Молочная питательная среда для получения биомассы бактерий-пробиотиков
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической, пищевой промышленности и касается приготовления питательных сред для культивирования бифидо- и лактобактерий с целью получения биомассы микроорганизмов и дальнейшего ее использования в производстве заквасок для лечебно-профилактических продуктов, а также для производства биологически активных добавок (БАД). Молочная питательная среда содержит основу в виде обезжиренного молока с содержанием сухого остатка 13-14%, цистеин солянокислый или аскорбиновую кислоту, лактопептон, очищенный дрожжевой экстракт с показателем аминного азота 2,1-2,8%, общего белка не менее 3-4%, натрий хлористый, марганец сернокислый семиводный и магний сернокислый четырехводный. Питательная среда обеспечивает возможность культивирования как бифидобактерий, так и лактобактерий при более длительных сроках хранения и более высоких титрах биомассы бактерий в процессе хранения. 1 з.п. ф-лы, 4 табл.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической, пищевой промышленности и касается приготовления питательных сред для культивирования бифидо- и лактобактерий с целью получения биомассы микроорганизмов и дальнейшего ее использования в производстве заквасок для лечебно-профилактических продуктов, а также для производства биологически активных добавок (БАД).
В настоящее время продукты и биологически активные добавки с пробиотическими микроорганизмами занимают ведущее место в комплексе мер, направленных на профилактику и коррекцию нарушений микрофлоры. Значимость пробиотических препаратов и продуктов диктует необходимость разработки новых эффективных недорогих производственных питательных сред для наработки микробной массы. В производстве биологически активных добавок с пробиотиками, а также лечебно-профилактических продуктов и заквасок для них важной является разработка питательной основы для пробиотических микроорганизмов. Такая основа должна включать все основные компоненты, соответствующие потребностям бактерий. Культивирование в такой среде должно способствовать, как минимум, сохранению пробиотических свойств микроорганизмов. Производственная питательная среда должна обеспечивать высокую скорость размножения: для лактобактерий до 5-7 часов и для бифидобактерий до 18 часов, высокую концентрацию жизнеспособных микробных клеток в единице объема среды - не менее 1·1010 КОЕ/мл, высокую сохранность жизнеспособных микробных клеток - не менее 70-90 суток.
Питательные потребности молочнокислых бактерий весьма разнообразны и связаны с биохимической активностью микроорганизмов. По мере обогащения среды белком повышается способность бактерий сбраживать лактозу, добавление пептонов и пептидов (продукты гидролиза белка) усиливает рост молочнокислых бактерий в значительно большей степени, чем аминокислоты. Следует отметить, что количество аминокислот, требуемое различными молочнокислыми бактериями, непостоянно и зависит от потребностей штаммов. Бифидобактериям больше всего требуются аминокислоты: пролин, серин, аланин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Обладая некоторой протеолитической активностью, бифидобактерии могут в небольшой степени дополнительно обеспечить свои потребности в азотистых веществах.
Все питательные вещества в среде должны находиться в легкоусвояемой форме, белки, в частности, в форме гидролизатов, автолизатов. В ряде случаев несовершенная технология получения белковых гидролизатов и автолизатов может привести к появлению в их составе значительного количества пептидов высокой молекулярной массы, аммиака, а также окрашенных примесей, образовавшихся за счет деструкции лабильных аминокислот и взаимодействия с альдегидами. Наличие этих компонентов в среде существенно уменьшает питательную эффективность. Качество белковых гидролизатов в значительной степени обусловливается выбранным способом проведения гидролиза, обеспечивающим требуемую глубину гидролиза, и степенью последующей очистки получаемого гидролизата.
Для наращивания биомассы используются питательные среды различного состава. Известен состав питательной среды для роста бифидо- и лактобактерий, представляющий собой гидролизат молока, в который введены в качестве добавок пептон, хлорид натрия, агар-агар, лактоза, цистеин солянокислый, при следующем соотношении компонентов (Инструкция по приготовлению кисломолочного бифидумбактерина на молочных кухнях. - М.: МЗ РСФСР, 1987, - 11 с.), г/л:
| Пептон | 2,0 |
| Хлорид натрия | 5,00 |
| Агар-агар | 0,75 |
| Лактоза | 10,00 |
| Цистеин солянокислый | 0,10 |
| Гидролизат молока | остальное. |
Данный состав находит применение в практике для роста бифидо- и лактобактерий.
Однако наряду с дорогой основой - гидролизатом молока он содержит и дорогие добавки, такие как пептон, цистеин солянокислый. Кроме того, данный состав является недостаточно эффективной питательной средой для выращивания бифидо- и лактобактерий.
Известна питательная среда для наращивания биомассы бифидобактерий и лактобактерий на основе гидролизата гороха при следующем соотношении компонентов (Патент РФ №2061037, МПК С12N 1/20, опубл. 27.05.96 г), мас.%:
| Пептон | 0,15-0,25 |
| Натрий хлористый | 0,2-0,4 |
| Агар-агар | 0,075-0,1 |
| Лактоза | 0,5-2,0 |
| Гидролизат гороха, разведенный водой до | |
| содержания аминного азота 130-150 мг % | остальное до 100%. |
Приведенный состав имеет низкое содержание низкомолекулярных пептидов и аминокислот (Аминный азот 130-150 мг%), поэтому не обеспечивает наработку биомассы высокой концентрации - не более 108 КОЕ/мл. При этом время наращивания микробной массы (не менее 24 часов), титруемая кислотность и сроки сохранности не соответствуют предъявляемым требованиям.
Известна также питательная среда для накопления биомассы бактерий на основе молочной сыворотки при следующем соотношении компонентов (Патент РФ №2087532, МПК С12N 1/20, опубл. 20.08.97 г), мас.%:
| Молочная сыворотка осветленная | 7,5-10,0 |
| Лактоза | 0,3-0,5 |
| Дрожжевой автолизат | 2,0-3,0 |
| D, L-цистеин | 0,05-0,1 |
| NaH2PO4·2Н2O | 0,7-0,8 |
| NH4Cl | 0,1-0,15 |
| MgSO4·7H2O | 0,015-0,020 |
| Агар-агар | 0,75-0,080 |
| Вода | остальное |
| рН | 7,2-7,4 |
Среда подобного состава, хотя и дает высокую скорость роста, не имеет достаточного количества питательных веществ (белков, пептидов, аминокислот) для длительной сохранности микробных клеток, что очень важно для препаратов и БАД-пробиотиков. Дополнительным эффектом высоких ростовых показателей является значительное повышение титруемой кислотности, негативно отражающееся на органолептических свойствах конечного продукта. Наличие дорогостоящих компонентов (агар-агар, цистеин) в производстве препаратов и БАД-пробиотиков приводит к повышению себестоимости конечного продукта.
Широко известна кукурузно-лактозная среда (КЛС) для культивирования бифидобактерий и молочнокислых бактерий (ТУ 10-02-02-789-192-95):
| Агар-агар | 2,5 г |
| Пептон | 10 г |
| Кукурузный экстракт | 40 мл |
| Натрий лимоннокислый | 6,6 г |
| Магний сернокислый | 0,12 г |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный | 2,0 |
| Лактоза | 10 г |
| Цистин солянокислый | 0,15 г |
Однако КЛС не содержит гидролизованных белковых компонентов молока или дрожжевых клеток, что не обеспечивает при культивировании длительных сроков сохранности конечного продукта. Наличие в составе среды нестандартного компонента - кукурузного экстракта обусловливает нестандартность самой среды, а также неудовлетворительные органолептические свойства получаемых БАД и заквасок.
Наиболее близким аналогом (прототипом) к заявляемой является молочная питательная среда для получения жидкого концентрата бифидобактерий, содержащая основу цистеин солянокислый (L-цистин), D(-)-лактозу, гидролизат молочных белков и аутолизат дрожжей и натрий хлористый. В качестве гидролизата молочных белков используют панкреатический гидролизат обрата молока, в качестве аутолизата дрожжей используют ферментативный аутолизат дрожжей, а в качестве основы используют нормализованный по сухому остатку обрат молока при суммарном содержании аминного азота в питательной среде 260-300 мг% при следующем соотношении ее компонентов, мас.% (патент РФ №2169763, МПК C12N 1/20, А61К 35/74, А23С 9/12, опубл. 27.06.2001 г.):
| Панкреатический гидролизат обрата молока | 5,0-7,0 |
| Цистеин солянокислый (L-цистин) | 0,001-0,003 |
| D(-)-лактоза | 0,03-0,09 |
| Натрий хлористый | 0,01-0,05 |
| Ферментативный аутолизат дрожжей | 1,0-2,0 |
| Обрат молока (основа), нормализованный | |
| по сухому остатку | Остальное до 100%. |
В качестве ферментативного аутолизата дрожжей используют аутолизат с показателем аминного азота 350-400 мг%. Обрат молока нормализован по сухому остатку до значения 13,0-14%. Кроме того, в питательную среду дополнительно вносят соевый изолят в количестве по массе 0,2-0,3%. Для активизации соевого изолята в питательную среду дополнительно вводят цитрат натрия в количестве по массе 0,1-0,2%.
Однако панкреатический гидролизат белков обрата молока содержит наряду с высокомолекулярными и низкомолекулярными пептидами частично гидролизованный казеин и другие компоненты, которые плохо усваиваются бактериями, а ферментативный аутолизат дрожжей наряду с витаминами и стимулирующими факторами роста бактерий содержит токсические вещества - продукты ферментативного автолиза, которые не благоприятствуют условиям роста бактерий (Т.М.Эрвольдер, А.В.Гудков и Л.П.Семенова. Воздействие ферментативных гидролизатов на накопление биомассы бифидобактерий. Журн. "Молочная промышленность", N 12, 1980, - с.15-17), вследствие чего снижаются сроки и титр биомассы бифидо- и лактобактерий в процессе хранения.
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание такой питательной среды, которая обеспечивала бы возможность культивирования как бифидобактерий, так и лактобактерий при более длительных сроках хранения и более высоких титрах биомассы бактерий в процессе хранения.
Указанный технический результат достигается тем, что в молочной питательной среде для получения биомассы бактерий-пробиотиков, содержащей основу в виде нормализованного по сухому остатку обрата молока, цистеин солянокислый (L-цистин) или аскорбиновую кислоту, гидролизат молочных белков и ростовые факторы из дрожжевых клеток, натрий хлористый, согласно изобретения среда дополнительно содержит марганец сернокислый MnSO4·4H2O и магний сернокислый MgSO4·7Н2О, в качестве гидролизата молочных белков используют ферментативный гидролизат сывороточных белков молока, в качестве ростовых факторов из дрожжевых клеток используют очищенный дрожжевой экстракт при следующем соотношении ее компонентов, мас.%:
| ферментативный гидролизат сывороточных | |
| белков молока | 5,0-7,0 |
| цистеин солянокислый (Ĺ-цистин) | |
| или аскорбиновая кислота | 0,001-0,002 |
| натрий хлористый | 0,03-0,05 |
| марганец сернокислый MnSO4·4Н2О | 0,001-0,005 |
| магний сернокислый MgSO4·7H2O | 0,01-0,02 |
| очищенный дрожжевой экстракт | 1,5-2,0 |
| Обрат молока (основа), нормализованный | |
| по сухому остатку | Остальное до 100% |
Молочная питательная среда содержит очищенный дрожжевой экстракт с показателем аминного азота 2,1-2,8%, общего белка не менее 3-4%, ферментативный гидролизат сывороточных белков молока (лактопептон) с показателем общего белка не менее 11%, аминного азота не менее 4%, а обрат молока содержит лактозу в количестве не более 15% и нормализован по сухому остатку до значения 13,0-14,0%.
Суммарный аминный азот в питательной среде содержится в количестве не менее 300 мг.%.
Введение в основу среды ферментативного гидролизата (лактопептон) сывороточных белков молока (лактальбумин и лактоглобулин) обеспечивает обогащение ее смесью высокомолекулярными и низкомолекулярными пептидами, которые являются более эффективными стимуляторами роста бифидо- и лактобактерий, чем, например, панкреатический гидролизат белков (основной компонент - казеин) обрата молока. Сывороточные белки молока по аминокислотному составу близки к белкам женского молока. В сравнении с казеином они более легко подвергаются полному гидролизу, содержат незаменимые серусодержащие кислоты в количестве, соответствующем потребностям человека, в 4 раза больше содержат цистеина и в 19 раз больше триптофана и их использование более предпочтительно в производстве пробиотиков для детей.
Очищенный экстракт дрожжей содержит витамины группы В и стимулирующие факторы роста бифидобактерий, а также оптимальное содержание аминного азота, обеспечивающего наиболее благоприятные условия роста для бифидо- и лактобактерий, и по сравнению с ферментативным аутолизатом дрожжей не содержит токсичные продукты метаболизма дрожжей, угнетающие рост бактерий.
Ощутимое повышение качества дрожжевого экстракта достигается за счет совершенствования технологии его получения - происходит перевод в растворимое состояние 30-50% дрожжевого белка, повышение перевариваемости клеточного белка на 8-10% за счет разрыхления всех слоев клеточной стенки.
Дрожжевой экстракт содержит:
- незаменимые аминокислоты - лизин, метионин, глицин, аланин, гистидин, аспарагиновую кислоту, треонин, глутаминовую кислоту, валин и др.;
- витамины - рибофлавин (В2), тиамин (В1), пиридоксин (B6), цианкобаламин (В12), ниацин (РР);
- протекторные пептиды.
Компонентами, обеспечивающими редуцирующие свойства заявляемой среды, являются, в основном, цистеин или аскорбиновая кислота, а также аминокислоты глутамин и аспарагин, которыми богат очищенный экстракт дрожжей, входящий в состав среды.
Для обеспечения роста и развития молочнокислые бактерии нуждаются в неорганических соединениях, особенно в ионах марганца и ионах магния. Марганец препятствует аутолизу клеток и необходим для нормальных процессов жирового обмена. Mn++ и Mg++ снимают токсическое действие Zn++ при наличии его в среде.
Изобретение позволяет получить высокий начальный титр и увеличить срок хранения без угнетения роста и повышения активной кислотности пробиотических препаратов, полученных с использованием предложенной питательной среды.
Недостаток готовых азотистых веществ в заявляемой питательной среде возмещается добавлением в обезжиренное молоко лактопептона (ферментативный гидролизат сывороточных белков молока) и дрожжевого экстракта. Сывороточные белки молока играют важную роль в наращивании биомассы пробиотических бактерий и формировании качества конечного продукта, поскольку имеют высокое содержание незаменимых и серосодержащих аминокислот. Белки молочной основы (в основном, казеин) характеризуются высокой биологической ценностью и уникальным набором аминокислот, что позволяет улучшить общую сбалансированность аминокислотного состава конечного продукта. Молоко содержит уникальный дисахарид - лактозу, которая оказывает благотворное влияние на состав нормофлоры кишечника. При нагревании молока, например при его стерилизации, лактоза превращается в лактулозу, которая является мощным бифидогенным фактором. В молоке содержится значительное количество макро- и микроэлементов, витаминов. Особенно важен легкоусвояемый кальций молока, витамины A, B1, В2, Д, С, каротин.
Ниже приведены примеры составов заявляемой питательной среды.
Пример 1. Минимальное содержание компонентов среды (мас.%):
| ферментативный гидролизат | |
| сывороточных белков молока | 5,0 |
| цистеин солянокислый (Ĺ-цистин) | 0,001 |
| натрий хлористый | 0,03 |
| марганец сернокислый MnSO4·4Н2О | 0,001 |
| магний сернокислый MgSO4·7H2O | 0,01 |
| очищенный дрожжевой экстракт | 1,5 |
| Обрат молока (основа), нормализованный | |
| по сухому остатку | Остальное до 100% |
Пример 2. Среднее содержание компонентов среды (мас.%):
| ферментативный гидролизат сывороточных | |
| белков молока | 6,0 |
| аскорбиновая кислота | 0,0015 |
| натрий хлористый | 0,04 |
| марганец сернокислый MnSO4·4Н2О | 0,003 |
| магний сернокислый MgSO4·7H2O | 0,015 |
| очищенный дрожжевой экстракт | 1,7 |
| Обрат молока (основа), нормализованный | |
| по сухому остатку | Остальное до 100% |
Пример 3. Максимальное содержание компонентов среды (мас.%):
| ферментативный гидролизат сывороточных | |
| белков молока | 7,0 |
| цистеин солянокислый (Ĺ-цистин) | 0,002 |
| натрий хлористый | 0,05 |
| марганец сернокислый MnSO4·4Н2О | 0,005 |
| магний сернокислый MgSO4·7H2O | 0,02 |
| очищенный дрожжевой экстракт | 2,0 |
| Обрат молока (основа), нормализованный | |
| по сухому остатку | Остальное до 100% |
Ниже приведены данные (таблицы 1 и 2) по культивированию бифидобактерий (штамм Bifidobacterium bifidum 791 БАГ) и лактобактерий (штамм лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S) с использованием заявляемой питательной среды и среды-прототипа. Из указанных таблиц видно, что титр как бифидобактерий, так и лактобактерий после культивирования с использованием заявляемой питательной среды в несколько раз выше, чем с использованием среды-прототипа, а время культивирования соответственно меньше.
| Таблица 1 | ||||
| Титр лактобактерий и активность кислотообразования при культивировании в заявляемой питательной среде | ||||
| № п/п | Состав среды | Начальный титр, КОЕ/мл | Кислотность, °T | Время сквашивания, час |
| 1 | Пример 1 | 1,2·1010 | 115 | 4,0 |
| 2 | Пример 2 | 2,5·1010 | 120 | 3,5 |
| 3 | Пример 3 | 1,5·1010 | 126 | 4,0 |
| 4 | Среда-прототип | 7,0·109 | 107 | 5,0 |
| Таблица 2 | ||||
| Титр бифидобактерий и активность кислотообразования при культивировании в заявляемой питательной среде | ||||
| № п/п | Состав среды | Начальный титр, КОЕ/мл | Кислотность, °T | Время сквашивания, час |
| 1 | Пример 1 | 4·1010 | 130 | 16 |
| 2 | Пример 2 | 1·1010 | 145 | 18 |
| 3 | Пример 3 | 1·1010 | 155 | >18 |
| 4 | Среда-прототип | 2·109 | 124 | 24-30 |
Пример 4. Исследование длительности хранения консорциума штаммов лактобактерий в жидком концентрате лактобактерий
Исследована длительность хранения консорциума штаммов лактобактерий в жидком концентрате (таблица 3). В качестве посевной дозы используется консорциум штаммов лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5863), Lactobacillus plantarum П-75 (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 3962); Lactobacillus casei Сб (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5724) в соотношении 2:0,5:0,5. Сквашивание производят при температуре (39-40)°С в течение 4-5 часов до достижения кислотности готового продукта не менее 100°Т.
Значительный срок (до 72 дней) хранения с титром не ниже 10 КОЕ/мл связан с обеспечением начальной кислотности препарата консорциума лактобактерий не более (120-140)°Т, получением исходного титра лактобактерий (не ниже 1010 КОЕ/мл) за счет использования заявляемой молочной питательной среды с добавлением лактопептона и дрожжевого экстракта.
| Таблица 3 | ||||||||
| Данные по культивированию консорциума бифидобактерий с использованием заявляемой питательной среды и хранению его биомассы | ||||||||
| Производственная закваска | Биомасса лактобактерий на основе консорциума | |||||||
| Виды штаммов лактобактерий в консорциуме 0,5:0,5:2 | Питательная среда | Время культивирования, часы | Кислотность, Т° | Титр (КОЕ/мл) ЖКБ в процессе хранения | Сгусток | |||
| 1 сут | 72 сут | 1 сут | 60 сут | 72 сут | ||||
| В-5724 | Заявляемая среда | 4,0. | 140 | 160 | Нормальный | |||
| В-3962 | 1·1010 | 6·109 | 2·109 | |||||
| В-5863 | ||||||||
| То же | Среда - прототип | 5,0 | 170 | 320 | 2,5·109 | 9,0·107 | 2,5·107 | Нормальный |
Пример 5. Исследование длительности хранения биомассы консорциума штаммов бифидобактерий в жидком концентрате бифидобактерий, полученном с использованием заявляемой питательной среды
Исследована длительность хранения консорциума штаммов бифидобактерий в жидком концентрате бифидобактерий (таблица 4). В качестве посевной дозы бифидобактерий используют консорциум штаммов бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 8-3, Bifidobacterium longum Я-3, Bifidobacterium adolescentis B-1 в соотношении 3:1:1.
Посевную дозу бифидобактерий вносят в объеме 5,0-7,0% от объема питательной среды с титром бифидобактерий не менее 109 КОЕ/мл, культивирование осуществляют в течение времени, достаточного для получения концентрата бифидобактерий с биологическим титром не менее (0,8-1,0)1011 КОЕ/мл.
Значительный срок (до 72-х дней) хранения жидкого концентрата бифидобактерий с титром не ниже 1010 КОЕ/мл связан с обеспечением начальной кислотности препарата консорциума бифидобактерий не более (140-145)°Т, получением исходного титра бифидобактерий (не ниже 1011 КОЕ/мл).
| Таблица 4 Данные по культивированию консорциума бифидобактерий с использованием заявляемой питательной среды и хранению его биомассы | ||||||||
| Производственная закваска | Жидкий концентрат бифидобактерий (ЖКБ) на основе консорциума | |||||||
| Состав заявляемого консорциума | Соотношение штаммов | Время культивирования, час | Кислотность, T° | Титр (КОЕ/мл) ЖКБ в процессе хранения | Сгусток | |||
| 1 сут | 72 сут | 1 сут | 60 сут | 72 сут | ||||
| l)B.bifidum 8-3 | 60 | 22 | 146 | 150 | 3·1011 | 1·1010 | 1·1010 | Нормальный |
| 2)B.longum (Я-3) | 20 | |||||||
| 3)B.adolescentis.В-1 | 20 | |||||||
| То же | Среда - прототип | 29 | 137 | 152 | 5·109 | 1·108 | 9·107 | Нормальный |
Таким образом, технический результат заявляемого изобретения подтверждает создание такой питательной среды, которая обеспечивает возможность культивирования как бифидобактерий, так и лактобактерий при более длительных сроках хранения (до 72 суток и более) и более высоких титрах биомассы бактерий в процессе хранения.
1. Молочная питательная среда для получения биомассы бактерий-пробиотиков, содержащая основу в виде обезжиренного молока с содержанием сухого остатка 13-14%, цистеин соляно-кислый или аскорбиновую кислоту, гидролизат молочных белков, ростовые факторы из дрожжевых клеток и натрий хлористый, отличающаяся тем, что среда дополнительно содержит марганец серно-кислый четырехводный и магний серно-кислый семиводный, в качестве гидролизата белков молока содержит лактопептон, а в качестве ростовых факторов из дрожжевых клеток - очищенный дрожжевой экстракт с показателем аминного азота 2,1-2,8%, общего белка не менее 3-4% при следующем соотношении компонентов питательной среды, мас.%:
| лактопептон | 5,0-7,0 |
| цистеин соляно-кислый | |
| или аскорбиновая кислота | 0,001-0,002 |
| натрий хлористый | 0,03-0,05 |
| марганец серно-кислый четырехводный | 0,001-0,005 |
| магний серно-кислый семиводный | 0,01-0,02 |
очищенный дрожжевой экстракт с
| показателем | |
| аминного азота | 2,1-2,8% |
| общего белка не менее 3-4% | 1,5-2,0 |
| обезжиренное молоко с содержанием | |
| сухого остатка 13-14% | остальное до 100% |
2. Молочная питательная среда по п.1, отличающаяся тем, что обезжиренное молоко содержит лактозу в количестве не более 15%.
