих условий: (i) в пределах примерно 94-100% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты; (ii) в пределах примерно 0-7% олигосахаридных цепей имеют нейтральный заряд; (iii) менее чем примерно 16%, например, в пределах примерно 6-16%, олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы; (iv) менее чем примерно 25%, например, в пределах примерно 6-9%, олигосахаридных цепей, содержат, по меньшей мере, один конечный остаток N-ацетилгалактозамина; или (v) менее чем примерно 30%, например, в пределах примерно 11-23%, олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы или N-ацетилгалактозамина. В некоторых воплощениях в дополнение к одному или нескольким из условий (i)-(v): все остатки сиаловой кислоты в олигосахаридных цепях являются связанными с галактозой посредством связи α2->3; по меньшей мере, некоторые из остатков сиаловой кислоты содержат N-гликолилнейраминовую кислоту (Neu5Gc) в дополнение к N-ацетилнейраминовой кислоте (Neu5Ac); и/или олигосахаридные цепи содержат остатки фукозы, связанные α1->6 с каркасом N-ацетилглюкозамина. В одном из воплощений настоящее изобретение охватывает препарат, содержащий фактор VIIa дикого типа, в котором в пределах примерно 94-100% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты, и все остатки сиаловой кислоты связаны с галактозой посредством связи α2->3. В другом воплощении настоящее изобретение охватывает препарат, содержащий фактор VIIa дикого типа, в котором в пределах примерно 94-100% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты, и по меньшей мере, некоторые из остатков сиаловой кислоты представляют собой N-гликолилнейраминовую кислоту. Еще в одном воплощении настоящее изобретение охватывает препарат, содержащий фактор VIIa дикого типа, в котором в пределах примерно 94-100% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты, и по меньшей мере, некоторые из цепей содержат N-ацетилгалактозамин. Препараты по настоящему изобретению, таким образом, не охватывают фактор VII дикого типа или фактор VIIa, который выделяется из плазмы крови человека и не модифицируется ex vivo путем обработки гликозидазой.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает препарат, содержащий множество полипептидов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, где полипептиды содержат аспарагинсвязанные олигосахаридные цепи и где, по меньшей мере, примерно 2% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, одну фукозу, связанную α1->3 с антеннарным остатком N-ацетилглюкозамина (то есть с остатком N-ацетилглюкозамина, который связан β1->2, 4 или 6 с остатком Man). Предпочтительно, по меньшей мере, примерно 5% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один такой антеннарный остаток фукозы; более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 10% или 20%; и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно 40%.

Препараты в соответствии с настоящим изобретением могут содержать один или несколько из следующих соединений: фактора VII дикого типа; фактора VII дикого типа, который подвергся химической и/или ферментативной модификации; и вариантов фактора VII, имеющих одно или несколько изменений в аминокислотной последовательности, по отношению к фактору VII дикого типа. Препараты по настоящему изобретению могут быть получены из клеток человека, экспрессирующих фактор VII из эндогенного гена фактора VII, или из клеток, запрограммированных на экспрессию фактора VII или полипептида, родственного фактору VII, из рекомбинантного гена.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает препараты, содержащие фактор VII или полипептиды, родственные фактору VII, которые демонстрируют одно или несколько улучшенных функциональных свойств, включая, без ограничения, повышенную стабильность при хранении, биологическую доступность и/или половинное время жизни.

В другом аспекте настоящее изобретение охватывает способы для определения и/или оптимизации конфигурации гликоформ фактора VII и полипептидов, родственных фактору VII, которые осуществляются с помощью стадий:

(a) культивирования клетки, экспрессирующей фактор VII или полипептиды, родственные фактору VII, при первом наборе заданных условий культивирования;

(b) извлечения фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, из культуры, с получением препарата, содержащего полипептиды; и

(c) анализа конфигурации олигосахаридов, связанных с полипептидами, для определения конфигурации гликоформ препарата.

Способы могут дополнительно включать в себя изменение условий культивирования стадии (a) для получения второго набора, заданных условий культивирования; и повторение стадий до тех пор, пока не будет получена желаемая конфигурация гликоформ. Альтернативно, способы могут дополнительно включать в себя химическую или ферментативную обработку препарата для изменения конфигурации олигосахаридов; и повторение стадий до тех пор, пока не будет получена желаемая конфигурация гликоформ. Кроме того, способы могут включать в себя дополнительные стадии, на которых препараты, имеющие заданные конфигурации гликоформ, подвергаются, по меньшей мере, одному исследованию на биологическую активность или иную функциональность (например, фармакокинетический профиль или стабильность) и установлению корреляций между конкретными структурами гликоформ и конкретными профилями биологической активности или функциональности.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способы для получения препарата, содержащего полипептиды фактора VII или полипептиды, родственные фактору VII, имеющие заданную конфигурацию N-связанного гликозилирования. В некоторых воплощениях способы осуществляются путем культивирования клетки, экспрессирующей полипептиды, при условиях, в которых, по меньшей мере, примерно 94% аспарагинсвязанных олигосахаридов, связанных с полипептидами фактора VII или с полипептидами, родственными фактору VII, содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты, например, один, два, три или четыре остатка сиаловой кислоты. В некоторых воплощениях способы осуществляются путем культивирования клетки, экспрессирующей полипептиды, при условиях, в которых, по меньшей мере, примерно 5% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, одну фукозу, связанную α1->3 с антеннарным остатком N-ацетилглюкозамина. В некоторых воплощениях полипептиды фактора VII или полипептиды, родственные фактору VII, в зависимости от их происхождения подвергаются ферментативным обработкам для получения желаемых конфигураций гликоформ.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает фармацевтические препараты, содержащие препараты по настоящему изобретению и способы для предотвращения и/или лечения синдромов, которые являются чувствительными к полипептидам фактора VII или к полипептидам, родственным фактору VII. Способы включают в себя введение фармацевтических препаратов пациенту, нуждающемуся в лечении, в условиях, приводящих либо к усилению, либо к ингибированию свертывания крови. В одной серии воплощений препараты фактора VII вводятся, когда является желательным усиление свертывания крови, например, при гемофилии A, гемофилии B, дефиците фактора XI, дефиците фактора VII, тромбоцитопении или болезни фон Виллебранда; при синдромах, сопровождаемых присутствием ингибитора фактора свертываемости; до, во время или после хирургической операции или терапевтического лечения с помощью антикоагулянтов; или после травмы. В другой серии воплощений препараты полипептидов, родственных фактору VII (то есть препараты, имеющие пониженную или модифицированную биологическую активность по отношению к фактору VII дикого типа), вводятся для уменьшения свертывания крови, например, у пациентов, подвергающихся ангиопластике, или у тех, кто страдает глубоким тромбозом вен, легочной эмболией, инсультом, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием (DIG), отложением фибрина в легких и почках, связанным с грамотрицательной эндотоксимией, или инфарктом миокарда. В соответствии с настоящим изобретением препараты полипептидов, родственных фактору VII, также могут вводиться, когда является желательным модифицировать, например, уменьшить, внутриклеточную передачу сигнала через путь, опосредуемый тканевым фактором (TF), для лечения таких состояний, например, как острый респираторный дистресс-синдром (ARDS), синдром системной воспалительной реакции (SIRS), синдром гемолитической уремии (HUS), множественный отказ органов (MOF) и тромбоцитопеническая пурпура (TTP).

Подробное описание изобретения

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что препараты белков-коагулянтов, имеющих заданные конфигурации гликоформ, демонстрируют улучшенные функциональные свойства. В соответствии с этим настоящее изобретение относится к способам и композициям, которые обеспечивают получение этих белковых препаратов. В частности, настоящее изобретение относится к препаратам, содержащим полипептиды фактора VII и полипептиды, родственные фактору VII, имеющим конкретные заданные конфигурации аспарагинсвязанных (N-связанных) олигосахаридов. Препараты по настоящему изобретению демонстрируют измененные свойства, включая, без ограничения, улучшенные фармакокинетические свойства и улучшенную клиническую эффективность. Настоящее изобретение также охватывает фармацевтические композиции, которые содержат эти препараты, а также терапевтические способы, которые используют эти препараты.

Полипептиды фактора VII и полипептиды, родственные фактору VII

Настоящее изобретение охватывает полипептиды фактора VII человека, например, такие как те, которые имеют аминокислотную последовательность, описанную в патенте США № 4784950 (фактор VII дикого типа). Как используется здесь, "фактор VII" или "полипептид фактора VII" охватывает фактор VII дикого типа, а также варианты фактора VII, демонстрирующие, по существу, такую же или улучшенную биологическую активность по сравнению с фактором VII дикого типа. Термин "фактор VII" предназначен для того, чтобы охватывать полипептиды фактора VII в их нерасщепленной (зимогенной) форме, а также те, которые обрабатываются протеолитически, с получением соответствующих их биологически активных форм, которые могут быть обозначены как фактор VIIa. Как правило, фактор VII расщепляется между остатками 152 и 153 для получения фактора VIIa.

Как используется здесь, термин "полипептиды, родственные фактору VII" охватывает полипептиды, включая варианты, в которых биологическая активность фактора VIIa значительно изменяется или понижается, если сравнивать с активностью фактора VIIa дикого типа. Эти полипептиды включают в себя, без ограничения, фактор VII или фактор VIIa, которые химически модифицируются, и варианты фактора VII, в которые вводятся конкретные изменения аминокислотной последовательности, которые модифицируют или разрушают биологическую активность полипептида.

Биологическая активность фактора VIIa при свертывании крови происходит от его способности (i) связываться с тканевым фактором (TF) и (ii) катализировать протеолитическое расщепление фактора IX или фактора X с получением активированного фактора IX или X (фактора IXa или Xa, соответственно). Для целей настоящего изобретения биологическая активность фактора VIIa может быть определена количественно, путем измерения способности препарата способствовать свертыванию крови, с использованием плазмы с дефицитом фактора VII и тромбопластина, как описывается, например, в патенте США № 5997864. В этом анализе биологическая активность выражается как уменьшение времени свертывания по сравнению с контрольным образцом и преобразуется в "единицы фактора VII" путем сравнения с хранимым стандартом сыворотки крови человека, содержащим 1 единицу/мл активности фактора VII. Альтернативно, биологическая активность фактора VIIa может быть определена количественно путем (i) измерения способности фактора VIIa продуцировать фактор Xa в системе, содержащей TF, включенный в липидную мембрану, и фактор X. (Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997); (ii) измерения гидролиза фактора X в водной системе (см. пример 5, ниже); (iii) измерения его физического связывания с TF, используя средства на основе поверхностного плазмонного резонанса (Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997); (iv) измерения гидролиза синтетического субстрата (см. пример 4, ниже); и (v) измерения генерации тромбина в TF-независимой системе in vitro.

Варианты фактора VII, имеющие, по существу, такую же или улучшенную биологическую активность по сравнению с фактором VIIa дикого типа, охватывают те соединения, которые демонстрируют, по меньшей мере, примерно 25%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 75% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно 90% от специфичной активности фактора VIIa дикого типа, который продуцируется в том же типе клеток, когда они исследуются в одном или нескольких анализах из числа анализа с помощью свертывания, анализа с помощью протеолиза или анализа связывания TF, как описано выше. Варианты фактора VII, имеющие значительно пониженную биологическую активность по сравнению с фактором VIIa дикого типа, представляют собой такие, которые демонстрируют менее чем примерно 25%, предпочтительно, менее чем примерно 10%, более предпочтительно, менее чем примерно 5% и, наиболее предпочтительно, менее чем примерно 1% от специфичной активности фактора VIIa дикого типа, который продуцируется в клетках того же типа, если исследовать в одном или нескольких анализах из числа анализа свертывания, анализа протеолиза или анализа связывания TF, как описано выше. Варианты фактора VII, имеющие значительно модифицированную биологическую активность по сравнению с фактором VII дикого типа, включают в себя, без ограничения, варианты фактора VII, которые демонстрируют TF-независимую протеолитическую активность фактора X, и те, которые связывают TF, но не расщепляют фактор X.

Варианты фактора VII, либо демонстрирующие, по существу, такую же или лучшую биологическую активность, чем фактор VII дикого типа, либо, альтернативно, демонстрирующие значительно модифицированную или пониженную биологическую активность по сравнению с фактором VII дикого типа, включают в себя, без ограничения, полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности фактора VII дикого типа вставкой, удалением или заменой одной или нескольких аминокислот. Не ограничивающие примеры вариантов фактора VII, имеющих, по существу, такую же биологическую активность, как и фактор VII дикого типа, включают в себя S52A-FVIIa, S60A-FVIIa (lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352:182-192, 1998); варианты FVIIa, демонстрирующие повышенную протеолитическую стабильность, описаны в патенте США № 5580560; фактор VIIa, который протеолитически расщеплен между остатками 290 и 291 или между остатками 315 и 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); и окисленные формы фактора VIIa (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999). Не ограничивающие примеры вариантов фактора VII, имеющих существенно пониженную или модифицированную биологическую активность по сравнению с фактором VII дикого типа, включают в себя R152E-FVIIa (Wildgoose et al., Biochem 29:3413-3420, 1990), S344A-FVIIa (Kazama et al., J. Biol. Chem. 270:66-72, 1995), FFR-FVIIa (Holst et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15:515-520, 1998), и фактор VIIa, где отсутствует домен Gla (Nicolaisen et al., FEBS Letts. 317:245-249, 1993). Неограничивающие примеры полипептидов и вариантов последовательностей химически модифицированного фактора VII описаны, например, в патенте США № 5997864.

Аспарагинсвязанное гликозилирование

Настоящее изобретение предусматривает препараты полипептидов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, которые содержат определенный спектр гликоформ фактора VII, то есть полипептиды фактора VII или полипептиды, родственные фактору VII, имеющие заданные конфигурации аспарагинсвязанных (N-связанных) олигосахаридных цепей.

Как здесь используется, "конфигурация" N-связанного гликозилирования или "конфигурация" гликоформ, "распределение" или "спектр" относится к представлению конкретных конфигураций олигосахаридов в данной популяции полипептидов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII. Неограничивающие примеры таких конфигураций включают в себя относительную долю олигосахаридных цепей, которые (i) содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты; (ii) не имеют никаких остатков сиаловой кислоты (то есть являются нейтральными по заряду); (iii) содержат, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы; (iv) содержат, по меньшей мере, один конечный остаток N-ацетилгалактозамина; (v) содержат, по меньшей мере, одну "неблокированную" антенну, то есть содержат, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы или N-ацетилгалактозамина; или (vi) содержат, по меньшей мере, одну фукозу, связанную α1->3 с антеннарным остатком N-ацетилглюкозамина.

Как здесь используется, термин олигосахаридная цепь относится ко всей олигосахаридной конфигурации, которая ковалентно связана с одним отдельно взятым аспарагиновым остатком. Фактор VII обычно является гликозилированным на Asn 145 и Asn 322. N-связанная олигосахаридная цепь, присутствующая на факторе VII, продуцируемом у человека in situ, может быть би-, три или тетраантеннарным, при этом каждая антенна, имеющая конфигурацию Neu5Ac(α2->3 или α2->6)Gal(β1->4) GlcNAc, связывается (β1->2, 4 или 6) с остатком Man, который является связанным (α1->3 или 6) с Man(β1->4)GlcNAc(β1->4)GlcNAc-Asn. (Neu5Ac обозначает N-ацетилнейраминовую кислоту (сиаловую кислоту), Gal обозначает галактозу, GlcNAc обозначает N-ацетилглюкозамин, и Man обозначает маннозу). Олигосахаридные цепи также могут содержать остатки фукозы, которые могут быть связаны α1->6 с GlcNAc. когда фактор VII продуцируется у человека in situ, у некоторых олигосахаридных цепей отсутствуют остатки фукозы в каркасе; у всех цепей отсутствуют антеннарные остатки фукозы; и все цепи являются почти полностью сиалилированными, то есть конечный сахар каждой антенны представляет собой N-ацетилнейраминовую кислоту, связанную с галактозой посредством связи α2->3 или α2->6.

Однако, когда он продуцируется в других обстоятельствах, фактор VII может содержать олигосахаридные цепи, имеющие различные конечные конфигурации на одной или нескольких из их антенн, например, такие, где отсутствуют остатки сиаловой кислоты; содержащие остатки N-гликолилнейраминовой кислоты (Neu5Gc); содержащие конечный остаток N-ацетилгалактозамина (GalNAc) вместо галактозы; и тому подобное. Когда они продуцируются, например, в клетках BHK, культивируемых в присутствии сыворотки теленка, препараты фактора VII демонстрируют следующие конфигурации олигосахаридов:

- 87-93% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты;

- 7-13% являются нейтральными (сиаловая кислота отсутствует);

- 9-16% содержат, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы;

- 19-29% содержат, по меньшей мере, один конечный остаток N-ацетилгалактозамина; и

- 30-39% содержат, по меньшей мере, одну неблокированную антенну, то есть содержат, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы или N-ацетилгалактозамина.

Авторы настоящего изобретения создали препараты фактора VII, содержащие конкретные заданные конфигурации олигосахаридов, которые отличаются от тех, которые описаны ранее. Настоящее изобретение охватывает препараты, содержащие полипептиды фактора VII или полипептиды, родственные фактору VII, демонстрирующие одну или несколько из следующих конфигураций гликоформ:

(i) В пределах примерно 94-100% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты, например, в пределах примерно 94-99%, в пределах примерно 95-98% или в пределах примерно 96-97%. В различных воплощениях, по меньшей мере, примерно 94%, 95%, 96% или 97% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты.

(ii) 6% или меньше олигосахаридных цепей являются нейтральными, например, в пределах примерно 1,5-6% или в пределах примерно 2-4%.

(iii) Менее чем примерно 16%, предпочтительно, менее чем примерно 10% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, одну конечную галактозу, например, в пределах примерно 6-10% или в пределах примерно 8-9%;

(iv) Менее чем примерно 25%, предпочтительно, менее чем примерно 10% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один конечный остаток GalNAc, например, в пределах примерно 6-9% или в пределах примерно 7-8%;

(v) Менее чем примерно 30%, предпочтительно, менее чем примерно 25% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, одну неблокированную антенну, например, в пределах примерно 11-23% или в пределах примерно 12-18%; и

(vi) по меньшей мере, примерно 2%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 5%, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 10% или 20% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно 40% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, одну фукозу, связанную α1->3 с антеннарным остатком N-ацетилглюкозамина (то есть с остатком N-ацетилглюкозамина, который связан β1->2, 4 или 6 с остатком Man).

Будет понятно, что каждое из условий (i)-(vi) может представлять отличную конфигурацию гликоформ, которая охватывается настоящим изобретением, то есть препарат в соответствии с настоящим изобретением может быть описан только одним из (i)-(vi). Альтернативно, в зависимости от конкретной конфигурации гликоформ, препарат, охватываемый настоящим изобретением, может быть описан более чем одним условием из (i)-(vi).

Кроме того, препарат, охватываемый настоящим изобретением, может быть описан одним или несколькими условиями из (i)-(vi) в сочетании с одной или несколькими другими структурными особенностями. Например, настоящее изобретение охватывает препараты, содержащие полипептиды фактора VII или полипептиды, родственные фактору VII, в которых остатки сиаловой кислоты (Neu5Ac или Neu5Gc) связаны с галактозой исключительно в конфигурации α2->3. Настоящее изобретение также охватывает препараты, содержащие полипептиды фактора VII или полипептиды, родственные фактору VII, которые содержат фукозу, связанную α1->6 с N-ацетилглюкозамином в каркасе, и/или фукозу, связанную α1->3 с антеннарным N-ацетилглюкозамином. В одном из воплощений препараты по настоящему изобретению охватывают полипептиды фактора VII или полипептиды, родственные фактору VII, в которых более чем 99% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты, и (a) остатки сиаловой кислоты связываются исключительно в конфигурации α2->3, и/или (b) существуют остатки фукозы, связанные с N-ацетилглюкозаминами в каркасе, и/или (c) детектируемое количество антенн заканчивают собой N-ацетилгалактозамин. В одном из воплощений настоящее изобретение охватывает препараты, содержащие фактор VIIa дикого типа, в котором более чем 99% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты, и остатки сиаловой кислоты связаны с галактозой исключительно в конфигурации α2->3. В другом воплощении настоящее изобретение охватывает препараты, содержащие фактор VIIa дикого типа, в котором более чем 99% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты, и по меньшей мере, некоторые олигосахаридные цепи содержат N-ацетилгалактозамин. Настоящее изобретение не охватывает фактор VII дикого типа или фактор VIIa дикого типа, который выделяется из плазмы крови человека и не модифицируется ex vivo путем обработки с помощью гликозидаз.

В одном из воплощений препарат фактора VIIa содержит олигосахаридные цепи, имеющие одну фукозу, связанную α1->3 с одним антеннарным N-ацетилглюкозамином. В другом воплощении препарат фактора VIIa содержит олигосахаридные цепи, имеющие остатки фукозы, связанные α1->3 с каждым антеннарным N-ацетилглюкозамином биантеннарного олигосахарида (сиалиловая структура Льюиса X). В другом воплощении препарат фактора VIIa содержит олигосахаридные цепи, имеющие (i) фукозу, связанную N-ацетилглюкозамином в каркасе, и (ii) одну фукозу, связанную α1->3 с одним антеннарным N-ацетилглюкозамином. В другом воплощении препарат фактора VIIa содержит олигосахаридные цепи, имеющие (i) фукозу, связанную с N-ацетилглюкозамином в каркасе, и (ii) остатки фукозы, связанные α1->3 с каждым антеннарным N-ацетилглюкозамином биантеннарного олигосахарида.

При осуществлении настоящего изобретения конфигурация N-связанных олигосахаридов может определяться с использованием любого способа, известного в данной области, включая, без ограничения: высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ); капиллярный электрофорез (КЭ); ядерный магнитный резонанс (ЯМР); масс-спектрометрию (МС) с использованием методик ионизации, таких как бомбардировка быстрыми атомами, электрораспыление или лазерная десорбция из вспомогательной матрицы (MALDI); газовую хроматографию (ГХ); и обработку с помощью экзогликозидаз в сочетании с анионообменной (АО)-ВЭЖХ, вытеснительной хроматографии (ВХ) или МС. См., например, Weber et al., Anal. Biochem. 225:135 (1995); Klausen et al., J. Chromatog. 718:195 (1995); Morris et al., in Mass spectrometry of biological Materials, McEwen et al., eds., Marcel Dekker, (1990), pp. 137-167; Conboy et al., Biol. Mass Spectrom. 21:397, 1992; Hellerqvist, Meth. Enzymol. 193:554 (1990); Sutton et al., Anal. Biochem. 318:34 (1994); Harvey et al., Organic Mass Spectrometry 29:752 (1994).

После определения полученных из фактора VII олигосахаридных цепей с использованием любого из указанных выше способов (или любого другого способа, который идентифицирует олигосахаридные цепи, имеющие различные конфигурации), определенные типы сопоставляются, например, с одной из групп (i)-(v). Относительное содержание каждого из (i)-(v) вычисляется как сумма олигосахаридов, сопоставляемых с этой группой, по отношению к общему содержанию олигосахаридных цепей в образце.

Например, используя АО-ВЭЖХ, могут быть выявлены 13 или более пиков N-связанных олигосахаридов из препарата рекомбинантного фактора VII, продуцируемого клетками BHK. См., например, Klausen et al., Mol. Biotechnol. 9:195, 1998. Пять из пиков (обозначенных 1-5 в Klausen et al.) не содержат сиаловой кислоты в то время, как восемь из пиков (обозначенные 6, 7, и 10-15) содержат сиаловую кислоту.

Станет понятно, что при данном анализе количество и распределение цепей, содержащих сиаловую кислоту и не содержащих сиаловую кислоту, может зависеть от (a) того полипептида, который экспрессируется; (b) типа клеток и условий культивирования; и (c) способа анализа, который используется, и что получаемые конфигурации могут изменяться в соответствии с этим.

В любом случае после определения олигосахаридов, содержащих сиаловую кислоту, и олигосахаридов, не содержащих сиаловой кислоты, обычные программы анализа данных используются для вычисления площади под каждым пиком; общей площади пиков и процентной доли от общей площади пиков, представленной конкретным пиком. Таким образом, для данного препарата сумма площадей пиков, содержащих сиаловую кислоту/общая площадь пиков ×100 дает значение % сиалилирования для препарата в соответствии с настоящим изобретением (то есть долю олигосахаридных цепей, имеющих, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты). Подобным же образом может быть вычислен % цепей, не содержащих сиаловой кислоты или содержащих, по меньшей мере, одну галактозу или N-ацетилглюкозамин.

Способы для получения препаратов фактора VII, имеющих заданную конфигурацию N-связанных олигосахаридов

Препараты фактора VII, вариантов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, имеющих, каждый, заданную конфигурацию N-связанных олигосахаридов, могут быть получены с помощью соответствующей клетки-хозяина, которая экспрессирует фактор VII или полипептиды, родственные фактору VII.

Клетки-хозяева: В некоторых воплощениях клетки-хозяева представляют собой клетки человека, экспрессирующие эндогенный ген фактора VII. В этих клетках эндогенный ген может быть интактным или может быть модифицирован in situ, или некая последовательность вне гена фактора VII может быть модифицирована in situ, чтобы изменить экспрессию эндогенного гена фактора VII. Может быть использована клетка человека, способная экспрессировать эндогенный ген фактора VII.

В других воплощениях гетерологичные клетки-хозяева программируются для экспрессии фактора VII человека из рекомбинантного гена. Клетки-хозяева могут быть клетками позвоночных, насекомых или грибов. Предпочтительно, клетки представляют собой клетки млекопитающих, обладающих способностью ко всему спектру N-связанного гликозилирования; O-связанного гликозилирования и γ-карбоксилирования млекопитающих. См., например, патент США № 4784950. Предпочтительные линии клеток млекопитающих включают в себя линии клеток CHO (ATCC CCL 61), COS-1 (ATCC CRL 1650), почек детеныша хомячка (BHK) и HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Предпочтительная линия клеток BHK представляет собой линию клеток BHK tk- ts13 (Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982), далее упоминаемые как клетки BHK 570. Линия клеток BHK 570 является доступной от Американской коллекции типовых культур, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, под номером доступа ATCC CRL 10314. Линия клеток BHK tk- ts13 является также доступной от ATCC под номером доступа CRL 1632. Кроме того, может быть использован ряд других линий клеток, включая Rat Hep I (гепатома крысы; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (гепатома крысы; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), легкие человека (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) и клетки DUKX (линия клеток CHO) (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980), (клетки DUKX также упоминаются, как клетки CXB11) и DG44 (линия клеток CHO) (Cell, 33:405, 1983, and Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555, 1986). Также пригодными для использования являются клетки 3T3, клетки Namalwa, миеломы и продукты слияния миелом с другими клетками. В особенно предпочтительном воплощении клетки-хозяева представляют собой клетки BHK 21, которые адаптированы для роста в отсутствие сыворотки и запрограммированы для экспрессии фактора VII. В некоторых воплощениях клетки могут представлять собой мутантные или рекомбинантные клетки, которые экспрессируют качественно или количественно иной спектр ферментов гликозилирования (таких, например, как гликозилтрансферазы и/или гликозидазы), чем тип клеток, из которых они получены. Клетки также могут быть запрограммированы для экспрессии других гетерологичных пептидов или белков, включая, например, процессированные формы фактора VII.

В одном из воплощений клетки-хозяева представляют собой клетки CHO, которые запрограммированы для коэкспрессии как представляющего интерес полипептида фактора VII (то есть фактора VII или полипептида, родственного фактору VII), так и другого гетерологичного пептида или полипептида, такого, например, как модифицующий фермент или фрагмент фактора VII.

Способы: Настоящее изобретение охватывает способы для получения препарата, содержащего любую из конфигураций гликоформ, описанных выше как (i)-(vi), и в дополнительном воплощении способы для оптимизации распределения гликоформ фактора VII и полипептидов, родственных фактору VII. Эти способы осуществляются с помощью стадий:

(a) культивирования клетки, экспрессирующей фактор VII или полипептиды, родственные фактору VII, при первом наборе заданных условий культивирования;

(b) извлечения фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, из культуры, для получения препарата, содержащего полипептиды; и

(c) анализа конфигурации олигосахаридов, связанных с полипептидами, для определения конфигурации гликоформ.

Способы могут, кроме того, включать в себя:

(d1) изменение условий культивирования на стадии (a) для получения второго набора заданных условий культивирования;

(e1) повторение стадий (b)-(d1) до тех пор, пока не будет получена желаемая конфигурация гликоформ.

Альтернативно, способы могут, кроме того, включать в себя:

(d2) химическую и/или ферментативную обработку препарата для изменения конфигурации олигосахаридов; и

(e2) повторение стадий (b)-(d2) до тех пор, пока не будет получена желаемая конфигурация гликоформ.

Эти способы могут дополнительно включать в себя стадию, на которой препараты, имеющие заданные конфигурации гликоформ, подвергаются, по меньшей мере, одному исследованию биологической активности (включая, например, свертывание, протеолиз фактора X или связывание TF) или другой функциональности (такой, например, как фармакокинетический профиль или стабильность) и установлению корреляций конкретных конфигураций гликоформ с конкретными профилями биологической активности или функциональности в соответствии с идентификацией желаемой конфигурации гликоформ.

Параметры условий культивирования, которые могут быть изменены на стадии (d1), включают в себя, без ограничения: клетку происхождения, такую, например, как клетка, полученная от видов, иных, чем использовались исходно; или мутантная или рекомбинантная клетка, имеющая изменения в одной или нескольких гликозилтрансферазах или гликозидазах, или в других компонентах аппарата гликозилирования (см. Grabenhorst et al., Glycoconjugate J. 16:81, 1999; Bragonzi et al., Biochem. Biophys. Acta 1474:273, 2000; Weikert, Nature Biotechnol. 17:1116, 1999); уровень экспрессии полипептида; условия метаболизма, такие, например, как концентрация глюкозы или глутамина; отсутствие или присутствие сыворотки; концентрация витамина K; гидролизаты белков, гормонов, следы металлов, солей, а также параметры процесса, подобные температуре, уровню растворенного кислорода и значению pH.

Ферментативные обработки, которые могут быть использованы на стадии (d2) для модификации конфигурации олигосахаридов препарата, включают в себя, без ограничения, обработку одним или несколькими ферментами из сиалидазы (нейраминидазы), галактозидазы, фукозидазы; галактозилтрансферазы, фукозилтрансферазы и/или сиалилтрансферазы последовательно и при условиях, которые дают желаемую модификацию в распределении олигосахаридных цепей, имеющих конкретные конечные структуры. Гликозилтрансферазы являются коммерчески доступными от Calbiochem (La Jolla, CA), а гликозидазы являются коммерчески доступными от Glyko, Inc., (Novato, CA).

В одном ряду воплощений клетки-хозяева, экспрессирующие фактор VII или родственный полипептид, подвергаются воздействию конкретных условий культивирования, при которых они секретируют гликозилированные полипептиды фактора VII, имеющие желаемую конфигурацию олигосахаридных конфигураций, описанных выше как любая из (i)-(vi). Такие условия культивирования включают в себя, без ограничения, восстановление в сыворотке или при полном ее отсутствии. Предпочтительно, клетки-хозяева являются адаптированными для роста в отсутствие сыворотки и культивируются в отсутствие сыворотки как в фазе роста, так и в фазе продуцирования. Такие процедуры адаптирования описаны, например, в Scharfenberg, et al., Animal Cell Technology Developments towards the 21st Century, E.C. Beuvery et al. (Eds.), Kluwer Academic Publishers, pp. 619-623, 1995 (клетки BHK и CHO); Cruz, Biotechnol. Tech. 11:117-120, 1997 (клетки насекомых); Keen, Cytotechnol. 17:203-211, 1995 (клетки миеломы); Berg et al., Biotechniques 14:972-978, 1993 (клетки почек человека 293). В предпочтительном воплощении среда роста, которая добавляется к клеткам, не содержит белка или другого компонента, который выделяется из ткани животного или культуры животных клеток. См., например, пример 1, ниже. Как правило, в дополнение к обычным компонентам среда, пригодная для продуцирования фактора VII, содержит витамин K при концентрации в пределах 0,1-50 мг/литр, который требуется для γ-карбоксилирования глутаминовых остатков в факторе VII.

В другом ряду воплощений гликоформы по настоящему изобретению продуцируются путем воздействия на препарат фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, для ферментативной и/или химической модификации N-связанных олигосахаридов, содержащихся в нем.

Препараты фактора VII

Как используется здесь, термин "препарат фактора VII" относится к множеству полипептидов фактора VII, полипептидов фактора VIIa или полипептидов, родственных фактору VII, включая варианты и химически модифицированные формы, которые выделяются из клетки, в которой они синтезируются.

Выделение полипептидов из клеток их происхождения может быть достигнуто с помощью любого способа, известного в данной области, включая, без ограничения, удаление среды культивирования клеток, содержащий желаемый продукт, из культуры монослоя клеток; центрифугирование или фильтрование для удаления не прилипших клеток; и тому подобное.

Необязательно, полипептиды фактора VII могут быть дополнительно очищены. Очистка может быть произведена с использованием любого способа, известного в данной области, включая, без ограничения, аффинную хроматографию, такую, например, как на колонке с антителом анти-фактор VII (см., например, Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097, 1986; и Thim et al., Biochem. 27:7785, 1988); хроматографию гидрофобного взаимодействия; ионообменную хроматографию; эксклюзионную хроматографию; электрофоретические процедуры (например, препаративное изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ)), различия в растворимости (например, преципитацию сульфатом аммония) или экстрагирование и тому подобное. См., в целом, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; and Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989. После очистки препарат, предпочтительно, содержит менее чем примерно 10 мас.%, более предпочтительно, менее чем примерно 5% и, наиболее предпочтительно, менее чем примерно 1% белков, не относящихся к фактору VII, полученных из клетки-хозяина.

Полипептиды фактора VII и полипептиды, родственные фактору VII, могут быть активированы путем протеолитического расщепления, используя фактор XIIa или другие протеазы, имеющие специфичность, подобную трипсину, такие, например, как фактор IXa, калликреин, фактор Xa и тромбин. См., например, Osterud et al., Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, патент США № 4456591; и Hedner et al., J. Clin. Invest. 71:1836 (1983). Альтернативно, фактор VII может быть активирован путем его пропускания через ионообменную хроматографическую колонку, такую как Mono Q® (Pharmacia), или тому подобное. Полученный активированный фактор VII затем может приготавливаться и вводиться, как описано ниже.

Функциональные свойства препаратов фактора VII

Препараты полипептидов фактора VII и полипептидов, родственных фактору VII, имеющих заданные олигосахаридные конфигурации в соответствии с настоящим изобретением, демонстрируют улучшенные функциональные свойства по сравнению с эталонными препаратами. Улучшенные функциональные свойства могут включать в себя, без ограничения, a) физические свойства, такие, например, как стабильность при хранении; b) фармакокинетические свойства, такие, например, как биологическая доступность и половинное время жизни; и c) иммуногенность для людей.

Термин эталонный препарат относится к препарату, содержащему полипептид, который является идентичным тому, который содержится в препарате по настоящему изобретению, с которым он сравнивается (такой, например, как фактор VII дикого типа или конкретный вариант, или химически модифицированная форма), за исключением демонстрации отличной конфигурации аспарагинсвязанного гликозилирования. Например, эталонные препараты, как правило, имеют одну или несколько из следующих конфигураций гликоформ: (i) менее чем примерно 93% (например, менее чем примерно 92% или менее чем примерно 90%) олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты; (ii) по меньшей мере, примерно 6% (например, по меньшей мере, примерно 7,5% или, по меньшей мере, примерно 10%) олигосахаридных цепей не содержат никакой сиаловой кислоты (то есть являются нейтральными); (iii) по меньшей мере, примерно 10% (например, по меньшей мере, примерно 12,5% или, по меньшей мере, примерно 15%) олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы; (iv) по меньшей мере, примерно 15% (например, по меньшей мере, примерно 20% или, по меньшей мере, примерно 25%) олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один конечный остаток N-ацетилгалактозамина; (v) по меньшей мере, примерно 25% (например, по меньшей мере, примерно 30% или, по меньшей мере, примерно 35%) олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, одну неблокированную антенну (то есть содержат, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы или N-ацетилгалактозамина); или (vi) по существу, недетектируемые уровни (например, менее чем примерно 0,2%) антеннарных остатков фукозы.

Стабильность при хранении препарата фактора VII может быть оценена путем измерения (a) времени, требуемого для 20% снижения биологической активности препарата, когда он хранится в виде сухого порошка, при 25°C, и/или (b) времени, требуемого для удвоения доли агрегатов фактора VIIa в препарате.

В некоторых воплощениях препараты по настоящему изобретению демонстрируют увеличение, по меньшей мере, примерно на 30%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 60%, а более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 100% времени, требуемого для 20% снижения биологической активности, по сравнению со временем, требуемым для того же явления в эталонном препарате, когда оба препарата хранятся в виде сухих порошков при 25°C. Измерения биологической активности могут осуществляться с использованием любого анализа из: анализа свертывания, анализа протеолиза, анализа TF-связывания или анализа TF-независимого генерирования тромбина.

В некоторых воплощениях препараты по настоящему изобретению демонстрируют увеличение, по меньшей мере, примерно на 30%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 60% и, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 100% времени, требуемого для удвоения количества агрегатов, по сравнению с эталонным препаратом, когда оба препарата хранятся в виде сухих порошков, при 25°C. Содержание агрегатов определяется с помощью гельпроникающей ВЭЖХ на колонке Protein Pak 300 SW (7,5×300 мм) (Waters, 80013) следующим образом. Колонка уравновешивается с помощью элюента A (0,2 M сульфата аммония, 5% изопропанола, pH доводится до 2,5 с помощью фосфорной кислоты, и после этого pH доводится до 7,0 с помощью триэтиламина), после чего в колонку вводится 25 мкг образца. Элюирование производится с помощью элюента A при скорости потока 0,5 мл/мин в течение 30 мин и детектирование осуществляется путем измерения коэффициента поглощения при 215 нм. Содержание агрегатов вычисляется как площадь пика агрегатов фактора VII/общая площадь пиков фактора VII (мономер и агрегаты).

Термин "биологическая доступность" относится к доле введенной дозы препарата фактора VII или препарата, родственного фактору VII, который может детектироваться в плазме крови в заданные моменты времени после введения. Как правило, биологическая доступность измеряется на исследуемых животных путем введения дозы препарата в пределах примерно 25-250 мкг/кг; получения образцов плазмы крови в заданные моменты времени после введения; и определения содержания полипептидов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, в образцах, используя один или несколько анализов из анализа с помощью свертывания (или любого биологического анализа), иммунологического анализа, или какого-либо их эквивалента. Данные, как правило, представляются графически в виде [фактор VII] как функция от времени, и биологическая доступность выражается как площадь под кривой (AUC). Относительная биологическая доступность исследуемого препарата относится к отношению AUC исследуемого препарата к этому же параметру для эталонного препарата.

В некоторых воплощениях препараты по настоящему изобретению демонстрируют относительную биологическую доступность, по меньшей мере, примерно 110%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 120%, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 130%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно 140% от биологической доступности эталонного препарата. Биологическая доступность может быть измерена на любых видах млекопитающих, предпочтительно, на собаках, и заданные моменты времени, используемые для вычисления AUC, могут охватывать различные интервалы от 10 мин до 8 ч.

Термин "половинное время жизни" относится ко времени, необходимому для понижения концентрации полипептидов фактора VII и полипептидов, родственных фактору VII, в плазме крови от конкретного значения до половины этого значения. Половинное время жизни может быть определено с использованием такой же процедуры, как и для биологической доступности. В некоторых воплощениях препараты по настоящему изобретению демонстрируют увеличение половинного времени жизни, по меньшей мере, примерно на 0,25 часа, предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 0,5 часа, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 1 час и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 2 часа по отношению к половинному времени жизни эталонного препарата.

Термин "иммуногенность" препарата относится к способности этого препарата, когда он вводится людям, вызывать вредную иммунную реакцию, либо гуморальную, либо клеточную, либо обе вместе. полипептиды фактора VIIa и полипептиды, родственные фактору VIIa, не являются известными как вызывающие детектируемые иммунные реакции у людей. Тем не менее, в любой человеческой субпопуляции могут существовать индивидуумы, которые проявляют чувствительность к конкретным вводимым белкам. Иммуногенность может быть измерена путем количественного определения присутствия антител антифактор VII и/или T-лимфоцитов, чувствительных к фактору VII, у чувствительного индивидуума, используя обычные способы, известные в данной области. В некоторых воплощениях препараты по настоящему изобретению демонстрируют понижение иммуногенности у чувствительного индивидуума, по меньшей мере, примерно на 10%, предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 25%, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 40%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно на 50% по отношению к иммуногенности эталонного препарата у этого же индивидуума.

Фармацевтические композиции и способы их применения

Препараты по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения любого синдрома, чувствительного к фактору VII, такого, например, как расстройства, связанные с кровотечениями, включая, без ограничения, те, которые вызываются дефицитом фактора системы свертывания крови (например, гемофилия A и B, или дефицит факторов свертывания XI или VII); тромбоцитопенией или болезнью фон Виллебранда, или ингибиторами фактора свертываемости, или избыточным кровотечением любого происхождения. Препараты могут также вводиться пациентам в связи с хирургической операцией или другой травмой, или пациентам, получающим терапевтическое лечение антикоагулянтами.

Препараты, содержащие полипептиды, родственные фактору VII, в соответствии с настоящим изобретением, которые имеют значительно пониженную биологическую активность по сравнению с фактором VII дикого типа, могут использоваться в качестве антикоагулянтов, например, у пациентов, подвергающихся ангиопластическим операциям или другим хирургическим процедурам, которые могут увеличить риск тромбоза или окклюзии кровеносных сосудов, как происходит, например, при рестенозе. Другие медицинские показания, при которых предписываются антикоагулянты, включают, без ограничения, глубокий тромбоз вен, легочную эмболию, инсульт, диссеминированное внутрисосудистое свертывание (DIG), отложение фибрина в легких и почках, связанное с грамотрицательной эндотоксимией, инфаркт миокарда; острый респираторный дистресс-синдром (ARDS), синдром системной воспалительной реакции (SIRS), синдром гемолитической уремии (HUS), MOF и TTP.

Фармацевтические композиции, содержащие препараты фактора VII и препараты, родственные фактору VII, по настоящему изобретению, предназначены, прежде всего, для парентерального введения в целях профилактического и/или терапевтического лечения. Предпочтительно, фармацевтические композиции вводятся парентерально, то есть внутривенно, подкожно или внутримышечно. Они могут вводиться с помощью непрерывного или пульсирующего вливания.

Фармацевтические композиции или препараты содержат препарат по настоящему изобретению в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно, с водным носителем или разбавителем, предпочтительно, растворенным в нем. может быть использовано множество водных носителей, таких как вода, вода с буфером, 0,4% солевой раствор, 0,3% глицин и тому подобное. Препараты по настоящему изобретению также могут приготавливаться в виде липосомных препаратов для доставки или направленного транспорта к местам повреждений. Липосомные препараты описаны, в целом, например, в патентах США №№ 4837028, 4501728 и 4975282. Композиции могут быть стерилизованы с помощью обычных, хорошо известных методик стерилизации. Полученные водные растворы могут быть упакованы для использования или отфильтрованы при асептических условиях и лиофилизованы, при этом лиофилизированный препарат объединяется со стерильным водным раствором непосредственно перед введением.

Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества или адъюванты, включая, без ограничения, агенты для установления pH и буферы, и/или агенты для установления тоничности, такие, например, как ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция и тому подобное.

Концентрация полипептидов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, в этих препаратах может изменяться в широких пределах, то есть от меньшей чем примерно 0,5 мас.%, как правило, или, по меньшей мере, примерно 1 мас.%, вплоть до 15 или 20 мас.%, и должна выбираться, прежде всего, в соответствии с объемами жидкости, вязкостями и тому подобное в соответствии с конкретным выбранным способом введения.

Таким образом, может быть изготовлена типичная фармацевтическая композиция для внутривенного введения, содержащая до 250 мл стерильного раствора Рингера и 10 мг препарата. Современные способы для приготовления вводимых парентерально композиций должны быть известны или очевидны для специалиста в данной области, и они описаны более подробно, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990).

Композиции, содержащие препараты по настоящему изобретению, могут вводиться для профилактического и/или терапевтического лечения. При терапевтических применениях композиции вводятся пациенту, уже страдающему заболеванием, как описывается выше, в количестве, достаточном для излечения, облегчения или частичной приостановки заболевания и его осложнений. Количество, адекватное для достижения этого, определяется как "терапевтически эффективное количество". Эффективные количества для каждой цели должны зависеть от тяжести заболевания или повреждения, а также от массы и общего состояния пациента. Как правило, однако, эффективное количество должно находиться в пределах примерно от 0,05 мг примерно до 500 мг препарата в день для 70 кг пациента, при этом дозы примерно от 1,0 мг примерно до 200 мг препарата в день используются более часто. Будет понятно, что определение соответствующей дозировки может быть осуществлено с использованием рутинных экспериментов путем построения матрицы значений и исследования различных точек в матрице.

Местная доставка препаратов по настоящему изобретению, такая, например, как местное нанесение, может осуществляться, например, посредством спрея, перфузии, двойных катетеров-баллонов, стента, вводиться в трансплантаты или стенты в сосудах, гидрогелей, используемых для нанесения на катетеры-баллоны, или с помощью других, хорошо известных способов. В любом случае фармацевтические композиции должны обеспечивать количество препарата, достаточное для эффективного лечения пациента.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать другие биологически активные агенты, такие, например, как не связанные с фактором VII коагулянты или антикоагулянты.

Следующие далее примеры рассматриваются как не ограничивающие иллюстрации настоящего изобретения.

Пример 1: Получение и анализ препарата фактора VII, демонстрирующего измененную конфигурацию гликоформ

Следующий далее эксперимент осуществляется для получения препарата фактора VII, имеющего измененную конфигурацию гликоформ.

I. Продуцирование: Линия клеток BHK, трансформированная с помощью плазмиды, кодирующей фактор VII, адаптируется для роста в культуре суспензии, в отсутствие сыворотки. Клетки выращивают непрерывно в культуре с перемешиванием, и когда количество клеток возрастает, объем постепенно увеличивают путем добавления новой среды.

Наконец, 6 л затравочной культуры инокулируют в 100-литровый промышленный биологический реактор, содержащий макропористые носители Cytopore 1 (Pharmacia), после чего суспендированные клетки иммобилизуются на носителях. Культуру поддерживают при 36°C, при значении pH 6,7-6,9 и при значении DO 50%. Объем промышленного биологического реактора постепенно увеличивается путем добавления новой среды по мере увеличения количества клеток. Когда плотность клеток достигает приблизительно 2×106 клеток/мл, инициируется фаза продуцирования, и смену среды осуществляют каждые 24 часа. Перемешивание прекращают, чтобы дать возможность для седиментации носителей, содержащих клетки, а затем 80% супернатанта культуры собирают и заменяют новой средой. Собранный супернатант культуры фильтруют для удаления не захваченных клеток и остатков клеток, а затем транспортируют для дальнейшей обработки.

Во время фазы продуцирования клетки достигают плотности 3-6×106 клеток/мл и титра 2-7 мг фактора VII/литр.

II. Анализ конфигурации гликоформ рекомбинантного фактора VII

Сравниваются олигосахаридные конфигурации следующих препаратов: (a) препаратов рекомбинантного фактора VII, полученные, как описано в части I (n=7); и двух эталонных препаратов: (b) препаратов рекомбинантного фактора VII, полученных в клетках BHK, в присутствии сыворотки теленка

(n=10); и (c) препарата фактора VII, выделенного из плазмы крови человека.

N-связанные олигосахариды высвобождаются с полипептидов путем химического расщепления (гидразинолиз на устройстве GlycoPrep 1000, Oxford GlycoSciences) или путем ферментативного расщепления (N-гликозидаза F, например, от Boehringer Mannheim). Высвобожденные олигосахариды метят 2-аминобензамидом (используют набор для сигнального мечения K-404, Oxford GlycoSciences или Glyko). Меченые олигосахариды анализируют с использованием анионообменной ВЭЖХ на колонке CarboPac PA100 (4Ч250 мм, Dionex, P/N 43055) вместе с колонкой Guard (4Ч50 мм, Dionex, P/N 43054). Колонку уравновешивают с помощью 150 мм гидроксида натрия и элюируют с помощью градиента 0-150 мм ацетата натрия, 150 мм гидроксида натрия. Олигосахариды детектируются с использованием флуоресценции с возбуждением при 330 нм и эмиссией при 420 нм.

Относительные содержания различных олигосахаридных конфигураций фактора VII (Klausen et al., 1998) вычисляются как относительные площади пиков для углеводных пиков при анализе с помощью анионообменной ВЭЖХ. На основе структурных элементов каждого олигосахарида они сопоставляются с одной из следующих цепей: (i) цепи, содержащие, по меньшей мере, одну сиаловую кислоту; (ii) цепи, где отсутствует какая-либо сиаловая кислота (то есть нейтральные); (iii) цепи, содержащие, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы; (iv) цепи, содержащие, по меньшей мере, один конечный остаток N-ацетилгалактозамина; и (v) цепи, содержащие, по меньшей мере, одну неблокированную антенну (то есть по меньшей мере, один конечный остаток галактозы или N-ацетилгалактозамина). Наконец, сумма относительных содержаний олигосахаридных цепей, сопоставленных с каждой группой, вычисляется как процент от всех олигосахаридных цепей. Стандартное отклонение от этого определения, как вычислено, составляет 0,08% (разброс в течение дня); 0,7% (разброс между днями); и 0,5% (интервал 1-100 мкг).

Полученные конфигурации гликоформ иллюстрируются в следующей таблице:

(i) (ii) (iii) (iv) (v)
a 93,1-98,7 1,3-6,9 5,9-16,4 5,9-8,7 11,7-23,9
b 88,3-92,5 7,5-12,9 9,4-16,8 19,0-28,6 30,1-39,0
c 99,5% <0,5% 2-3% 0% 2-3%

Препараты рекомбинантного фактора VII, полученные в соответствии с этим примером (то есть в отсутствие сыворотки), демонстрируют конфигурацию гликоформ, которая отличается как от конфигурации гликоформ рекомбинантного фактора VII, полученного в присутствии сыворотки, так и от нативного фактора VII, выделенного из плазмы крови человека. Олигосахариды рекомбинантного фактора VII, полученного в отсутствие сыворотки, сиалилированы до степени, большей чем те, которые получены в присутствии сыворотки, и содержат меньше нейтральных цепей и меньше цепей, которые заканчиваются либо галактозой, либо N-ацетилгалактозамином.

III. Биологическая доступность: Следующий далее эксперимент осуществляется для сравнения биологической доступности двух препаратов фактора VII, полученных, как выше (I и II), с биологической доступностью двух эталонных препаратов факторов VII (то есть полученных в присутствии сыворотки) (A и B).

Группам по 8 крыс вводят либо исследуемый препарат, либо эталонный препарат при дозе 25 мкг/кг (≈100 мкг/крыса) в глицилглициновом буфере (pH 7,4), содержащем хлорид натрия (7,87 мг/мл), дигидрат хлорид кальция (1,48 мг/мл), маннитол (2,5 мг/мл) и полисорбат 80. Образцы крови отбирают на 10 мин и 30 мин после первоначального введения. Из образцов извлекают плазму и фактор VII количественно определяют с помощью ELISA. Биологическая доступность каждого образца выражается как зависимая от дозы площадь под кривой зависимости концентрации для фактора VII в плазме крови на основе 10 и 30-минутных образцов (AUC10-30/доза). Относительная биологическая доступность выражается как отношение средней AUC10-30/доза для исследуемых и эталонных образцов ×100. 90% доверительные интервалы для относительной биологической доступности вычисляют из 90% доверительных интервалов для разностей между препаратами.

Результаты приведены в таблице ниже (% сиалилирование каждого препарата, который измеряется, как описывается выше, указано в скобках).

ИсследуемыйЭталонныйОтносительная биологическая доступностьНижний предел 90% доверительного интервала Верхний предел 90% доверительного интервала
I (97,5%)A (93%)128,6116,1141,1
I (97,5%)B (86%)154,9141,2168,5
II (96,7%)A (93%)117,3104,8129,8
II (96,7%)B (86%)141,2127,5154,8

Эти результаты указывают на то, что даже относительно малые различия в доле олигосахаридных цепей, имеющих, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты, например, в пределах между 93% и 96 или 97%, может иметь заметное воздействие на биологическую доступность (увеличение на 20-30%). Более того, 10% увеличение % сиалилирования, вызывает 40-50% увеличение биологической доступности.

Пример 2: Анализ препаратов фактора VII, демонстрирующих измененную конфигурацию гликоформ

Фактор VII получают, как описано выше в примере 1, с тем исключением, что фактор VII собирают с 500 л культур. Анализ гликоформ осуществляют, как описано в примере 1. Три независимых препарата (A, B и C) анализируют и сравнивают с эталонным препаратом (D).

Биологическую доступность измеряют на модели собаки следующим образом: Эксперимент осуществляют как перекрестное исследование на четырех лапах, на 12 собаках породы гончих, разделенных на четыре группы. Все животные получают каждый из трех исследуемых препаратов A, B и C, и эталонный препарат D при дозе ≈90 мкг/кг в глицилглициновом буфере (pH 5,5), содержащем хлорид натрия (2,92 мг/мл), дигидрат хлорид кальция (1,47 мг/мл), маннитол (30 мг/мл) и полисорбат 80. Образцы крови отбирают на 10, 30 и 60 минутах и на 2, 3, 4, 6 и 8 часах после начального введения. Из образцов получают плазму и фактор VII количественно определяют с помощью ELISA.

Биологическая доступность каждого образца выражается как соответствующая дозе площадь под кривой зависимости концентрации фактора VII в плазме крови (AUC/доза). Относительная биологическая доступность выражается как отношение между средним значением AUC/доза для исследуемого и эталонного препарата ×100 и вычисляются 90% доверительные интервалы для относительной биологической доступности.

Результаты приведены в таблице ниже. % сиалилирование каждого препарата, который измеряется, как описывается выше в примере 1, указано в скобках.

ИсследуемыйЭталонныйОтносительная биологическая доступностьНижний предел 90% доверительного интервалаВерхний предел 90% доверительного интервала
A (98,7%)D (88,2%)144135153
B (95,9%)D (88,2%)127119136
C (93,1%)D (88,2%)112105120

Эти результаты указывают на то, что малые различия в доле олигосахаридных цепей, имеющих, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты, имеют заметное воздействие на биологическую доступность фактора VII. 10% увеличение % сиалилирования вызывает 30-50% увеличение биологической доступности при соотношении, близком к линейному, для трех исследуемых препаратов и для эталонного препарата.

Пример 3: препараты фактора VII, демонстрирующие измененную конфигурацию гликоформ

Следующий далее эксперимент осуществляется для получения препарата фактора VII, имеющего измененную конфигурацию гликоформ.

I. Конструирование линий клеток и продуцирование фактора VII: Плазмидный вектор pLN174 для экспрессии FVII человека был описан (Persson и Nielsen. 1996, FEBS Lett. 385: 241-243). Вкратце, он несет нуклеотидную последовательность кДНК кодирующей FVII человека, включая пропептид, под контролем металлотионеинового промотора мыши, для транскрипции вставки кДНК, и кДНК дигидрофолиатредуктазы мыши, под контролем раннего промотора SV40, для использования в качестве селектируемого маркера.

Для конструирования плазмидного вектора, кодирующего распознающую последовательность гамма-карбоксилирования, используют клонирующий вектор (pBluescript II KS+, Stratagene), содержащий кДНК, кодирующую FVII, включая его пропептид (pLN171). (Persson et al. 1997, J. Biol. Chem. 272:19919-19924). Последовательность нуклеотидов, кодирующая стоп-кодон, вставляется в кДНК, кодирующую FVII, после пропептида FVII с помощью мутагенеза, опосредованного обратной PCR, используя этот клонирующий вектор. Матричную плазмиду денатурируют путем обработки с помощью NaOH с последующей PCR с полимеразами Pwo (Boehringer-Mannheim) и Taq (Perkin-Elmer) со следующими праймерами:

a) 5'-AGC GTT TTA GCG CCG GCG CCG GTG CAG GAC-3'

b) 5'-CGC CGG CGC TAA AAC GCT TTC CTG GAG GAG CTG CGG CC-3'

Полученная смесь переваривается с помощью Dpnl для переваривания остатка матричной ДНК, и Escherichia coli трансформируют с помощью продукта PCR. Клоны просматривают на присутствие мутации путем секвенирования. кДНК из корректного клона переносится в виде фрагмента BamHI-EcoRI в экспрессируемую плазмиду pcDNA3 (Invitrogen). Полученная плазмида определяется как pLN329. Клетки CHO K1 (ATCC CCl61) трансфицируются равными количествами pLN174 и pLN329 с помощью способа Fugene6 (Boehriner-Mannheim). Трансфектанты выбирают путем добавления метотрексата до 1 мкМ и G-418 до 0,45 мг/мл. Пул трансфектантов клонируется путем ограничения разбавления и измеряется экспрессия FVII из клонов.

Высокопродуктивный клон дополнительно субклонируется и выбирается клон E11 с удельной экспрессией FVII 2,4 пг/клетка/день в модифицированной по Дульбекко среде Игла с 10% фетальной сывороткой теленка. Клон адаптируют к культуре суспензии, не содержащей сыворотки, в коммерчески доступной среде CHO (JRH Bioscience), не содержащей компонентов, полученных от животных.

Адаптированные клетки непрерывно размножаются в культурах с перемешиванием, и когда количество клеток увеличивается, объем постепенно увеличивается путем добавления новой среды. Через 25 дней 6 л культуры с перемешиванием инокулируются в 50-литровый биологический реактор. Клетки размножаются в биологическом реакторе и когда количество клеток увеличивается, объем постепенно увеличивается путем добавления новой среды.

Наконец, 50 л затравочной культуры инокулируют в 500-литровый промышленный биологический реактор, содержащий макропористые носители Cytopore 1 (Pharmacia), после чего клетки из суспензии иммобилизуются на носителях. Культуру поддерживают при 36°C, при значении pH 7,0-7,1 и при давлении растворенного кислорода (DOT) 50% от насыщения. Объем в биологическом реакторе постепенно увеличивается путем добавления новой среды, когда количество клеток увеличивается. Когда плотность клеток достигает приблизительно 10-12×105 клеток/мл, инициируется фаза продуцирования, и смену среды осуществляют каждые 24 часа: перемешивание прекращают, чтобы дать возможность для седиментации носителей, содержащих клетки, а затем 80% супернатанта культуры собирают и заменяют новой средой. Собранный супернатант культуры отфильтровывают для удаления не захваченных клеток (то есть клеток, которые не иммобилизуются на носителях) и остатков клеток, а затем транспортируют для дальнейшей обработки.

Во время фазы продуцирования клетки достигают плотности 2-3×107 клеток/мл и титра 8 мг фактора VII/литр.

II. Анализ гликоформ:

A. конфигурацию олигосахаридов (а) препарата фактора VII, получаемого, как описано выше, сравнивают с конфигурацией (b) препаратов рекомбинантного фактора VII, продуцируемого в клетках BHK, в присутствии сыворотки теленка, и (c) препарата фактора VII, выделенного из плазмы крови человека. Используемые способы являются, по существу, такими же, как описано в примере 1.

Результаты показаны в таблице ниже. Классификация олигосахаридов является следующей: (i) цепи, содержащие, по меньшей мере, одну сиаловую кислоту; (ii) цепи, не содержащие какой-либо сиаловой кислоты (то есть нейтральные); (iii) цепи, содержащие, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы; (iv) цепи, содержащие, по меньшей мере, один конечный остаток N-ацетилгалактозамина; и (v) цепи, содержащие, по меньшей мере, одну неблокированную антенну (то есть, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы или N-ацетилгалактозамина).

(i)(ii)(iii)(iv)(v)
a95,24,822,90,123,0
b88,3-92,57,5-12,9 9,4-16,819,0-28,6 30,1-39,0
c99,5%<0,5%2-3%0%2-3%

B. конфигурации олигосахаридов пяти независимых препаратов фактора VII, полученных, как описано в этом примере, (a) сравниваются со структурами (b) препаратов рекомбинантного фактора VII, продуцируемого в клетках BHK, в присутствии сыворотки теленка, и (c) с препаратом фактора VII, выделенного из плазмы крови человека, с использованием аналитических методов, описанных в примере 1.

На основе структурных элементов каждого олигосахарида он сопоставляется с одной из следующих конфигураций: (i) цепи, содержащие, по меньшей мере, одну сиаловую кислоту; (ii) цепи, не содержащие какой-либо сиаловой кислоты (то есть нейтральные); (iii) цепи, содержащие, по меньшей мере, одну фукозу, связанную с антенной. Наконец, вычисляется сумма относительных содержаний олигосахаридных цепей, сопоставленных с каждой группой, как процент от общего количества олигосахаридных цепей. Стандартное отклонение от этого определения вычисляется как равное 0,08% (разброс в течение дня); 0,7% (разброс между различными днями); и 0,5% (интервал 1-100 мкг).

Полученные в результате конфигурации гликоформ иллюстрируются в следующей далее таблице:

(i)(ii)(iii)
a89,0-97,9%2,1-11,0%6,3-21,3%
b88,3-92,5%7,5-12,9%0%
c99,5%<0,5%0%

Препараты рекомбинантного фактора VII, полученного в соответствии с примером 1 (то есть полученного в отсутствие сыворотки с помощью линии клеток CHO), демонстрируют конфигурацию гликоформ, которая отличается как от конфигурации гликоформ рекомбинантного фактора VII, полученного в присутствии сыворотки, так и от нативного фактора VII, выделенного из плазмы крови человека. Олигосахариды рекомбинантного фактора VII, полученного в отсутствие сыворотки с помощью линии клеток CHO 282.4, включают в себя конфигурации с фукозой, связанной с антенной, которые отсутствуют в обоих эталонных препаратах. Две из этих конфигураций выделяют и характеризуют с помощью лазерной десорбции из вспомогательной матрицы - ионизационной масс-спектрометрии, путем обработки с помощью специфичных к связи ферментов фукозидаз и с помощью анионообменной ВЭЖХ, как описывается выше. Обе конфигурации, как показано, содержат сиалиловую структуру Льюиса x, то есть фукозу, связанную α1->3 с антеннарным N-ацетилглюкозамином в сиалилированном олигосахариде.

III. Биологическая активность:

Пять препаратов фактора VII, полученных, как описано в этом примере, анализируются на (a) генерацию тромбина и (b) на связывание с тканевым фактором (TF) и сравниваются с рекомбинантным фактором VII, продуцируемым в клетках BHK, в присутствии сыворотки (эталон). Следующая далее таблица устанавливает корреляции конфигураций гликоформ (% олигосахаридных цепей, содержащих сиаловую кислоту, и % содержащих фукозилированную антенну) и их биологической активности.

Препарат фактора VIIКонфигурация олигосахаридовГенерация тромбина (% от эталона)Связывание с TF, Kd (нм)
% сиалила% фукозила
19861252,8
294131232,0
393141261,8
488161453,3
586211582,8
Эталон86-9301002,2-6,6

Эти результаты показывают, что препараты фактора VII, имеющие фукозилированные антенны, демонстрируют более высокую TF-независимую активность фактора VII (как демонстрируется, например, с помощью генерации тромбина), чем препараты фактора VII, где фукозилированные антенны отсутствуют.

Пример 4: анализ с помощью гидролиза in vitro

Следующий далее способ может быть использован для анализа биологической активности фактора VIIa. Анализ осуществляется в планшете для микротирования (MaxiSorp, Nunc, Denmark). Хромогенный субстрат D-Ile-Pro-Arg-п-нитроанилид (S-2288, Chromogenix, Sweden) при конечной концентрации 1 мм добавляют к фактору VIIa (конечная концентрация 100 нМ) в 50 мм Hepes, pH 7,4, содержащем 0,1 M NaCl, 5 мм CaCl2 и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. Коэффициент поглощения при 405 нм непрерывно измеряется в устройстве для считывания планшетов SpectraMax™ 340 (Molecular Devices, USA). Поглощение, развиваемое в течение 20-минутного инкубирования, после вычитания поглощения в пустой лунке, не содержащей фермента, используется для вычисления отношения активностей исследуемого и эталонного фактора VIIa.

Пример 5: анализ с помощью протеолиза in vitro

Следующий далее способ может быть использован для анализа биологической активности фактора VIIa. Анализ осуществляется в планшете для микротитрования (MaxiSorp, Nunc, Denmark). Фактор VIIa (10 нм) и фактор X (0,8 мкМ) в 100 мкл 50 мм Hepes, pH 7,4, содержащего 0,1 M NaCl, 5 мм CaCl2 и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, инкубируют в течение 15 мин. Затем расщепление фактора X прекращается с помощью добавления 50 мкл 50 мм Hepes, pH 7,4, содержащего 0,1 M NaCl, 20 мм EDTA и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. Количество генерируемого фактора Xa измеряется путем добавления хромогенного субстрата Z-D-Arg-Gly-Arg-п-нитроанилид (S-2765, Chromogenix, Sweden), конечная концентрация 0,5 мм. Коэффициент поглощения при 405 нм измеряется непрерывно в устройстве для считывания планшетов SpectraMax™ 340 (Molecular Devices, USA). Поглощение, развиваемое в течение 10 минут, после вычитания поглощения в пустой лунке, не содержащей FVIIa, используется для вычисления отношения протеолитических активностей исследуемого и эталонного фактора VIIa.

Все патенты, заявки на патенты и литературные ссылки, упоминаемые здесь, тем самым, включаются в качестве ссылок во всей их полноте.

Специалисты в данной области в свете приведенного выше подробного описания предложат множество вариаций настоящего изобретения. Такие очевидные вариации находятся в пределах полных предполагаемых рамок прилагаемой формулы изобретения.

1. Полипептиды фактора VII, представляющие собой множество полипептидов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, где полипептиды содержат аспарагинсвязанные олигосахаридные цепи и где в пределах примерно 94-99% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты, предназначенные для лечения синдромов, связанных с фактором VII.

2. Полипептиды фактора VII, представляющие собой множество полипептидов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, где полипептиды содержат аспарагинсвязанные олигосахаридные цепи и где в пределах примерно 1-7% олигосахаридных цепей имеют нейтральный заряд, предназначенные для лечения синдромов, связанных с фактором VII.

3. Полипептиды фактора VII, представляющие собой множество полипептидов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, где полипептиды содержат аспарагинсвязанные олигосахаридные цепи и где в пределах примерно 6-16% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы, предназначенные для лечения синдромов, связанных с фактором VII.

4. Полипептиды фактора VII, представляющие собой множество полипептидов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, где полипептиды содержат аспарагинсвязанные олигосахаридные цепи и где в пределах примерно 11-23% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы или N-ацетилгалактозамина, предназначенные для лечения синдромов, связанных с фактором VII.

5. Полипептиды фактора VII, представляющие собой множество полипептидов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, где полипептиды содержат аспарагинсвязанные олигосахаридные цепи и где, по меньшей мере, примерно 2% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток фукозы, связанный α1->3 с антеннарным N-ацетилглюкозамином, предназначенные для лечения синдромов, связанных с фактором VII.

6. Полипептиды по любому из пп.1-5, где сиаловые остатки в олигосахаридных цепях связаны с галактозой посредством связи α2->3.

7. Полипептиды по любому из пп.1-6, где остатки сиаловой кислоты содержат N-ацетилнейраминовую кислоту (Neu5Ac) и N-гликолилнейраминовую кислоту (Neu5Gc).

8. Полипептиды по любому из пп.1-7, где олигосахариды содержат фукозу, связанную α1->6 с каркасом N-ацетилглюкозамина.

9. Полипептиды по любому из пп.1-8, где в пределах примерно 95- 98% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты.

10. Полипептиды по любому из пп.1-9, где в пределах примерно 96-97% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты.

11. Полипептиды по любому из пп.1-10, где в пределах примерно 2-4% олигосахаридных цепей имеют нейтральный заряд.

12. Полипептиды по любому из пп.1-11, где в пределах примерно 8-12% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы.

13. Полипептиды по любому из пп.1-12, где в пределах примерно 12-18% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один конечный остаток галактозы или N-ацетилгалактозамина.

14. Полипептиды по любому из пп.1-13, где, по меньшей мере, примерно 5% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток фукозы, связанный α1->3 с антеннарным N-ацетилглюкозамином.

15. Полипептиды по любому из пп.1-14, где, по меньшей мере, примерно 10% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток фукозы, связанный α1->3 с антеннарным N-ацетилглюкозамином.

16. Полипептиды по любому из пп.1-15, где, по меньшей мере, примерно 20% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток фукозы, связанный α1->3 с антеннарным N-ацетилглюкозамином.

17. Полипептиды по любому из пп.1-16, где, по меньшей мере, примерно 40% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток фукозы, связанный α1->3 с антеннарным N-ацетилглюкозамином.

18. Полипептиды по любому из пп.1-17, где полипептиды имеют последовательность аминокислот фактора VII дикого типа.

19. Полипептиды по любому из пп.1-18, где полипептиды представляют собой фактор VIIa дикого типа.

20. Полипептиды по любому из пп.1-17, где полипептиды фактора VII выбираются из группы, состоящей из: S52А-фактора VII, S60A-фактора VII, фактора VII, который протеолитически расщепляется между остатками 290 и 291; фактора VII, который протеолитически расщепляется между остатками 315 и 316; и фактора VII, который окисляется.

21. Полипептиды по любому из пп.1-17, где полипептиды, родственные фактору VII, выбираются из группы, состоящей из: R152Е-фактора VII, S344А-фактора VII, FFR-фактора VII и фактора VIIa, где отсутствует домен Gla.

22. Полипептиды фактора VII, представляющие собой множество полипептидов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, где полипептиды содержат аспарагинсвязанные олигосахаридные цепи и где (i) в пределах примерно 94-100% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты и (ii) в пределах примерно 6-9% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один конечный остаток N-ацетилгалактозамина, предназначенные для лечения синдромов, связанных с фактором VII.

23. Полипептиды по п.22, где полипептиды фактора VII имеют последовательность фактора VII дикого типа.

24. Полипептиды фактора VII, представляющие собой множество полипептидов фактора Vila, имеющих последовательность фактора VII дикого типа, где полипептиды содержат аспарагинсвязанные олигосахаридные цепи и где в пределах примерно 94-99% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты, предназначенные для лечения синдромов, связанных с фактором VII.

25. Полипептиды фактора VII, представляющие собой множество полипептидов фактора VIIa, имеющих последовательность фактора VII дикого типа, где полипептиды содержат аспарагинсвязанные олигосахаридные цепи и где, по меньшей мере, примерно 2% олигосахаридных цепей содержат, по меньшей мере, один остаток фукозы, связанный α1->3 с антеннарным N-ацетилглюкозамином, предназначенные для лечения синдромов, связанных с фактором VII.

26. Полипептиды по любому из пп.1-25, где полипептиды продуцируются в клетке-хозяине, выбранной из группы, состоящей из клеток грибов, насекомых и позвоночных.

27. Полипептиды по п.26, где клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего.

28. Полипептиды по п.27, где клетку млекопитающего получают от хомячка.

29. Полипептиды по п.28, где клетка хомячка выбирается из группы, состоящей из клеток СНО и клеток ВНК.

30. Полипептиды по п.27, где клетку млекопитающего получают от человека.

31. Полипептиды по п.30, где клетка человека представляет собой клетку НЕК.

32. Полипептиды по любому из пп.1-31, где полипептиды демонстрируют биологическую доступность, которая составляет, по меньшей мере, примерно 110% от биологической доступности эталонного препарата, и где примерно 93% или менее олигосахаридных цепей в эталонном препарате содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты.

33. Полипептиды по п.32, где полипептиды демонстрируют биологическую доступность, которая составляет, по меньшей мере, примерно 120% от биологической доступности эталонного препарата.

34. Полипептиды по п.33, где полипептиды демонстрирует биологическую доступность, которая составляет, по меньшей мере, примерно 130% от биологической доступности эталонного препарата.

35. Способ определения конфигурации гликоформ полипептидов фактора VII и полипептидов, родственных фактору VII, где способ включает в себя:

(a) культивирование культуры клеток СНО-К1, экспрессирующих полипептиды фактора VII или полипептиды, родственные фактору VII, при первом наборе заданных условий культивирования, где клетки являются адаптированными для роста в отсутствие сыворотки и культивируются в отсутствие сыворотки как в фазе роста, так и в фазе продуцирования;

(b) извлечение полипептидов фактора VII или полипептидов, родственных фактору VII, из культуры для получения полипептидов; и

(c) анализ конфигурации олигосахаридов, связанных с полипептидами, для определения конфигурации гликоформ полипептидов.

36. Способ по п.35, дополнительно включающий в себя:

(d1) изменение условий культивирования на стадии (а) для получения второго набора заданных условий культивирования;

(e1) повторение стадий (b)-(d1) до тех пор, пока не будет получена желаемая конфигурация гликоформ.

37. Способ по п.35, дополнительно включающий в себя:

(d2) химическую или ферментативную обработку полипептидов для изменения конфигурации олигосахаридов; и

(е2) повторение стадий (b)-(d2) до тех пор, пока не будет получена желаемая конфигурация гликоформ.

38. Способ получения полипептидов по любому из пп.1-34, где указанный способ включает в себя культивирование культуры клеток CHO-К1, экспрессирующих полипептиды, где клетки являются адаптированными для роста в отсутствие сыворотки и культивируются в отсутствие сыворотки как в фазе роста, так и в фазе продуцирования при условиях, в которых, по меньшей мере, примерно 94% аспарагинсвязанных олигосахаридов, присутствующих в полипептидах, содержат, по меньшей мере, один остаток сиаловой кислоты.

39. Фармацевтический препарат, содержащий полипептиды по любому из пп.1-34, и фармацевтически приемлемый носитель или адьювант, предназначенный для лечения синдромов, связанных с фактором VII.

40. Способ лечения синдрома, чувствительного к фактору VII, где способ включает в себя введение фармацевтического препарата по п.39 пациенту, нуждающемуся в таком лечении, в условиях, приводящих к уменьшению кровотечения и/или к повышению свертывания крови, где препарат содержит полипептиды фактора VII.

41. Способ по п.40, где синдром выбирается из группы, состоящей из гемофилии А, гемофилии В, дефицита фактора XI, дефицита фактора VII, тромбоцитопении, болезни фон Виллебранда, присутствия ингибитора фактора свертываемости, хирургической операции, травмы и терапевтического лечения с помощью антикоагулянтов.

42. Способ предотвращения нежелательного кровотечения, где способ включает в себя введение фармацевтического препарата по п.39 пациенту, нуждающемуся в таком лечении, в условиях, приводящих к уменьшению кровотечения и/или повышению свертываемости крови, где препарат содержит полипептиды фактора VII.

43. Способ предотвращения нежелательного свертывания крови, где способ включает в себя введение фармацевтического препарата по п.39 пациенту, нуждающемуся в таком лечении, в условиях, эффективных для ингибирования свертывания, где препарат содержит полипептиды, родственные фактору VII.

44. Способ предотвращения реакций, опосредуемых тканевым фактором, где способ включает в себя введение фармацевтического препарата по п.39 пациенту, нуждающемуся в таком лечении, в условиях, эффективных для ингибирования свертывания, где препарат содержит полипептиды, родственные фактору VII.

45. Способ по п.43, где нежелательное свертывание крови связано с состоянием, выбранным из группы, состоящей из: ангиопластической операции, глубокого тромбоза вен, легочной эмболии, инсульта, диссеминированного внутрисосудистого свертывания (DIG); отложения фибрина в легких и почках, связанного с грамотрицательной эндотоксимией, и инфаркта миокарда.

46. Способ по п.44, где реакции, опосредуемые тканевым фактором, связаны с состоянием, выбранным из группы, состоящей из SIRS, ARDS, MOF, HUS и ТТР.

47. Лекарственное средство, предназначенное для лечения синдрома, связанного с фактором VII, полученное с применением полипептидов по любому из пп.1-34.

48. Лекарственное средство, предназначенное для лечения синдрома, связанного с фактором VII по п.47, где синдром выбирается из группы, состоящей из гемофилии А, гемофилии В, дефицита фактора XI, дефицита фактора VII, тромбоцитопении, болезни фон Виллебранда, присутствия ингибитора фактора свертываемости, хирургической операции, травмы и терапевтического лечения с помощью антикоагулянта.

49. Лекарственное средство, предназначенное для предотвращения нежелательного кровотечения, полученное с применением полипептидов по любому из пп.1-34.

50. Лекарственное средство, предназначенное для предотвращения нежелательного свертывания крови, полученное с применением полипептидов по любому из пп.1-34.

51. Лекарственное средство, предназначенное для предотвращения нежелательного свертывания крови по п.50, где нежелательное свертывание крови связано с состоянием, выбранным из группы, состоящей из: ангиопластической операции, глубокого тромбоза вен, легочной эмболии, инсульта, диссеминированного внутрисосудистого свертывания (DIG); отложения фибрина в легких и почках, связанного с грамотрицательной эндотоксимией, и инфаркта миокарда.

52. Лекарственное средство, предназначенное для предотвращения, реакций, опосредуемых тканевым фактором, полученное с применением полипептидов по любому из пп.1-34.

53. Лекарственное средство, предназначенное для предотвращения, реакций, опосредуемых тканевым фактором по п.52, где реакции, опосредуемые тканевым фактором, связаны с состоянием, выбранным из группы, состоящей из SIRS, ARDS, MOF, HUS и ТТР.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины, в частности к ортопедии и травматологии, и может быть использовано для ранней диагностики и профилактики тромбоэмболии при эндопротезировании тазобедренного и коленного суставов в травматологических, ортопедических, хирургических отделениях больниц, клиник и НИИ.

Изобретение относится к области медицины, в частности к хирургии, и может быть использовано для прогнозирования срока возможного возникновения тромбоэмболии легочной артерии после операции.
Изобретение относится к области медицины, в частности к пульмонологии. .

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностическим методам, и может быть использовано для диагностики степени тяжести коагулопатии потребления. .
Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, перфузилогии, кардиореанимации, и предназначено для определения дозы протамина сульфата, вводимой кардиохирургическим больным.
Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии и клинической лабораторной диагностике. .

Изобретение относится к медицине, а именно к способам оценки эффективности послеоперационной анальгезии. .
Изобретение относится к медицине, к клинической лабораторной диагностике. .
Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии. .
Изобретение относится к клинической биохимии, а именно к способам определения окисленных белков, и предназначается для оценки степени окислительной модификации фибриногена в результате воздействия факторов окислительного стресса.

Изобретение относится к биологически активным пептидам, обладающим антимикробным действием, которые могут найти применение в биотехнологии и медицине. .

Изобретение относится к биотехнологии. .
Изобретение относится к диагностическим иммунобиологическим препаратам, содержащим биологически активные компоненты клеток Bacillus anthracis. .

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности. .

Изобретение относится к биохимии, в частности к биологически активным пептидам, обладающим антимикробным действием, которые могут найти применение в биотехнологии и медицине.

Изобретение относится к биохимии, в частности к биологически активным пептидам, обладающим антимикробным действием, которые могут найти применение в биотехнологии и медицине.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой фермент, который катализирует реакцию образования пептида из карбоксильного компонента и аминного компонента.

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к области медицины и касается гликоформ фактора VII и к композициям, содержащим фактор VII, имеющим измененные конфигурации на основе аспарагинсвязанных олигосахаридных цепей

Наверх