Новый перевязочный материал для быстрого заживления раневой поверхности кожи

Настоящее изобретение к медицине. Описан новый перевязочный материал для стимулирования пролиферации эпителиальных клеток и его применение в лечении раневой поверхности кожи. В перевязочном материале используются неорганические элементы кремния и/или кальция в качестве биологически активных веществ, способных инициативно индуцировать пролиферацию эпителиальных клеток кожи человека, подавлять воспалительные экссудаты с раневой поверхности и стимулировать быстрое заживление раневой поверхности кожи, и находиться в дозированной лекарственной форме порошка, мази или пластыря. Перевязочный материал может применяться безопасно, экономно и эффективно в лечении обширной хронической раневой поверхности, такой как резаные раны, ушибы, ожоги, ожоги кипятком, химические ожоги, пролежни, различные язвы на поверхности кожи и тому подобное. 4 н. и 22 з.п. ф-лы, 6 ил.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к новому перевязочному материалу для стимулирования пролиферации эпителиальных клеток, применению неорганического(их) элемента(ов) кремния и/или кальция в изготовлении такого перевязочного материала и к способу стимулирования пролиферации эпителиальных клеток in vitro.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Различные раны кожи на поверхности тела человека представляют собой широко распространенные состояния, неизбежно случающиеся в повседневной жизни, и обычно включают резаные раны, ушибы, ожоги, химические ожоги и тому подобное. Чем дальше отодвигается заживление раны, тем труднее исчезает рубец после заживления раны. Что касается крупных и хронических раневых поверхностей кожи, таких как пролежни и различные кожные язвы у пациентов, страдающих диабетом, быстрое заживление и рост эпителия особенно необходимы. Следовательно, оптимальное лечение различных кожных ран заключается в том, чтобы сдерживать вторичную бактериальную инфекцию и стимулировать быстрое заживление раны.

Из уровня техники известно, что различные антибактериальные мази, кремы или порошки широко применяются в качестве повязок для наружного применения на поверхности тела человека. Однако повязки с отдельными антибиотиками или их смесями могут только сдерживать вторичную бактериальную инфекцию и обычно не проявляют биологической активности по активному индуцированию быстрого роста эпителиальных клеток на раневой поверхности, который приводит к быстрому заживлению раневой поверхности. Патент США 6262020 раскрывает препарат для местного лечения ран, содержащий гиалуроновую кислоту для сдерживания воспалительной реакции на раневой поверхности кожи. Патент США 5190917 и патент США 5290762 раскрывают противовоспалительные эффекты ингибиторов сериновых протеаз, и упомянутые ингибиторы включены в препарат для местного лечения ран для подавления воспалительной реакции на раневой поверхности в патенте США 6262020. Однако все препараты для местного применения, раскрытые в данных патентах, не обладают функцией активного индуцирования и стимулирования быстрого роста эпителия на раневой поверхности. Патент США 5604200 раскрывает местную раневую повязку, содержащую плазменный фибронектин. Однако, хотя данный фибронектин теоретически способен стимулировать адгезию клеток человека, при практическом применении, если фибронектин будет экстрагироваться из плазмы человека, источник будет ограничен, и плазменный фибронектин будет слишком дорогим для клинического применения, а если фибронектин будут получать с помощью генной инженении in vitro, он не будет обладать биологической активностью, схожей с таковой природных белков человеческого организма. Вдобавок, как натуральный, так и синтезированный белок с трудом удается стерилизовать, и он может легко вызвать гиперчувствительность человеческого организма, и стабильность белка трудно поддерживать в различных ситуациях, таких как во время производства, хранения, транспортировки, распределения и в клиниках. Следовательно, идея использования биологически активных белков в качестве активных ингредиентов в широко распространенных препаратах для местного применения не имеет практической клинической применимости.

Таким образом, перевязочные материалы, обладающие достаточной биологической стабильностью и способные индуцировать пролиферацию эпителиальных клеток и заживление ран, чрезвычайно нужны в данной области.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основывается на длительных и глубоких исследованиях по разработке биологического материала для местного применения, обладающего действиями по инициативной индукции пролиферации эпителиальных клеток, устранению воспаления и активному стимулированию быстрого заживления ран на коже человека, и непосредственно основано на новаторском открытии изобретателя.

В общепринятых концепциях все материалы из неорганических элементов являются «инертными», т.е. материалы из неорганических элементов не обладают индуцирующей активностью стимулирования роста биологических клеток.

Новаторское открытие изобретателя свидетельствует, что материалы из некоторых неорганических элементов тоже могут применяться в качестве химических сигналов, чтобы селективно стимулировать и регулировать рост и дифференцировку клеток.

Конкретно, изобретатель открыл, что микрочастицы неорганических элементов кремния и/или кальция обладают биологической активностью инициативной индукции пролиферации, дифференцировки и миграции эпителиальных клеток человека, могут управлять pH на раневой поверхности посредством нейтрализации, чтобы предотвратить воспаление, и обладают более хорошими характеристиками по индукции заживления эпителиальной раны и предотвращению вторичной бактериальной инфекции.

С одной стороны, настоящее изобретение предлагает перевязочный материал для лечения или ослабления болезней или состояний при потребности в стимулировании пролиферации и дифференцировки эпителиальных клеток, где упомянутый перевязочный материал содержит эффективное количество микрочастиц неорганического элемента кремния и/или кальция и, необязательно, фармацевтически приемлемые носители и/или наполнители. Такой перевязочный материал может активно индуцировать пролиферацию эпителиальных клеток и стимулировать быстрое заживление раны.

С другой стороны, настоящее изобретение дополнительно относится к применению неорганического элемента кремния и/или кальция в изготовлении перевязочного материала для лечения или облегчения заболеваний или состояний при потребности в стимулировании пролиферации или дифференцировки эпителиальных клеток.

Наконец, настоящее изобретение предлагает способ стимулирования пролиферации эпителиальных клеток in vitro, включающий применение эффективного количества кремниевых и/или кальциевых микрочастиц к упомянутым клеткам.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой микрофотографию перевязочного материала, содержащего кремниевые/кальциевые микрочастицы, полученную с помощью сканирующего электронного микроскопа;

Фиг.2 представляет собой фотографию культивируемых нормальных эпителиальных клеток человека, подвергающихся индукции кремниевыми/кальциевыми микрочастицами;

Фиг.3 показывает влияние микрочастиц кремния/кальция или их комбинации в различных концентрациях на стимулирование пролиферации нормальных эпителиальных клеток человека;

Фиг.3a показывает кратность пролиферации эпителиальных клеток, подвергнутых воздействию элементов кремния и кальция в течение 12 суток;

Фиг.3b показывает кратность пролиферации эпителиальных клеток, подвергнутых воздействию элементов кремния и кальция в течение 20 суток;

Фиг.4 показывает влияние микрочастиц кремния/кальция или их комбинации в различных концентрациях на индукцию синтеза и секреции коллагена типа IV в нормальных человеческих эпителиальных клетках;

Фиг.4a показывает уровень коллагена типа IV в эпителиальных клетках, подвергнутых воздействию элементов кремния и кальция в течение 12 суток;

Фиг.4b показывает уровень коллагена типа IV в эпителиальных клетках, подвергнутых воздействию элементов кремния и кальция в течение 20 суток;

Фиг.5 показывает влияние микрочастиц кремния/кальция или их комбинации в различных концентрациях на индукцию синтеза и секреции эпителиального фактора роста в нормальных эпителиальных клетках человека;

Фиг.5a показывает уровень эпителиального фактора роста в эпителиальных клетках, подвергнутых воздействию элементов кремния и кальция в течение 12 суток;

Фиг.5b показывает уровень эпителиального фактора роста в эпителиальных клетках, подвергнутых воздействию элементов кремния и кальция в течение 20 суток;

Фиг.6 представляет собой фотографию курса лечения с использованием перевязочных материалов из кремниевых/кальциевых микрочастиц в клиническом случае.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

В одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает перевязочный материал для лечения или облегчения заболеваний или состояний при потребности в стимулировании пролиферации или дифференцировки эпителиальных клеток, где перевязочный материал содержит эффективное количество микрочастиц неорганического элемента кремния и/или кальция и, необязательно, фармацевтически приемлемые носители и/или наполнители. В перевязочном материале по настоящему изобретению содержание микрочастиц неорганического элемента кремния и/или кальция может меняться в широких пределах или регулироваться, например, от 0 до 100%, предпочтительно от 0,5 до 90% по их или его массе в смеси.

В перевязочном материале по настоящему изобретению упомянутый неорганический элемент кремний может быть в форме любого неорганического вещества, включая, например, SiO₂, NaAlSiO₂, KAlSiO₂ или любую их комбинацию; и упомянутый неорганический элемент кальций может быть в форме любого неорганического вещества, включая, например, CaO, CaSO₄, CaPO₄, CaCl₂ или любую их комбинацию.

Впервые доказано и применено использование неорганического элемента «кремний» в качестве главного химического компонента для индукции пролиферации и демонстрации значительного синергического индуцирующего эффекта.

По настоящему изобретению, если не заявлено иначе, элементы кремний, кальций могут использоваться по отдельности, чтобы индуцировать пролиферацию и дифференцировку эпителиальных клеток человека с тем, чтобы индуцировать формирование новой кости активно и эффективно.

Таким образом, если не заявлено иначе, элементы кремний и кальций могут использоваться в комбинации по настоящему изобретению, чтобы сформировать «элементную комбинацию, обладающую активностью эффективной биологической индукции», где атомные пропорции упомянутых элементов в комбинации составляют: кремний от 0 до 100%, и кальций от 100 до 0%. По настоящему изобретению «элементная комбинация веществ, обладающих эффектом эффективной биологической индукции» с оптимальной индуцирующей активностью содержит кремния от 60 до 100%, и кальция от 0 до 50% по процентному содержанию атомной массы.

Впервые дополнительно доказано, что, согласно экспериментальным данным на фиг.3, фиг.4 и фиг.5, проявленный эффект биологической индукции прямо пропорционален концентрации кремния и кальция, и максимальный эффект биологической индукции достигается при насыщении физиологической концентрации кремния (100 ч./млн) и кальция (33 ч./млн), соответственно. Таким образом, по настоящему изобретению концентрации элементов, обладающих эффектом биологической индукции в перевязочном материале, составляют: для кремния его концентрация эффективна, чтобы повысить концентрацию кремния в ткани раневой поверхности до 1-100 ч./млн, и для кальция его концентрация эффективна, чтобы повысить концентрацию кальция в ткани раневой поверхности до 1-33 ч./млн.

Термин «индивидуум» по настоящему изобретению обозначает животное, в частности млекопитающее (такое как обезьяна, рогатый скот, лошадь, свинья, овца, грызун, коза, собака, кошка, кролик), предпочтительно человек.

Микрочастицы кремния и кальция в биологически активном материале могут быть различными микрочастицами, содержащими один из данных двух элементов, комбинацию микрочастиц данных двух элементов или быть составными микрочастицами, полученными смешиванием данных двух элементов и сушкой, и размалыванием полученной в результате смеси посредством общепринятых физических или химических процедур.

Фиг.1 представляет собой микрофотографию перевязочного материала, содержащего кремниевые/кальциевые микрочастицы, полученную с помощью сканирующего электронного микроскопа.

По настоящему изобретению атомное отношение смешанных микрочастиц, содержащих один из данных двух элементов, или данных двух элементов в составных микрочастицах не является решающим для решения задачи настоящего изобретения, потому что все атомные отношения или массовые отношения данных двух элементов находятся в пределах диапазона проявления эффекта эффективной индукции, и различие заключается только в уровне индуцирующей активности. Следовательно, все комбинации, содержащие в качестве биологического индуцирующего вещества только неорганический элемент кремний или его комбинацию с неорганическим элементом кальцием в качестве синергического активного вещества в любом атомном или массовом отношении, могут применяться в качестве биологически активных веществ в раневом перевязочном материале для кожи человека по настоящему изобретению.

Диаметры микрочастиц кремния и кальция могут представлять распределение смешанного типа (см. фиг.1), и диаметры микрочастиц кремния и кальция, как правило, находятся в диапазоне от 100 нм до 100 мкм, где мелкие микрочастицы (меньше 1000 нм) имеют преимущества немедленного проявления эффекта биологической индукции, когда микрочастицы контактируют с клетками или раневой поверхностью кожи, в то время как крупные микрочастицы (больше 1000 нм и меньше 100 мкм) вызывают замедленный и отдаленный эффект биологической индукции путем постепенного растворения и высвобождения после контакта микрочастиц с клетками или раневой поверхностью кожи. Таким образом, смесь крупных и мелких микрочастиц может не только вызвать эффект немедленной индукции эпителиальных клеток на раневой поверхности, но и поддерживать пролиферацию и дифференцировку эпителиальных клеток, обеспечивая длительное индуцирующее влияние перевязочного материала на раневую поверхность. Следует отметить, что размер микрочастиц по настоящему изобретению связан только со временем вызывания эффекта индукции и временем поддерживания эффекта индукции, и непосредственно не меняет активность биологической индукции кремниевого/кальциевого материала, как определено по настоящему изобретению. Следовательно, по настоящему изобретению микрочастицы кремния и кальция могут быть любого диаметра, который позволит упомянутым микрочастицам быть растворимыми. Предпочтительно, чтобы диаметр микрочастиц кремния и кальция находился в пределах от 100 нм до 100 мкм.

По настоящему изобретению неорганические элементы кремний и кальций определены как являющиеся биологически активными элементами, способными к индукции пролиферации, дифференцировки и заживления ткани кожи человека, что является крупным достижением в области биологических материалов. Из уровня техники известно, что синтезированные или экстрагированные экзогенные коллагены, эпителиальные факторы роста или различные белки адгезии рассматриваются как обладающие эффектом индукции эпителия, однако они имеют некоторые недостатки, такие как более низкая безопасность, более низкая стабильность биологической активности и высокая стоимость, и почти не могут использоваться в биоинженерии или клинике. Согласно экспериментальным данным на фиг.3, фиг.4 и фиг.5, так же, как клиническому случаю раны кожи человека, показанному на фиг.6 настоящего изобретения, впервые доказано, что неорганические элементы кремний и кальций по отдельности или в комбинации могут заменить биологически активный белок, чтобы индуцировать эпителиальные клетки и явно стимулировать быстрое заживление раневой поверхности кожи. Применение данных неорганических элементов как главных активных веществ в перевязочном материале для раневой поверхности кожи человека обладает преимуществами безопасности, стабильности, легкости получения и низкой стоимости, и может явно увеличить практическую применимость перевязочного материала для раненой кожи.

Из уровня техники известно, что мелкие повседневные раны поверхности кожи можно лечить стерильными лейкопластырями, такими как «наклейки". Однако данные наклейки используются только, чтобы закрыть раневую поверхность и не имеют никакой противовоспалительной активности, не индуцируют рост эпителия и не стимулируют быстрое заживление раненой кожи. Из уровня техники известно, что отдельные или смешанные антибиотики также используются в повязках для лечения раненой кожи, но данные повязки могут только сдерживать вторичную бактериальную инфекцию на раневой поверхности, но не могут инициативно индуцировать быстрый рост эпителиальных клеток на раневой поверхности, который приводит к быстрому заживлению раны. Материалы для перевязки ран, содержащие неорганический элемент кремний и/или кальций по настоящему изобретению, могут применяться различными способами, включая, но не ограничиваясь, следующими тремя способами:

1) В форме порошка микрочастиц, непосредственно накладываемого на раневую поверхность кожи, где состав микрочастиц является таким, как определено по настоящему изобретению, т.е. микрочастицы включают различные микрочастицы, содержащие один из элементов, кремний и кальций, комбинацию микрочастиц данных двух элементов, или составные микрочастицы, полученные смешиванием данных двух элементов, и сушкой, и размалыванием полученной в результате смеси общепринятыми физическими или химическими процедурами, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем и/или вспомогательным веществом.

2) Из неорганических элементов кремния и/или кальция может быть приготовлена мазь посредством смешивания с общепринятым вспомогательным веществом, таким как медицинский вазелин, в качестве основы, которая применима для лечения раневой поверхности кожи. Основа может покрывать раневую поверхность и также действовать как носитель, переносящий эффективные вещества, такие как биологически активные неорганические элементы, как упомянуто выше, и позволяющий эффективным веществам прилипать к раневой поверхности кожи на длительный период и достигать оптимального биологического эффекта. Содержание неорганических элементов биологической индукции в мази является таким, как определено по настоящему изобретению, т.е. концентрация кремния такая, которая позволяет увеличить концентрацию кремния в ткани раневой поверхности до 1-100 ч./млн, и концентрация кальция такая, которая позволяет увеличить концентрацию кальция в ткани раневой поверхности до 1-33 ч./млн.

3) «Пластырь» - тип повязки для ран кожи, может быть приготовлен путем применения неорганических микрочастиц кремния и/или кальция, как определено по настоящему изобретению, в качестве компонента биологической индукции и обычноймарли лейкопластыря в качестве подложки. Компоненты эффективной биологической индукции неорганических элементов кремния и кальция в перевязочном материале для ран кожи типа пластыря являются такими, как определено выше по настоящему изобретению с точки зрения химических разновидностей, пропорций и диаметров частиц. Перевязочный материал для ран кожи типа пластыря может иметь любой размер, пригодный для различных ран кожи человека.

Перевязочный материал по настоящему изобретению может применяться во многих областях, например, он может использоваться в качестве покрытия на поверхности различных устройств (таких как металлические стенты для коронарной артерии), которые будут имплантированы в организм человека.

Перевязочный материал по настоящему изобретению может, кроме того, не содержать или содержать любой общепринятый антибиотик широкого спектра действия или специфический антибиотик в любом количестве, и не содержать или содержать любое общепринятое местное анестезирующее средство в любом количестве.

Перевязочный материал по настоящему изобретению может, кроме того, содержать другие факторы, которые способны стимулировать пролиферацию эпителиальных клеток, такие как коллагены, эпителиальный фактор роста и/или факторы роста человека, различные природные белки, выделенные из человеческого организма, различные антибиотики и бактериостатические средства в виде китайской традиционной медицины или западной медицины, различные противовоспалительные средства, различные аутологичные или гетерологичные материалы из кожи, различные материалы из кожи животных или их экстракты, различные металлические и органические добавки или любую их комбинацию.

Преимущества настоящего изобретения по сравнению с уровнем техники заключаются в следующем: использование микрочастиц кремния и кальция с эффектом индукции на человеческие эпителиальные клетки в качестве главного эффективного компонента «активного вещества биологической индукции» в перевязочном материале делает перевязочный материал по настоящему изобретению безусловно превосходящим те обычные «наклейки» и мази с антибиотиками без эффекта биологической индукции, известные из уровня техники; благодаря первому применению неорганических элементов в качестве компонентов биологической индукции, их биологическая стабильность и безопасность безусловно превосходят таковые синтетические коллагены или факторы роста в данной области; и поскольку «активное вещество биологической индукции» по настоящему изобретению является основным, оно может эффективно нейтрализовать кислые экссудаты раневой поверхности, чтобы сформировать местную среду, облегчающую рост эпителиальных клеток и быстрое заживление раны. Неорганические элементы, используемые в качестве активных веществ по настоящему изобретению, имеют преимущества стабильности свойств и низкой цены, таким образом, безусловно превосходя любой перевязочный материал, содержащий биологические белки в качестве активных веществ, известный из уровня техники. Кроме того, комбинация неорганических активных веществ с антибиотиком широкого спектра действия по настоящему изобретению может эффективно предотвратить вторичную бактериальную инфекцию на раневой поверхности кожи, обеспечивая индуцирующее воздействие активных элементов кремния/кальция на эпителиальные клетки и быстрое заживление кожи. Суммируя, перевязочный материал по настоящему изобретению может инициативно индуцировать пролиферацию эпителиальных клеток и стимулировать быстрое заживление раны (данный срок сокращается, по меньшей мере, наполовину). Быстрое заживление раневой поверхности может предотвратить или уменьшить формирование рубца после заживления раненой кожи. Таким образом, перевязочный материал по настоящему изобретению пригоден для лечения различных раневых поверхностей кожи, например, ожогов больших поверхностей, химических ожогов, пролежней и кожных язв у пациентов, страдающих, например, диабетом, и различных резаных ран, повреждений от падений, ушибов, ожогов кипятком в повседневной жизни и т.п.

Данные новые перевязочные материалы обладают активностью биологической индукции и также обладают преимуществами стабильности свойств, безопасности, низкой стоимости и несложности в применении, следовательно, могут эффективно и широко применяться на различных раневых поверхностях кожи, от мелких поверхностных ран, таких как резаные раны и ушибы в повседневной жизни, до крупных поверхностных ран, таких как ожоги, химические ожоги, пролежни и язвы на поверхности человека (например, язвы кожи у пациентов, страдающих диабетом), чтобы стимулировать быстрое заживление раны.

Биологически активные компоненты перевязочного материала для кожи по настоящему изобретению отличаются от препарата для местного лечения ран, содержащего гиалуроновую кислоту в качестве главного активного вещества, как раскрыто в патенте США 6262020, по той причине, что биологически активные компоненты по настоящему изобретению могут как сдерживать воспаление, так и стимулировать рост эпителия, в то время как гиалуроновая кислота может только сдерживать воспалительную реакцию на раневой поверхности кожи. Продукт по настоящему изобретению отличается от ингибиторов сериновых протеаз, как раскрыто в патенте США 5190917, патенте США 5290762 и патенте США 6262020, по той причине, что данные ингибиторы сериновых протеаз обладают только противовоспалительными эффектами, но не имеют никакого эффекта биологической индукции как продукт по настоящему изобретению. Настоящее изобретение отличается от местной раневой повязки, содержащей плазменный фибронектин, как раскрыто в патенте США 5604200, по той причине, что, хотя повязка, раскрытая в патенте США 5604200, могла бы теоретически стимулировать адгезию клеток человека, но при практическом применении, если плазменный фибронектин будет извлекаться из человеческой плазмы, то источник будет ограничен, и плазменный фибронектин будет слишком дорог, чтобы использоваться в клинике, а если фибронектин будет получен методом генной инженерии in vitro, то белки, полученные таким образом, не будут обладать биологической активностью, подобной таковой природных белков в человеческом организме. Следовательно, теория использования белка с биологической активностью в качестве активного компонента в широко распространенном препарате для местного применения не имеет практической клинической ценности. В общепринятых концепциях все материалы из неорганических элементов являются «инертными», т.е. материалы из неорганических элементов не обладают активностью стимулирования роста организмов. Активные химические компоненты, используемые в перевязочном материале по настоящему изобретению, представляют собой группу материалов из неорганических элементов, и впервые настоящий изобретатель открыл, что некоторые неорганические элементы обладают активностью биологической индукции эпителиальных клеток. Благодаря данному открытию комбинация неорганических элементов может применяться, чтобы заменить обычные белки биологической индукции, чтобы стимулировать индукцию роста эпителиальных клеток. Тем временем, упомянутая комбинация неорганических элементов дополнительно обладает противовоспалительным эффектом и прекрасной биологической стабильностью, так что она может разрешить проблемы, существующие в уровне техники и может применяться, чтобы формировать поверхностные перевязочные материалы, обладающие функциями облегчения воспаления, подавления бактерий, стимулирования пролиферации эпителиальных клеток и заживления раневой поверхности, для лечения резаных ран, ушибов, ожогов, химических ожогов и т.д.

По настоящему изобретению, если не заявлено иначе, термин «активное вещество биологической индукции» определен как вещество, способное инициативно стимулировать нормальную пролиферацию и дифференцировку клеток, чтобы достичь определенных физиологических функций. Неорганические элементы кремний и кальций по настоящему изобретению имеют активность биологической индукции по инициативному стимулированию нормальной пролиферации и специфической дифференцировки эпителиальных клеток человека, чтобы достичь определенных физиологических функций (таких как синтез и секреция коллагена типа IV и эпителиального фактора роста). Синтез и секреция коллагена типа IV и эпителиального фактора роста выполняют важную функцию в быстрой пролиферации эпителиальных клеток и быстром заживлении раневой поверхности кожи. Никакие перевязочные материалы для раневой поверхности кожи, известные из уровня техники, не обладают такой функцией специфической биологической индукции. «Активное вещество биологической индукции» по настоящему изобретению дополнительно определено как неорганические элементы кремний и кальций.

Настоящее изобретение, кроме того, предлагает способ стимулирования пролиферации эпителиальных клеток in vitro, включающий применение эффективного количества микрочастиц кремния и/или кальция по настоящему изобретению к таким эпителиальным клеткам. В варианте осуществления упомянутые микрочастицы растворимы и имеют диаметр, например, от 100 нм до 100 мкм. Упомянутые микрочастицы могут находиться в любой форме неорганических соединений кремния и кальция, включая SiO₂, NaAlSiO₂, KAlSiO₂, CaO, CaSO₄, CaPO₄, CaCl₂ и т.д., или любые их комбинации. В одном варианте осуществления упомянутые микрочастицы кремния и кальция применяются в комбинации, где кремний составляет 50-100%, а кальций составляет 0-50%, исходя из относительной атомной массы. Конечная концентрация кремния может составлять, например, 1-100 ч./млн, и конечная концентрация кальция может составлять, например, 1-33 ч./млн.

Настоящее изобретение далее описывается подробно следующими неограничивающими примерами вместе с чертежами.

ПРИМЕР 1

Приготовление микрочастиц кремния/кальция со смешанным типом биологической индукции.

Диаметры микрочастиц кремния и кальция по настоящему изобретению могут находиться в форме смешанного типа. В одном варианте осуществления диаметр микрочастиц кремния и кальция по настоящему изобретению находится в диапазоне от 100 нм до 100 мкм, но настоящее изобретение не ограничивается данным диапазоном. Исходными веществами являются диоксид кремния (SiO₂) и оксид кальция (CaO), и массовое соотношение исходных веществ следующее: диоксид кремния 60% и оксид кальция 40%. Процесс приготовления смесей состоит из: смешивания упомянутых кремниевых и кальциевых неорганических исходных веществ в заранее установленном отношении, размола в мельнице Retsch в течение 1-3 суток, просеивания через мелкоячеистые сита, чтобы получить различные микрочастицы с различными диаметрами от 100 нм до 100 мкм, и смешивания данных микрочастиц согласно их размеру и пропорции. Диаметры микрочастиц определяются измерением под сканирующим электронным микроскопом.

Фиг.1 представляет собой микрофотографию перевязочного материала, содержащего кремниевые/кальциевые микрочастицы, полученную с помощью сканирующего электронного микроскопа. Данные микрочастицы кремния/кальция со смешанным типом биологической индукции автоклавируются и применяются в цитологических испытаниях и клиническом случае в последующих примерах.

ПРИМЕР 2

Пролиферация и миграция нормальных эпителиальных клеток человека при индукции микрочастицами кремния и кальция (фиг.2)

Эпителиальные клетки человека, которые будут исследоваться, забирали из тканей кожи здоровых доноров 20-25 лет. Эпителиальные ткани промывали стерильным физиологическим раствором и помещали в чашки для культур клеток. Данные чашки для культур затем помещали в общепринятую, питательную среду для клеток, содержащую 10% сыворотки коровьих эмбрионов и 0,2% антибиотика широкого спектра действия, затем чашки инкубировали в инкубаторе, атмосфера которого содержала 5%CO₂, при 37°C. Питательную среду заменяли новой питательной средой ежедневно. На 14-е сутки эпителиальные клетки мигрировали из культивируемых эпителиальных тканей на поверхности чашек для культивирования. Затем ткани удаляли, и полученные эпителиальные клетки поддерживали на чашках для культивирования для пролиферации. Когда клетки подвергали трем пассажам или пролиферировали до достаточного количества, клетки отделяли от чашек для культивирования 10%-ной коллагеназой, чтобы использовать в последующих исследованиях. В исследованиях клетки засевались на обычные чашки для культивирования диаметром 2 см с питательной средой, содержащей 10% сыворотки коровьих эмбрионов и антибиотик широкого спектра действия, а также микрочастицы неорганических элементов кремния/кальция, приготовленные согласно примеру 1. В течение процедуры культивирования питательные среды заменяли новыми питательными средами, имеющими тот же самый состав, каждые четыре дня, а затем релевантные физиологические активности клеток измеряли в моменты времени, как описано в данных примерах. На фотографии настоящего примера можно заметить, что эпителиальные клетки пролиферируют значительно, распространяются и мигрируют на второй день культивирования клеток.

ПРИМЕР 3

Ощутимое индукционное воздействие микрочастиц кремния и кальция на пролиферацию нормальных эпителиальных клеток человека (фиг.3)

Ранняя, быстрая пролиферация эпителия является необходимым предварительным условием для быстрого заживления раневой поверхности эпителия. В настоящих испытаниях эпителиальные клетки, используемые для определения испытываемых материалов, забирали из нормальной кожи человека, и клетки культивировались и росли на питательных средах, содержащих микрочастицы кремния и кальция по настоящему изобретению, приготовленных согласно способу из примера 2. Определенные комбинации химических компонентов предварительно добавляли в питательные среды для культивирования клеток, используемые в настоящих испытаниях, в концентрациях как изображено в таблице на фиг.3. Одна группа служила контролем. Экспериментальные группы с испытываемыми материалами сравнивались с упомянутой контрольной группой, чтобы определить индукционное влияние испытываемых материалов на рост клеток. Во время процедуры культивирования питательные среды заменяли новыми питательными средами, имеющими те же самые конкретные составы, каждые четыре дни. Испытания пролиферации клеток проводили на 12-е и 20-е сутки путем подсчета с помощью обычного проточного цитометра общего количества клеток, выросшего на питательных средах с различными комбинациями добавок в различных концентрациях, и кратность пролиферации эпителиальных клеток, как показано на фиг.3, вычислялась на основе числа клеток, прикрепившихся к чашкам для культивирования в течение первых 24 часов. Испытания доказывают, что неорганический элемент кремний проявляет явную активность стимулирования пролиферации эпителиальных клеток. По сравнению с контрольной группой на 12-е сутки 100 ч./млн кремния приводили приблизительно к 3-кратной пролиферации, 50 ч./млн кремния приводили приблизительно к 2,5-кратной пролиферации, и 10 ч./млн приводили приблизительно к 1,5-кратной пролиферации; 33 ч./млн кальция приводили приблизительно к 1,5-кратной пролиферации, и 16 ч./млн и 8 ч./млн кальция тоже приводили к явной пролиферации (см. фиг.3a). Когда данные два неорганических элемента, кремний и кальций, добавляются в питательные среды в различных концентрациях, как показано на фиг.3b, пролиферация клеток увеличивается на 4,5 раза, 3,5 раза и 2 раза, соответственно, по сравнению с контрольной группой. На 20-е сутки из-за продолжающегося индукционного эффекта, 100 ч./млн кремния вызвали 3-кратную пролиферацию, и комбинация 100 ч./млн кремния и 33 ч./млн кальция привела к более чем 5-кратной пролиферации. По результатам групп с различными комбинациями химических компонентов в течение различных периодов культивирования можно заметить, что индуцирующее влияние на пролиферацию клетки прямо пропорционально концентрациям кремния и кальция в границах, примененных в настоящих испытаниях. Следовательно, доказано, что неорганические элементы кремний и кальций проявляют явное индуцирующее влияние на пролиферацию эпителиальных клеток.

ПРИМЕР 4

Микрочастицы кремния и кальция значительно индуцируют синтез и секрецию коллагена типа IV в нормальных человеческих эпителиальных клетках (фиг.4)

Коллаген типа IV является одним из главных внеклеточных матриксных белков в эпителии, и его синтез и секреция являются одним из важных показателей активности нормальных эпителиальных клеток человека. Он играет важную роль в заживлении раневой поверхности эпителия. Увеличение синтеза и секреции коллагена типа IV облегчает быстрое заживление раневой поверхности эпителия. В данном примере нормальные эпителиальные клетки человека, использованные в экспериментальных группах и контрольной группе, культивировались в соответствии с процедурой и условиями из примера 3. Единственное различие заключалось в том, что синтез и секреция коллагена типа IV культивируемых эпителиальных клеток количественно измерялись на 12-е сутки и 20-е сутки в течение культивирования. Уровень коллагена типа IV, секретируемого в питательные среды клетками данных групп, был определен общепринятыми иммуногистохимическими методами с помощью моноклональных антител против коллагена типа IV (приобретенных в Sigma Inc.). Размеры выражены через фг коллагена типа IV, секретированного на 10 миллионов клеток к 12-м суткам и 20-м суткам. Результаты показывают, что неорганический элемент кремний значительно индуцирует синтез и секрецию коллагена типа IV. По сравнению с контрольной группой на 12-е сутки в течение культивирования 100 ч./млн кремния приводили к 1-кратному увеличению, и 50 ч./млн и 100 ч./млн кремния также приводили к значительному увеличению; 33 ч./млн кальция приводили к 0,5-кратному увеличению, и 16 ч./млн и 8 ч./млн кальция тоже приводили к значительному увеличению. Когда данные два неорганических элемента, кремний и кальций, добавлялись в питательные среды в различных концентрациях, как показано на фиг.4, синтез и секреция коллагена типа IV увеличивалась соответственно на 2 раза, 1,5 раза и 1 раз по сравнению с контрольной группой. На 20-е сутки из-за продолжающегося индуцирующего эффекта испытываемого материала 100 ч./млн кремния увеличивали синтез и секрецию коллагена типа IV на 4 раза, и комбинация 100 ч./млн кремния и 33 ч./млн кальция имела более чем 8-кратный эффект индукции. По результатам различных комбинаций химических компонентов в течение различных периодов культивирования можно заметить, что индуцирующее влияние на синтез и секрецию коллагена типа IV явно прямо пропорционально концентрации кремния и кальция в пределах исследованных концентраций и комбинаций. Следовательно, доказано, что неорганические элементы кремний и кальций проявляют явное индуцирующее воздействие на синтез и секрецию коллагена типа IV в эпителиальных клетках. Поддерживаемый и постепенно увеличивающийся уровень коллагена типа IV дает большое преимущество при построении коллагеновой матрицы на раневой поверхности, а также при заживлении раневой поверхности.

ПРИМЕР 5

Микрочастицы кремния и кальция значительно индуцируют синтез и секрецию эпителиального фактора роста в нормальных человеческих эпителиальных клетках (фиг.5).

Эпителиальный фактор роста является одним из главных регулирующих белков в пролиферации эпителиальных клеток, и его синтез и секреция являются одним из важных показателей активности нормальных эпителиальных клеток человека. Эпителиальный фактор роста играет важную роль в заживлении раневой поверхности эпителия. Увеличение синтеза и секреции эпителиального фактора роста облегчает быструю пролиферацию эпителиальных клеток и быстрое заживление раневой поверхности. В настоящем испытании нормальные эпителиальные клетки человека, использованные в экспериментальных группах и контрольной группе, культивировались в соответствии с процедурой и условиями, как раскрыто в примере 4, различия состояли в том, что синтез и секреция эпителиального фактора роста культивируемых эпителиальных клеток количественно измерялись на 12-е сутки и 20-е сутки в течение периода культивирования. Содержание эпителиального фактора роста, секретируемого клетками данных групп в питательные среды для культивирования клеток, измерялось общепринятыми иммуногистохимическими методами с помощью моноклональных антител к эпителиальному фактору роста (приобретенных Siynia Inc.), и значения выражались как фенограммы коллагена типа IV, секретированного на 10 миллионов клеток на 12-е и 20-е сутки. Результаты испытания доказывают, что неорганический элемент кремний проявляет значительную активность стимулирования синтеза и секреции эпителиального фактора роста. По сравнению с контрольной группой на 12-е сутки в течение периода культивирования 100 ч./млн кремния приводили к примерно 4,5-кратному увеличению, и 50 ч./млн и 10 ч./млн кремния тоже приводили к значимому увеличению; 33 ч./млн кальция приводили к 1,5-кратному увеличению, и 16 ч./млн кальция тоже приводили к явному увеличению. Когда два данных неорганических элемента, кремний и кальций, добавляются в питательные среды в различных концентрациях, как показано в фиг.5, синтез и секреция эпителиального фактора роста соответственно увеличиваются на 6,5 раз, 3,5 раза и 2,5 раза по сравнению с контрольной группой. На 20-е сутки в течение периода культивирования из-за сохраняющегося индуцирующего эффекта исследуемого материала 100 ч./млн кремния увеличили синтез и секрецию эпителиального фактора роста на 1 раз, и комбинация 100 ч./млн кремния и 33 ч./млн кальция привели к индуцирующему эффекту, близкому к 3-кратному. По результатам групп с различными комбинациями химических компонентов во время различных периодов культивирования можно заметить, что индуцирующее влияние на синтез и секрецию эпителиального фактора роста прямо пропорционально концентрации кремния и кальция в пределах исследованных концентраций и комбинаций. Следовательно, это доказывает, что неорганические элементы кремний и кальций проявляют явное индуцирующее воздействие на синтез и секрецию эпителиального фактора роста в эпителиальных клетках. В частности, большое увеличение синтеза и секреции эпителиального фактора роста, вызванное испытываемыми материалами в течение раннего периода культивирования, значительно усиливает пролиферацию и амплификацию эпителиальных клеток на ранней стадии заживления раненого эпителия и значительно стимулирует заживление раневой поверхности.

ПРИМЕР 6

Клинический случай применения нового перевязочного материала из микрочастиц кремния и кальция для стимулирования быстрого заживления раневой поверхности на коже человека.

Настоящий пример освещает клиническое воздействие нового перевязочного материала из микрочастиц кремния и кальция на стимулирование быстрого заживления раневой поверхности на коже человека. Пациенткой являлась 16-летняя девушка, которая поранила левое колено при падении около плавательного бассейна. Ушиб имел площадь приблизительно 3x6 квадратных сантиметров и достигал глубокого слоя дермы с заметными экссудатами на раневой поверхности. После травмы пациентку немедленно начали лечить путем распыления нового перевязочного материала из микрочастиц кремния и кальция на раневую поверхность, которую затем закрывали стерильной марлей. После 48 часов лечения полностью исчезли экссудаты на раневой поверхности, вторичная инфекция не возникала на раневой поверхности, и бульшую часть раневой поверхности покрывали эпителиальные клетки. После 7 суток лечения раневая поверхность полностью зажила, и поверхность кожи была плоской, за исключением малого количества остаточного гема, образовавшегося вследствие просачивания крови в ушиб. Повторный осмотр, проведенный через 4 недели лечения, показал, что раневая поверхность полностью зажила, оставшийся гем по существу исчез, и нет заметной пигментации, и нет рубца. На фиг.6 показаны фотографии раневой поверхности в различные моменты времени после лечения новым порошковым перевязочным материалом по настоящему изобретению, увеличенные фотографии показаны в правом столбце. Данный пример доказывает, что ранозаживляющая способность нового перевязочного материала по настоящему изобретению очень велика. Если раневая поверхность лечится обычным перевязочным материалом, экссудаты на раневой поверхности сохраняются более 3 суток, и более 10 суток требуется для того, чтобы раневая поверхность покрылась эпителиями. Кроме того, трудно сдерживать бактериальную инфекцию обычным перевязочным материалом, и инфекция может дополнительно задержать заживление раневой поверхности. Однако период для заживления раневой поверхности будет сокращен, по меньшей мере, наполовину, когда применяется перевязочный материал по настоящему изобретению. Поскольку задержка заживления раневой поверхности является главным фактором, который вызывает формирование рубца после заживления раневой поверхности, новый перевязочный материал по настоящему изобретению, который может ускорить заживление раневой поверхности, мог бы эффективно предотвратить формирование рубца после заживления раневой поверхности.

Очевидно, что настоящее изобретение может быть выполнено способом, отличающимся от конкретно раскрытого в вышеупомянутом содержании и примерах.

Так как настоящее изобретение может быть изменено или приспособлено, основываясь на вышеупомянутом раскрытии, настоящее изобретение может быть выполнено способом, отличающимся от приведенного в подробном описании. Все такие изменения находятся в пределах объема изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.

Полное содержание всех публикаций (включая патенты, заявки на патент, журналы, лабораторные руководства, книги или другие документы) включено здесь посредством ссылки.

Библиография

1.Chou L., Firth JD, Uitto V-J, Brunette DM. (1995) Substratum surface topography alters cell shape and regulates fibronectin, mRNA level, mRNA stability, secretion and assembly in human fibroblasts. Journal of Cell Sciences.108:1563-1573.

2.Chou L., Firth JD, Uitto V-J, Brunette DM. (1996) Effects of titanium on transcriptional and post-transcriptional regulation of fibronectin in human fibroblast. Journal of Biomedical Materials Research. 31:209-217.

3.Chou L, Firth JD, Uitto V-J, Brunette DM. (1998) Effects of titanium substratum and grooved surface topography on metalloproteinase-2 expression in human fibroblast. Journal of Biomedical Materials Research. 39:437-446.

4.Chou L, Marek B, Wagner WR, (1999) Effects of hydroxyapatite coating crystallinity on biosolubility, cell attachment efficiency, and proliferation in vitro. Biomaterials. 20:977-985.

5. US Patent 6,262,020, July 17, 2001.

6. US Patent 5,604,200, February 18, 1997.

* Примечание: CHOU L. является английским именем настоящего изобретателя.

1. Перевязочный материал для лечения или облегчения заболеваний или состояний индивидуума, нуждающегося в стимулировании пролиферации или дифференцировки эпителиальных клеток, который состоит из микрочастиц неорганического соединения, содержащего кальций или смеси неорганического соединения, содержащего кремний и неорганического соединения, содержащего кальций.

2. Перевязочный материал по п.1, который состоит из микрочастиц неорганического соединения, содержащего кальций.

3. Перевязочный материал по п.1, который состоит из микрочастиц соединения, содержащего кремний и кальций в комбинации.

4. Перевязочный материал по п.1, где упомянутые микрочастицы растворимы.

5. Перевязочный материал по п.1, где упомянутые микрочастицы имеют диаметр от 100 нм до 100 мкм.

6. Перевязочный материал по п.1, где микрочастицы неорганического соединения, содержащего кремний, представляют собой микрочастицы любого соединения, содержащего кремний, выбранного из группы, состоящей из SiO₂, NaAlSiO₂, KAlSiO₂, или из любой их комбинации.

7. Перевязочный материал по п.1, где микрочастицы неорганического соединения, содержащего кальций, являются микрочастицами любого соединения, содержащего кальций, выбранного из группы, состоящей из СаО, CaSO₄, CaPO₄, CaCl₂, или из любой их комбинации.

8. Перевязочный продукт, содержащий перевязочный материал по любому из пп.1-7 и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель, антибиотики, общепринятое местное анестезирующее средство или другой фактор, способный к стимулированию пролиферации эпителиальных клеток, такой как коллагены и/или эпителиальный фактор роста, или любая их комбинация.

9. Перевязочный материал по любому из пп.1-7, который представлен в виде порошка, мази или пластыря.

10. Перевязочный материал по любому из пп.1-7, который представляет собой перевязочный материал для раневой поверхности кожи и предназначен для стимулирования заживления раненой кожи.

11. Перевязочный материал по любому из пп.1-7, где упомянутые заболевания или состояния выбраны из группы, состоящей из резаных ран, ушибов, ожогов, ожогов кипятком, химических ожогов, пролежней, различных язв на поверхности кожи и тому подобного.

12. Перевязочный материал по любому из пп.1-7, где упомянутый индивидуум является животным, в частности млекопитающим (таким как обезьяна, рогатый скот, лошадь, свинья, овца, грызун, коза, собака, кошка или кролик), предпочтительно, человеком.

13. Перевязочный продукт по п.8, который представлен в виде порошка, мази или пластыря.

14. Перевязочный продукт по п.8, где перевязочный материал предназначен для раневой поверхности кожи и может применяться для стимулирования заживления раненой кожи.

15. Перевязочный продукт по п.8, где болезни или состояния выбираются из группы, состоящей из резаных ран, ушибов, ожогов, ожогов кипятком, химических ожогов, пролежней, различных язв на поверхности кожи и тому подобного.

16. Перевязочный продукт по п.8, где индивидуум является животным, в частности, млекопитающим (таким как обезьяна, рогатый скот, лошадь, свинья, овца, грызун, коза, собака, кошка или кролик), предпочтительно, человеком.

17. Применение неорганического соединения, содержащего кальций, или смеси неорганического соединения, содержащего кремний и неорганического соединения, содержащего кальций, при изготовлении перевязочного материала для лечения или облегчения болезней или состояний индивидуума, нуждающегося в стимулировании пролиферации или дифференцировки эпителиальных клеток.

18. Применение по п.17, где перевязочный материал используется в качестве слоя, покрывающего поверхность различных устройств, которые имплантированы in vivo.

19. Применение по п.17, где устройства, которые имплантированы in vivo, представляют собой металлические стенты для коронарной артерии.

20. Применение по п.17, где упомянутые болезни или состояния выбираются из группы, состоящей из резаных ран, ушибов, ожогов, ожогов кипятком, химических ожогов, пролежней, различных язв на поверхности кожи и тому подобного.

21. Применение по п.17, где неорганические элементы кремний и/или кальций находятся в форме отдельного элемента или составных элементов, и упомянутые микрочастицы имеют диаметр от 100 нм до 100 мкм.

22. Способ стимулирования пролиферации эпителиальных клеток in vitro, включающий контролирование пролиферативно эффективного количества микрочастиц неорганического соединения, содержащего кальций, или смеси неорганического соединения, содержащего кремний и неорганического соединения, содержащего кальций, к эпителиальным клеткам.

23. Способ по п.22, где конечная концентрация кремния составляет от 1 до 100 ч./млн.

24. Способ по п.22, где конечная концентрация кальция составляет от 1 до 33 ч./млн.

25. Способ по п.22, где микрочастицы имеют диаметр от 100 нм до 100 мкм.

26. Способ по п.22, где неорганическое соединение, содержащее кремний, и неорганическое соединение, содержащее кальций, представляет собой любое соединение, такое как SiO₂, NaAlSiO₂, KAlSiO₂, CaO, CaSO₄, CaPO₄, CaCl₂, или любую их комбинацию.