Способ адъювантной иммунотерапии первичных и метастатических злокачественных нерезектабельных опухолей печени

Изобретение относится к медицине, к иммунотерапии гепатоцеллюлярного рака и метастатических поражений печени, и может быть использовано для интрапортального пролонгированного введения иммунопрепаратов. Определяют показания к адъювантной иммунотерапии первичных и метастатических злокачественных нерезектабельных опухолей печени, для чего в ходе оперативного вмешательства производят инцизионную биопсию участков опухоли и нормальной ткани печени. Затем сразу после операции выполняют иммунофенотипирование лимфоцитов в ткани опухоли, нормальной печени и в периферической крови по маркерам CD4+, CD8+, CD16+, CD56+. При снижении более чем на 10% уровней маркеров лимфоцитов CD4+, CD8+ и уровня NK-клеток CD 16+ и CD56+ в ткани опухоли и периферической крови больного по сравнению с нормальной тканью и периферической кровью считают показанным послеоперационное пролонгированное интрапортальное введение ронколейкина. Способ обеспечивает точную прямую оценку состояния локального иммунитета с определением показаний к пролонгированному интрапортальному введению ронколейкина, что позволяет улучшить результаты лечения. 12 ил., 4 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунотерапии гепатоцеллюлярного рака и метастатических поражений печени, и может быть использовано при интрапортальном пролонгированном введении иммунопрепаратов для локальных воздействий на опухолевый процесс в печени.

Рекомбинантный дрожжевой интерлейкина-2 (Ронколейкин®) используется при различных онкологических заболеваниях: почечноклеточный рак, опухоли кроветворной системы, меланома, первичные опухоли головного мозга, при метастатическом плеврите и раке мочевого пузыря. Его действие основано на стимуляции Т-хелперно-индукторных и цитотоксических клеток, осуществляющих иммунологический надзор.

Известен способ применения адоптивной иммунотерапии рекомбинантным ИЛ-2 при гепатоцеллюлярной карциноме (Takayama Т., Sekine T. Randomized trial of adoptive immunotherapy to reduce postsurgical recurrence of hepatocellular carcinoma. Biotherapy. - 2002. V1.16. - №13. - P.61-64). Авторы после резекции печени 76 больным использовали адоптивную иммунотерапию с помощью внутривенной инфузии аутологичных лимфоцитов, активированных ex vivo рекомбинантным интерлейкином-2 и анти-CD-3 антителами. Инфузии проводились внутривенно 5 раз в течение 6 месяцев, в контрольной группе иммунотерапии не было. Адоптивная иммунотерапия уменьшила частоту рецидива на 18% (57 больных - 77% в контрольной группе против 45-59% в группе иммунотерапии).

Недостатком данного способа является незначительный эффект и, кроме того, изготовление антител является крайне трудным и дорогостоящим.

Известен способ, при котором после резекции рака поджелудочной железы, проводили интрапортальную иммунотерапию печеночных метастазов (Kobari M., Egawa S., Shibuya К., Sunamura M., Saitoh К., Matsuno S. Effect of intraportal adoptive immunotherapy on liver metastases after resection of pancreatic cancer. British Journal of Surgery. 2000 Jan. - VL.87. №1. P.43-8). Применялось интрапортальное введение LAK-клеток с рекомбинантным интерлейкином-2 (12 человек). В контрольной группе (17 чел.) после резекции проводилась только интраоперационная радиотерапия. Количество метастазов в печени в группе с иммунотерапией было значительно ниже (у 3-х из 12 больных), чем в группе контроля (у 10 из 15).

Недостатком этого метода является сложность и чрезвычайная дороговизна приготовления лимфокин-активированных киллеров и главное отсутствие исходных базовых данных о состоянии локального уровня лимфоцитов печени.

В качестве прототипа используется «способ лечения гепатоцеллюлярного рака», при котором после резекции опухолевого очага в послеоперационном периоде проводится внутриартериальная адъювантная химиоиммунотерапия (Lygidakis N.J., Pothoulakis J., Konstantinidou A.E., Spanos H.H Hepatocellular carcinoma: surgical resection versus surgical resection combined with pre- and post-operative locoregional immunotherapy-chemotherapy. A prospective randomized study. Anticancer Research. - 1995 - VL.15. - №2. - P.543-50). В качестве иммунного агента применялся интерферон (ИНФ). Препарат вводился больным с гепатоцеллюлярной карциномой в общую печеночную артерию, доступ к которой осуществлялся путем катетеризации бедренной артерии, после чего все 18 пациентов были живы и свободны от метастазов в период от 4 до 27 месяцев после операции, а в группе, в которой проводилась только резекция, из 17 у 7 человек возникли рецидивы.

Недостатком данного способа является сложность доступа к печеночной артерии, необходимость наличия сложного ренген-телевизионного оборудования, что резко ограничивает диапазон применения метода. Кроме того, иммунотерапия проводится "вслепую" без конкретной информации об общих и локальных иммунологических сдвигах.

Целью изобретения является стимуляция локального и общего иммунитета, при проведении интрапортальной многократной пролонгированной локорегиональной иммунотерапии.

Поставленная цель достигается тем, что в ходе оперативного вмешательства производят инцизионную биопсию участков опухоли и непораженной ткани печени, затем сразу после операции выполняют иммунофенотипирование лимфоцитов: Т-хелперно-индукторные (CD4+), цитотоксические (CD8+) и натуральные киллеры (CD16+ и CD56+), CD25+-лимфоциты в опухоли, непораженной печени и периферической крови и в зависимости от выявленных количественных различий выясняют целесообразность послеоперационного пролонгированного интрапортального введения ронколейкина.

Изобретение "Способ адъювантной иммунотерапии первичных и метастатических нерезектабельных злокачественных опухолей печени" является новым, так как способ неизвестен в иммунотерапии злокачественных заболеваний печени.

Новизна изобретения заключается в том, что, как при первичном - гепатоцеллюлярном, так и метастатическом - колоректальном раке печени обнаружены значительные сдвиги в локальном иммунитете, выраженном в сниженном количестве основных клеток, обеспечивающий местный иммунитет. На основании этого разработан способ интрапортального, пролонгированного введения иммунопрепаратов для локальных иммуновоздействий на опухолевый процесс в печени.

Изобретение "Способ адъювантной иммунотерапии первичных и метастатических злокачественных нерезектабельных опухолей печени является промышленно применимым, так как может быть использован в здравоохранении, в научно-исследовательских онкологических институтах, в медицинских учереждениях онкологического профиля, онкодиспансерах.

Проведено исследование субпопуляционного состава лимфоцитов (CD4+; CD8+; CD16+; CD56+; CD25+) у больных с первичными и метастатическими поражениями печени в периферической крови, в немалигнизированных участках печени и в опухоли. В качестве контроля использовали биоптаты печени, взятые при операции по поводу непаразитарных кист. Результаты представлены в таблице 1, 2 и на фиг.1, 2.

Таблица 1
Уровень лимфоцитов в перифокальной зоне и в очаге поражения при первичном раке
Иммунологические показатели, %	Непаразитарные кисты Биоптат печени n=8	Первичный рак Перифокальная зона n=10	Первичный рак Очаг поражения n=10
CD4+	22,3±2,1	21,0±2,1	15,2±1,9*
CD8+	28,4±2,4	24,1±3,6	14,3±1,2*
CD16+	24,8±4,1	14,2±1,5*	12,4±1,4*
CD56+	17,3±2,9	11,0±1,1*	9,0±2,0*
* - статистические достоверные отличия от контроля (р<0,05)

Фиг.1. Уровень лимфоцитов в биоптатах у больных с первичным раком печени по сравнению с контрольной группой.

При этом оказалось, что у больных с первичным гепатоцеллюлярным раком печени в перифокальной зоне печени количество CD8+- лимфоцитов было ниже на 15,0%. Уровень NK-клеток (CD16+ и CD56+) был статистически достоверно снижен по сравнению с контрольной группой на 43 и 36% соответственно (табл.1., фиг.1).

В опухолевых участках печени по сравнению с контрольной группой все изучаемые показатели Т-лимфоцитов были снижены на 32,0-50,0% (различия статистически достоверны, р<0,05) (табл.1, фиг.1).

Изменения уровня Т-лимфоцитов при метастатических поражениях печени представлены в таблице 2 и на фиг.2.

Таблица 2.
Количество лимфоцитов в перифокальной зоне печени и в очаге поражения при метастатических поражениях печени
Иммунологические показатели, %	Контроль n=8	Метастатические поражения печени
Перифокальная зона n=22	Очаг поражения n=22
CD4+	22,3±2,1	10,3±1,0*	11,8±1,5*
CD8+	28,4±2,4	13,4±1,1*	10,0±1,9*
CD16+	24,8±4,1	13,4±1,5*	8,8±2,7*
CD56+	17,3±2,9	11,5±0,8*	8,8±1,3*
*- статистически достоверные отличия от контроля (р<0,05)

Фиг.2. Количество лимфоцитов в биптатах у больных с метастатическими поражениями печени по сравнению с контролем.

У больных с метастатическими поражениями печени, оперированных по поводу колоректального рака, в немалигнизированных участках и особенно в метастазе в 1,5-2 раза снижено количество Т-хелперов (CD4+) и цитотоксических (CD8+, CD16+, CD56+) лимфоцитов по сравнению с контролем (различия статистически достоверны, р<0,05) (табл.2, фиг.2).

Таким образом, как при первичном (гепатоцеллюлярном), так и метастатическом (колоректальном) раке печени обнаружены значительные сдвиги в локальном иммунитете, выраженном в снижении количества основных клеток, обеспечивающий местный иммунитет.

На основании этого разработан способ интрапортального пролонгированного введения иммунопрепаратов для локальных иммуновоздействий на опухолевый процесс в печени.

В качестве иммунопрепарата использовали ронколейкин (отечественный), который представляет собой рекомбинантную форму интерлейкина-2 человека (рИЛ-2). Активная субстанция рИЛ-2 -продуцируется клетками непатогенных пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae, в генетический аппарат, которого встроен ген человеческого интерлейкина-2.

Природный интерлейкин-2 продуцируется субпопуляцией Т-лимфоцитов (Т-хелперов) в ответ на антигенную стимуляцию. ИЛ-2 влияет на рост, дифференцировку и активацию Т- и В-лимфоцитов, прежде всего на цитотоксические (CD8+, CD16+, CD56+) и Т-хелперно-индукторные (CD4+) лимфоциты, осуществляя последующий синтез ИЛ-2, а также моноциты, макрофаги, олигодендроглиальные клетки, эпидермальные клетки Лангерганса (Balkwill F.R. (editor). Cytokine Cell Biology A Practical Approach, 3rd edition, Oxford University Press (2001)).

Суть методики сводится к следующему: больной подвергается оперативному вмешательству по поводу нерезектабельных первичных или метастатических злокачественных опухолей печени, при котором выполняется возможное частичное удаление очагов поражения или их обработка методом высокочастотной термодеструкции, проводится биопсия измененных очагов и неизмененных участков печени. Операция завершается катетеризацией пупочной вены, обеспечивающей поступление лекарственных препаратов непосредственно в портальную систему.

Полученный биопсийный материал подвергается иммунологическому исследованию, в ходе которого проводят фенотипирование лимфоцитов (CD4+, CD8+, CD16+ CD56+, CD25+). Предварительно до операции проводят исследование периферической крови.

На основании полученных данных о локальных сдвигах уровня Т-лимфоцитов (особенно CD4+, CD8+ и CD25+-клеток) в очаге поражения и неизмененной печени определялись показания к проведению интрапортальной иммунотерапии ронколейкином.

Если изучаемые показатели находились в пределах нормы или были снижены незначительно (до 10%) иммунотерапия не проводилась. При более глубоком снижении такая терапия показана.

Схема терапии: на 7-е сутки после операции готовится смесь, состоящая из 250 мл физиологического раствора, 2 млн. ME ронколейкина и 10 мл 10% альбумина. Готовый раствор помещается в инфузор (LV-10, Baxter), позволяющий вводить данную смесь медленно из расчета 10 мл в час в течение суток.

Последующие интрапортальные многократные (5-10) пролонгированные введения проводятся в зависимости от показателей общего иммунитета, опираясь на количественный состав CD4+, CD8+, CD16+, CD56+ и CD25+-лимфоцитов в крови. Перед каждым введением и в конце курса терапии делают забор крови из локтевой вены для изучения количественного состава лимфоцитов.

Клинический пример.

Больной С., 1951 г. рождения, история болезни №8219ф.

Диагноз. Рак ректосигмоидного отдела толстой кишки с множественными метастазами в печень, T₃N₁ M₁, st IY гр II. 12.05.05 проводилась операция резекция сигмы, через месяц были выявлены метастазы в печень. В июне 2005 г. поступил в отделение превентивной онкологии РНИОИ для обследования и комплексного лечения. 20 июня 2005 г. выполнена операция: лапаротомия, инцизионная биопсия опухолевых очагов и неизмененной печени, высокочастотная термодеструкция доступных опухолевых узлов, катетеризация пупочной вены. Интраоперационно взята биопсия опухоли и перифокальной зоны печени на иммунологическое исследование.

На фиг.3 представлены исходные показатели уровня лимфоцитов до операции в периферической крови по сравнению с кровью больных в контрольной группе.

Фиг.3. Исходный уровень лимфоцитов в периферической крови больного по сравнению с контролем.

В периферической крови все уровни исследуемых субпопуляций лимфоцитов были снижены по сравнению с контролем: CD4+ на 11,0%, CD8+ на 19,0%, CD16+ на 36,0%, CD56+ на 17,0% (фиг.3).

Фиг.4. Субпопуляционный состав лимфоцитов в перифокальной зоне печени и в метастазе по сравнению с контролем у больного С.

В метастазе в 2 раза снижено количество CD4+и CD8+-клеток, а CD16+ и CD56+-лимфоцитов - на 8,0% и 32,0% соответственно по сравнению с их содержанием в биоптатах печени в контрольной группе (фиг.4).

В неопухолевом участке печени также все исследуемые показатели были ниже: CD4+ на 40,0%, CD8+ в 2,2 раза, CD16+ на 25,0% и CD56+ на 20,0% по сравнению с контролем (фиг.4).

Больному на фоне низких исходных показателей CD4+ и CD8+-клеток в периферической крови, в ткани печени и в очаге поражения, было проведено поэтапное лечение ронколейкином. Препарат в дозе 2000000 ME вводился интрапортально в течение суток с интервалом в 3 дня, общее количество введений было 5. После завершения курса (5) ронколейкином, проводилась стандартная химиотерапия: 5-Fu 425 мг/м², лейковорин 20 мг/м внутривенно в течение 5 дней (режим Мейо).

Изменения уровней лимфоцитов в динамике представлены в таблице 3 и на фиг.5 и 6.

Таблица 3.
Показатели субпопуляционного состава лимфоцитов в периферической крови у больного С. На этапах введения ронколейкина
Показатели, %		Время введения препарата
	20.06.05	10 сутки	14 сутки	18 сутки	23 сутки	28 сутки
	Суммарная доза введенного ранколейкина
	фон	2 млн. МЕ	4 млн. МЕ	6 млн. МЕ	8 млн. МЕ	10 млн. МЕ
после 1 введ.	после 2 введ.	после 3 введ.	после 4 введ.	после 5 введ.
CD4+	24	34	25	40	44	20
CD8+	22	38	32	20	22	34
CD16+	12	16	18	25	18	15
CD56+	8	10	11	14	21	18
CD25+	6	22	20	22	20	20

Фиг.5. Изменение количества лимфоцитов в периферической крови после 1 и 2 интрапортального введения ронколейкина.

Фиг.6. Изменение уровня лимфоцитов в периферической крови больного после 3, 4 и 5 введений ронколейкина.

По результатам лечения после первого введения препарата (в дозе 2000000МЕ) отмечено повышение всех иммунологических показателей, но особенно CD8+-лимфоцитов - на 58,0%, CD4+ - на 42,0%, CD25+ - почти в 4 раза.

После второго введения ронколейкина (суммарная доза 4000000 ME) снизился уровень CD4+-клеток до исходных данных. Незначительно стал ниже уровень CD8+ и CD25+-клеток.

После третьего введения препарата (суммарная доза 6000000 ME) в 1,7 раза вырос уровень CD4+ и CD56+-клеток, в 2 раза количество CD16+-лимфоцитов, остается стабильно высокий уровень CD25+-клеток, однако снизилось содержание CD8+-клеток до исходных данных.

После четвертого введения (суммарная доза 8000000 ME), нарастает количество CD4+-лимфоцитов (в 1,8 раза), CD56+ (в 2,5 раза). Остается исходным уровень CD8+-клеток и падает содержание CD16+-лимфоцитов до исходных значений.

После пятого введения препарата (суммарная доза 10000000 ME) резко снижается до исходных показателей количество Т-хелперов (CD4+) и возрастает уровень CD8+-клеток. Уровень CD16+ восстанавливается до исходных данных. Держится стабильно высокое содержание CD25+-лимфоцитов, а уровень CD56+-лимфоцитов незначительно снижается, но остается высоким.

Таким образом, из полученных данных видно, что интрапортальное введение ронколейкина значительно изменяет содержание Т-лимфоцитов (CD4+, CD8+, CD16+, CD56+ и CD25+) в периферической крови и, естественно, косвенно, в тканях печени.

Детальный анализ динамики отдельных субпопуляций представлен на фиг.7, 8, 9, 10.

Фиг.7. Уровень CD56+ и CD25+-лимфоцитов в периферической крови на этапах введения ронколейкина.

Фиг.8. Количество CD4+-лимфоцитов в крови на этапах введения ронколейкина.

Фиг.9. Уровень CD8+-клеток в периферической крови в динамике лечения ронколейкином.

Фиг.10. Содержание CD16+-лимфоцитов в периферической крови на различных этапах введения ронколейкина.

Количество CD4+-клеток в дозе 2000000 МЕ нарастает на 42,0%, после второго введения ронколейкина в суммарной дозе 4000000 ME снижается их уровень до исходных данных. В дозах 6000000 ME и 8000000 ME возрастает содержание CD4+-лимфоцитов в 1,7 и в 1,8 раза. После пятого введения препарата (в суммарной дозе 10000000 ME) количество Т-хелперов становится исходным. Исходя из этих данных следует, что наиболее оптимальными введениями являются 4-х кратные интрапортальные инфузии.

Уровень CD8+-клеток в дозе 2000000 ME увеличивается на 58,0%, после третьего введения препарата в суммарной дозе 6000000 ME снижается их содержание до исходного уровня, однако после пятого введения в суммарной дозе 10000000 ME нарастает их количество в крови на 55,0% по сравнению с исходным уровнем.

Содержание CD16+-клеток после третьего введения препарата (в суммарной дозе 6000000 ME) нарастает в 2 раза, однако после пятого введения (в суммарной дозе 10000000 ME) снижается до исходного уровня.

Таким образом, больной был выписан в удовлетворительном состоянии для повторного курса иммуно- и химотерапии через три месяца (28.09.05).

На 90-е сутки у пациента была взята кровь перед повторным введением препарата, ронколейкин вводился интрапортально по 2 млн. ME с интервалом в 3 дня. На 96 сутки после введения ронколейкина проводилось исследование периферической крови. Результаты представлены в таблице 4 и на фиг.11.

Таблица 4.
Показатели субпопуляционного состава лимфоцитов в периферической крови больного С., до и после введения ронколейкина.
	Сроки исследовния
Показатели, %	контроль	фон	90 сутки	96 сутки
CD4+	27,0	24,0	37,0	32,0
CD8+	26,7	22,0	20,0	20,0
CD16+	18,7	12,0	11,0	13,0
CD56+	9,6	8,0	5,0	10,0
CD25+	-	6,0	9,0	6,0

Фиг.11. Количество лимфоцитов в периферической крови больного С. после лечения ронколейкином.

Фиг.12. Характеристика количества лимфоцитов в разные сроки после введения ронколейкина в периферической крови.

Как видно, через 3 месяца фактически нормализовались показатели общего иммунитета, что дало основания проводить более короткий курс терапии ронколейкином (3 инъекции). Общее состояние больного значительно улучшилось, биохимические и показатели общего анализа крови были в норме. При ультразвуковом исследовании дальнейшего опухолевого роста не отмечено. Пациент работает.

Следует особо подчеркнуть, что выраженные положительные сдвиги субпопуляций лимфоцитов, участвующих в регуляции иммуного ответа, обнаружены в условиях проводимой химиотерапии, которая, как правило, вызывает угнетение иммунитета.

Технико-экономическая эффективность.

«Способа адъювантной иммунотерапии первичных и метастатических злокачественных нерезектабельных опухолей печени» заключается в том, что способ обеспечивает возможность прямой точной предварительной интраоперационной базовой оценке состояния локального иммунитета путем подсчета субпопуляции лимфоцитов как в опухоли, так и в непораженной печени. Интрапортальное введение обладает преимуществом двойного эффекта: сначала прямая активация лимфоцитов (Т-хелперов - CD4+, цитотоксических - CD8+ и натуральных киллеров - CD16+ и CD56+), т.е. местные воздействия интерлейкина-2, а затем общее воздействие при попадании из портальной системы в кровоток, который оказывает положительное влияние на куморальные и клеточные звенья общего иммунитета.

Способ определения показаний к адъювантной иммунотерапии первичных и метастатических злокачественных нерезектабельных опухолей печени, включающий введение иммунопрепаратов, отличающийся тем, что в ходе оперативного вмешательства производят инцизионную биопсию участков опухоли и нормальной ткани печени, затем сразу после операции выполняют иммунофенотипирование лимфоцитов в ткани опухоли, нормальной печени и в периферической крови по маркерам CD4+, CD8+, CD16+, CD56+ и при снижении более чем на 10% уровней маркеров лимфоцитов CD4+, CD8+ и уровня NK-клеток CD 16+ и CD56+ в ткани опухоли и периферической крови больного по сравнению с нормальной тканью и периферической кровью считают показанным послеоперационное пролонгированное интрапортальное введение ронколейкина.