Способ получения жидкого или сухого концентрата или закваски бифидобактерий
Изобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии и пищевой промышленности. Способ получения жидкого или сухого концентрата или закваски бифидобактерий включает введение посевной дозы культуры бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 8-3 (ВКПМ Ас-1248), Bifidobacterium longum Я3 (ВКПМ Ас-1252), Bifidobacterium adolescentis B1 (ВКПМ Ac-1243) в питательную среду. Среда содержит, (мас.%): лактопептон 5,0-7,0; цистеин солянокислый 0,001-0,005; автолизат или экстракт пекарских дрожжей 2,0-4,0; обезжиренное молоко с содержанием СОМО не более 8,0% - остальное до 100%. Биомассу бифидобактерий выращивают при (37,0-38,0)±0,5°С до получения концентрата бифидобактерий не менее 1011 КОЕ/мл. Продукт охлаждают и фасуют или в него вводят в защитную среду и лиофильно высушивают в стерильных условиях. Изобретение обеспечивает возможность наработки стабильной однородной биомассы бифидобактерий в относительно «бедной» среде культивирования для получения препаратов с высоким титром бифидобактерий. 4 з.п. ф-лы, 5 табл.
Область техники
Изобретение представляет собой консорциум штаммов бифидобактерий и способ получения на основе его жидкого или сухого концентрата или закваски бифидобактерий, сухих препаратов бифидобактерий, а также кисломолочных, лечебно-диетических продуктов, бифидосодержащих биологически активных добавок (БАД) и препаратов-пробиотиков на основе указанного жидкого концентрата бифидобактерий и может быть использовано в биотехнологии, медицинской микробиологии и пищевой промышленности.
Функции нормальной микрофлоры в организме являются жизненно важными и очень обширными: синтезирующая, регуляторная, десенсибилизирующая, дезинтоксикационная, ферментативная, защитная и иммуностимулирующая. Препараты и продукты, содержащие в своем составе бифидобактерии, широко используются для профилактики и лечения дисбактериозов и нормализации микрофлоры кишечника людей, перенесших стрессовые воздействия, антибиотико- и химиотерапию.
Предшествующий уровень техники
За рубежом широко используют препараты-пробиотики и продукты лечебного питания на основе консорциумов штаммов бифидобактерий видов B. bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. breve, В. infantis в разных комбинациях (Патент США №5843922, МПК С12N 1/20, А61К 31/715, опубл. 01.12.1998; Заявка США №2002015990, МПК С12N 1/20, опубл. 07.02.2002; патент США №6335040, МПК А23С 19/32, опубл. 01.01.2002), а также на основе консорциумов штаммов бифидо- и лактобактерий (Заявка США №20020090416, МПК A23L 1/00, опубл. 11.07.2002; патент США №5866385, МПК С12N 1/21, А23С 9/123, опубл. 02.02.1999).
Однако консорциумы штаммов бифидобактерий и консорциумы штаммов бифидо- и лактобактерий зарубежных фирм-разработчиков ориентированы на создание, преимущественно, лечебно-профилактических препаратов и БАД в сухой форме (таблетки, капсулы). Указанные консорциумы штаммов имеют существенные недостатки, если их использовать для приготовления препаратов и кисломолочных продуктов в жидкой форме: малые сроки хранения указанных препаратов и продуктов, низкие органолептические качества, которые несущественны для препаратов в сухой форме.
Известны консорциумы штаммов бифидо- и лактобактерий, используемые для производства кисломолочных и неферментированных продуктов в жидкой форме (Патент РФ №2180348, МПК С12N 1/20, опубл. 2002 г.; патент РФ №2180914, МПК С12N 1/20, опубл. 2002 г.; патент РФ №2180915, МПК С12N 1/20, опубл. 2002 г.).
Основным недостатком кисломолочных продуктов, изготовленных на основе консорциумов штаммов бифидо- и лактобактерий, является недостаточный срок их хранения (не более 1 месяца) вследствие того, что лактобактерии в процессе хранения продукта способствуют быстрому его закислению. Титр бифидобактерий в закисленном продукте быстро падает, что снижает лечебно-профилактические свойства этого продукта.
Известен консорциум пяти видов штаммов бифидобактерий (WO 98/44090, МПК С12N 1/20, опубл. 08.10.1998 г.), который предназначен для приготовления кисломолочных, неферментированных пищевых продуктов и бактерийных препаратов. Консорциум получен сочетанием штаммов бифидобактерий В. bifidum 791, В. longum, B379M, В. breve 79-119, B. infantis 73-15, B. adolescentis Г7513, имеющих близкие культуральные и физиолого-биохимические свойства, а также обладающих сквашивающей активностью. Консорциум штаммов пяти видов бифидобактерий активно размножается в питательных средах с накоплением производственной биомассы в короткие сроки культивирования. Сквашивает молоко с образованием сгустка с хорошими вкусовыми и органолептическими свойствами, обладает специфической активностью. Консорциум штаммов рекомендован в составе заквасок для приготовления кисломолочных лечебно-диетических продуктов, неферментированных пищевых продуктов и бактерийных препаратов. Готовый продукт содержит в 1 мл 109 живых бактерий. В 1 дозе препарата не менее 107 живых клеток бифидобактерий.
Однако такой консорциум штаммов бифидобактерий недостаточно устойчив к повреждающим факторам сред культивирования и агрессивных сред гастроинтестинального тракта (кислот, протеолитических ферментов) при хранении и при продвижении бифидобактерий консорциума в желудочно-кишечном тракте, а следовательно, недостаточна его жизнеспособность и колонизирующие свойства в случае употребления продуктов на основе консорциума.
Известен способ получения концентрата бифидобактерий, включающий глубинное выращивание культуры бифидобактерий на питательной среде, содержащей (мас.%): основу до 100%; панкреатический гидролизат казеина 1,5-2,0; автолизат пекарских дрожжей 0,3-0,5; глюкозу 0,25-0,95; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1-0,2; аммоний лимоннокислый трехзамещенный 0,2-0,3; натрий хлористый 0,3-0,4; магний сернокислый семиводный 0,1-0,2 и цистин 0,025-0,03. Культуру бифидобактерий выращивают в 2 стадии продолжительностью 19-24 часа до получения концентрата биомассы с последующим ее обезвоживанием в присутствии защитной среды и сушку продукта (патент РФ №2005119, МПК С12N 1/20, опубл. 30.12.93). На основе указанного концентрата бифидобактерий могут быть приготовлены бифидосодержащие кисломолочные продукты.
Однако данный способ сложен в реализации, т.к. может быть осуществлен только в условиях глубинного культивирования в ферментере в 2 стадии продолжительностью до 24 часов с непрерывным перемешиванием среды, приборным отслеживанием и периодической корректировкой ряда параметров культуральной среды. Кроме того, концентрат бифидобактерий, полученный данным способом, имеет недостаточный титр и может храниться длительное время только в сухом виде. Жидкая форма такого продукта быстро теряет свою активность в процессе хранения.
Наиболее близким аналогом (прототипом) заявляемого консорциума является консорциум трех штаммов бифидобактерий (Заявка РФ №2003107387, МПК С12N 1/20, опубл. 20.12.2004 г.). Консорциум штаммов бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum №791БАГ (коллекционный №В-686 НИИ коллекций культур микроорганизмов ГНЦ ВБ "Вектор", Кольцово), Bifidobacterium bifidum 8-3 (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5799), Bifidobacterium longum ДВА-13 (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5894), используемые для получения жидкого концентрата бифидобактерий, кисломолочных, неферментированных лечебно-профилактических продуктов, биологически активных добавок и бактерийных препаратов. Консорциум устойчив к повреждающим факторам сред культивирования и агрессивных сред гастроинтестинального тракта человека, обеспечивает утилизацию широкого спектра аминокислот, т.е. обладает высокой жизнеспособностью и колонизирующими свойствами, что обеспечивает получение препаратов и продуктов на его основе с более длительными сроками хранения при сохранении высоких лечебно-профилактических свойств.
Наиболее близким способом получения концентрата или закваски бифидобактерий, в том числе и консорциума указанных бактерий, является способ, включающий введение посевной дозы культуры бактерий Bifidobacterium bifidum в питательную среду, содержащую основу питательной среды с добавками цистеина солянокислого и автолизата пекарских дрожжей и выращивание культуры Bifidobacterium bifidum при (37-38)±0,5°С до получения концентрата бифидобактерий, охлаждение и фасовку готового продукта (Патент РФ №2104706, МПК А61К 35/74, опубл. 20.02.1998). В питательную среду дополнительно вводят D(-)-лактозу, аскорбиновую кислоту, панкреатический гидролизат молока, в качестве основы питательной среды используют стерильное молоко с содержанием сухого остатка молока (СОМО) 11-14% при следующем соотношении компонентов питательной среды, мас.%:
| Панкреатический гидролизат молока | 7-9 |
| D(-)-лактоза | 0,05-0,15 |
| Цистин солянокислый | 0,001-0,007 |
| Аскорбиновая кислота | 0,003-0,009 |
| Автолизат пекарских дрожжей | 0,5-2,0 |
| Стерильное молоко (основа) остальное | до 100% |
Причем посевную дозу культуры бактерий Bifidobacterium bifidum вносят в объеме 5-7% от объема питательной среды с титром (5·107-5·108) КОЕ/мл, а культивирование осуществляют в течение времени, достаточного для получения концентрата бифидобактерий с биологическим титром не менее (0,8-1,0) 1010 КОЕ/мл и кислотностью 100-120°Т. Такой консорциум получают с использованием ростовой питательной среды, обогащенной белковыми веществами (12% сухого остатка молока при избытке белка).
Однако наряду с положительными качествами такого консорциума (обеспечение длительных сроков хранения его в жидком виде, хорошая органолептика) существуют и негативные свойства. Низкая устойчивость к антибиотикам. При производстве на основе данного консорциума сухого концентрата бифидобактерий и сухих бифидопрепаратов наблюдается нестабильность и неоднородность биомассы бактерий в процессе ее высушивания (из-за высокого содержания белка) и, как следствие, недостаточно высокая концентрация бифидобактерий в сухом препарате. Кроме того, изготовление среды для культивирования данного консорциума требует использование высококачественного сухого обезжиренного молока.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом предлагаемого изобретения является более высокая устойчивость заявляемого консорциума штаммов бифидобактерий к антибиотикам с видовым составом штаммов, расширяющим его пробиотические лечебно-профилактические свойства (колонизационные и антагонистические) и обеспечивающим возможность наработки стабильной однородной биомассы бифидобактерий в относительно «бедной» среде культивирования для получения сухих препаратов с высоким титром бифидобактерий.
Указанный технический результат достигается тем, что создан консорциум штаммов бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 8-3 (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №Ас 1248), Bifidobacterium longum Я3 (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №Ас-1252), Bifidobacterium adolescentis B1 (депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №Ас-1243), используемый для получения жидкого или сухого концентрата или закваски бифидобактерий.
Указанный технический результат достигается также тем, что в способе получения жидкого или сухого концентрата или закваски бифидобактерий, включающем введение посевной дозы культуры бифидобактерий в питательную среду, содержащую основу питательной среды с добавками цистеина солянокислого, автолизата пекарских дрожжей, и выращивание биомассы бифидобактерий при (37-38)±0,5°С до получения концентрата бифидобактерий, охлаждение и фасовку готового жидкого продукта или введение в жидкий продукт защитной среды и лиофильное высушивание в стерильных условиях, согласно изобретению, в питательную среду дополнительно вводят гидролизат обрата молока лактопептон, в качестве основы питательной среды используют обрат молока с низким содержанием сухого остатка молока (СОМО) - не более 8,0% при следующем соотношении компонентов питательной среды, мас.%:
| Гидролизат обрата молока (лактопептон) | 5,0-7,0 |
| Цистеин солянокислый | 0,001-0,005 |
| Автолизат пекарских дрожжей | 2,0-4,0 |
| Обрат молока (основа) с СОМО не более 8% | остальное до 100% |
В качестве посевной дозы бифидобактерий используют консорциум штаммов бифидобактерий по п.1 настоящей формулы изобретения: Bifidobacterium bifidum 8-3, Bifidobacterium longum Я3, Bifidobacterium adolescentis B1.
В посевной дозе штаммы Bifidobacterium bifidum 8-3, Bifidobacterium longum Я3, Bifidobacterium adolescentis В1 находятся в соотношении 3:1:1.
Посевную дозу бифидобактерий вносят в объеме 5,0-7,0% от объема питательной среды с титром бифидобактерий не менее 109 КОЕ/мл, культивирование осуществляют в течение времени, достаточного для получения концентрата бифидобактерий с биологическим титром не менее (0,8-1,0) 1011 КОЕ/мл и кислотностью 100-120°Т, а защитную среду вносят в готовый жидкий продукт в количестве не менее 40% от массы последнего.
Защитная среда для сушки биомассы концентрата или закваски на основе консорциума бифидобактерий содержит натрий хлористый, пептон, сахарозу, желатин, аскорбиновую кислоту при следующем содержании компонентов (мас.%):
| Натрий хлористый | 0,4-0,5 |
| Пептон | 0,7-1,0 |
| Сахароза | 6,0-7,0 |
| Желатин | 0,4-0,5 |
| Аскорбиновая кислота | 0,07-0,1 |
| Молоко с СОМО 12,0% | остальное до 100% |
Перед сушкой после внесения защитной среды проводят коррекцию кислотности биомассы бифидобактерий растворами NaOH до рН 6,5-7,0.
После сушки продукта он имеет титр бифидобактерий не менее 1010 КОЕ/мл.
Сведения о депонировании штаммов консорциума бифидобактерий:
Штамм Bifidobacterium bifidum 8-3. Получен из коллекции ВКПМ. Выделен из фекалий человека и селектирован в УКРНИИМЯСОМОЛПРОМе. Депонирован во ВНИИгенетика в коллекции ВКПМ под №Ас-1248. Предназначен для производства ферментированных молочных продуктов. Копия удостоверения прилагается.
Штамм Bifidobacterium longum Я3 (депонирован во ВНИИгенетика в коллекции ВКПМ под №Ас-1252). Предназначен для производства ферментированных молочных продуктов. Копия удостоверения прилагается.
Штамм Bifidobacterium adolescentis B1 (депонирован во ВНИИгенетика в коллекции ВКПМ под №Ас-1243). Предназначен для производства ферментированных молочных продуктов. Копия удостоверения прилагается
Контроль культур бифидобактерий проводится согласно МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов».
Культурально-морфологические признаки консорциума: Клетки палочковидные, V-образные раздвоения на одном или двух концах встречаются крайне редко, неподвижные, в мазке образуют скопления грамположительные.
В гидролизатно-молочной агаризованной среде образуют колонии в виде четких гвоздиков длиной 5-10 мм, толщиной 1-2 мм. В жидких питательных средах растет по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Пигмента не образует.
Физиолого-биохимические признаки: облигатный анаэроб, оптимальная температура 37,5°С, рН 7,2-7,4. Ферментирует лактозу с образованием уксусной и молочной кислот, закисляя среду выращивания до рН 4,0. Арабинозу, ксилозу, маннозу, целлобиозу, инулин, маннит, сорбит, салицин не ферментирует.
Штаммы консорциума сбраживают молоко без ростовых факторов с образованием к 16-18 ч стабильного сгустка с кислотностью - 140-160°Т, которая практически не увеличивается даже в течение 5-и месячного срока хранения. Газообразующая способность, каталазообразующая способность, разжижение желатины отсутствует.
Кислотообразующая активность: к 24 ч - 100° Тернера, к 72 ч - 150-200° Тернера (на печеночной среде), на гидролизатно-молочной среде - до 160° Тернера и 250° Тернера соответственно.
Максимальный титр бифидобактерий консорциума в обезжиренном натуральном молоке (с 8% СОМ) с ростовыми факторами: гидролизатом молока и дрожжевым экстрактом через 24 ч роста составляет - (2-5)·1011, через 90-120 дней хранения в этой среде - (2-5)×1010 КОЕ/мл. Таким образом, заявляемый консорциум имеет больший срок хранения по сравнению с консорциумом-прототипом в 1,5 раза.
Антагонистические свойства консорциума
Консорциум проявляет активность по отношению к шигеллам Зонне, Флекснера, энтеропатогенным кишечным палочкам, стафилококкам.
Антагонистическая активность консорциума (таблица 1) штаммов бифидобактерий была изучена методом in vitro при совместном выращивании с патогенными тест-штаммами по зоне задержки роста тест-микробов методом штриховых кодов
| Таблица 1 | ||||
| Данные ингибирования роста патогенных и условно-патогенных микроорганизмов | ||||
| Зоны задержки роста тест-культур (мм) | ||||
| Sh. sonne | Salmonella typhim | Escherichia colli | Candida albicans | |
| Заявляемый консорциум | 21,0-23,0 | 19,0-20,0 | 22,0-24,0 | 19,0-20,0 |
| Консорциум-прототип | 10-11 | 9-10 | 10-11 | 9-10 |
Исследование консорциума на устойчивость к антибиотикам
Заявляемый консорциум устойчив к канамицину, мономицину. Это позволяет легко выделять бифидобактерии из смеси их с лактобактериями. Чувствителен к антибиотикам пенициллинового ряда, кефзолу, гентамицину. Способность заявляемого консорциума штаммов бифидобактерий наращивать густую микробную массу в относительно бедной питательной среде, сквашивать молоко в короткие сроки, проявлять специфическую активность делает возможным его использование в приготовлении кисломолочных, неферментированных пищевых продуктов и сухих бактерийных препаратов (см. табл.2).
| Таблица 2 | |||
| Сравнительная чувствительность консорциума к антибиотикам | |||
| Антибиотики | МИК-ПДК (мкг/мг) | Заявляемый консорциум штаммов | Консорциум-прототип |
| Ампициллин | 4-16 | 0.5 | 0.5 |
| Карбенициллин | 128 | 0,5 | 0.5 |
| Оксациллин | 2 | 1 | 1 |
| Кефзол | 4-32 | 4 | 4 |
| Стрептомицин | 4-64 | 8 | 8 |
| Канамицин | 4-64 | 256 | 105 |
| Мономицин | 4-64 | 256 | 120 |
| Тентамицин | 4-16 | 16 | 16 |
| Левомицетин | 8-32 | 32 | 32 |
| Тетрациклин | 2-16 | 1 | 1 |
| Примечания: | |||
| МИК - минимальная ингибирующая концентрация | |||
| ПДК - предельно допустимая концентрация в крови |
Таким образом, консорциум штаммов менее чувствителен к антибиотикам канамицин и мономицин (чем, например, известный консорциум-прототип штаммов бифидобактерий) и продукты на его основе могут применяться одновременно с этими антибиотиками при лечении ими, предотвращая таким образом развитие дисбактериоза от антибиотикотерапии.
Пример 1. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для приготовления жидкого концентрата бифидобактерий (ЖКБ).
1-й пассаж
Жидкие культуры штаммов: B. bifidum 8-3, B. longum Я3 и B. adolescentis B1 в количестве по 1 мл вносят в 2 пробирки с 9 мл в печеночной среде выращивания (для каждого штамма отдельно). Наращивают штаммы в пробирках 15-18 ч при 37,5-38°С.
2-й пассаж
Выросшую культуру каждого из штаммов раздельно в объеме 5-10% вносят в 0,5 л ростовой молочной производственной среды культивирования и культивируют 16-18 ч при 37,5-38°С - для получения лабораторных заквасок каждого штамма.
Затем биомассу заквасок каждого из штаммов смешивают в соотношении (3:1:1 соответственно): 6 частей биомассы бифидобактерий B. bifldum 8-3, 2 части биомассы B. Longum Я3 и 2 части биомассы B. adolescentis В1.
3-й пассаж.
Полученную смешанную биомассу в объеме 5-10% вносят в производственную молочную среду, в объеме 10 литров и культивируют термостатным способом в стеклянных бутылях при 37,5-38°С, без регулирования процесса по кислотности в течение 15-18 ч до образования сгустка. Получают производственную закваску консорциума в жидком виде.
Содержание пробиотических микроорганизмов в полученной биомассе симбиотической ассоциации составляет lg 9-10 в 1 мл.
Способ получения жидкого концентрата или закваски бифидобактерий
Способ включает введение посевной дозы производственной закваски заявляемого консорциума культур бифидобактерий с титром не менее 109 КОЕ/мл в питательную среду в количестве 5,0-7,0.% от ее объема. Питательная среда содержит, мас.%:
| Гидролизат обрата молока (лактопептон) | 5,0-7,0 |
| Цистеин солянокислый | 0,001-0,005 |
| Автолизат пекарских дрожжей | 2,0-4,0 |
| Обрат молока (основа) с СОМО не более 8% | остальное до 100% |
Содержание суммарного аминного азота в среде составляет 500 мг%. Гидролизат белков молока обеспечивает обогащение питательной среды смесью высокомолекулярными и низкомолекулярными пептидами, которые являются эффективными стимуляторами роста бифидобактерий. Дрожжевой экстракт содержит витамины группы В и стимулирующие факторы роста бифидобактерий, а также высокое содержание аминного азота, обеспечивающего наиболее благоприятные условия роста для бифидобактерий. Аминный азот является источником готовых к ассимиляции азотистых нуклеотидных оснований, необходимых для синтеза нуклеиновых кислот бифидобактерий при их интенсивном размножении. Компонентами, обеспечивающими редуцирующие свойства заявляемой среды, являются, в основном, цистеин, а также аминокислоты глутамин и аспарагин, обладающие антиоксидантными свойствами, которыми также богат дрожжевой экстракт.
Биомассу бифидобактерий выращивают в объеме 10 литров и культивируют термостатным способом в стеклянных бутылях при 37,5-38°С, без регулирования процесса по кислотности в течение 15-18 ч до образования сгустка. Жидкий концентрат или закваска бифидобактерий имеет биологический титр не менее (0,8-1,0) 1011 КОЕ/мл и кислотностью 100-120°Т. Полученный продукт охлаждают и фасуют в тару.
Жидкий продукт может быть использован в качестве биологически активной добавки для самостоятельного применения или для обогащения им кисломолочных продуктов с целью коррекции дисбактериозов, а также для получения сухой биомассы методом лиофильной и распылительной сушки.
Пример 2. Способ сушки жидкого концентрата или закваски бифидобактерий
В жидкий продукт, полученный в соответствии с примером 1, вводят защитную среду в количестве не менее 40% от массы последнего. Защитная среда для сушки биомассы концентрата или закваски на основе консорциума бифидобактерий содержит, мас.%:
| Натрий хлористый | 0,4-0,5 |
| Пептон | 0,7-1,0 |
| Сахароза | 6,0-7,0 |
| Желатин | 0,4-0,5 |
| Аскорбиновая кислота | 0,07-0,1 |
| Молоко с СОМО 12,0% | остальное до 100% |
После внесения защитной среды проводят коррекцию кислотности биомассы бифидобактерий раствором NaOH до рН 6,5-7,0. Полученную суспензию разливают по 2 мл в ампулы или по 5 мл во флаконы, замораживают при t= - 40-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. После сушки продукта он имеет титр живых клеток бифидобактерий не менее 1010-1011 КОЕ/мл и содержит количество влаги - не более 0,1-0,2%.
Кроме того, жидкий продукт можно сушить в стандартной распылительной сушилке в стерильных условиях. Для этого жидкий продукт подвергают распылительной сушке в восходящем потоке подогретого до 50-55°С воздуха. Полученный сухой препарат содержит не менее 1010-1011 живых клеток бифидобактерий в 1 г. Остаточная влажность - 1-2%.
Пример 3. Использование жидкой закваски для приготовления симбиотических кисломолочных продуктов лечебно-функционального питания
Жидкую закваску консорциума, приготовленную по примеру 1 (после 3-го пассажа), в объеме 0,2-0,3% вносят в пастеризованное молоко вместе с кефирной или ацидофильной закваской в объемах заквасок, предусмотренных для приготовления бифидокефира или бифацила, перемешивают и культивируют 4-18 ч до образования сгустка, после чего продукт охлаждают и фасуют в потребительскую тару. В результате получают лечебно-профилактические кисломолочные продукы с содержанием полезной бифидофлоры не менее lg 7-8 в 1 мл симбиотического продукта.
Полученные продукты обладают выраженным иммунокоррегирующим действием.
Пример 4. Использование сухой закваски прямого внесения для приготовления симбиотических кисломолочных продуктов лечебно-функционального питания
Сухую закваску консорциума, в количестве 0,005-0,05 мас.% непосредственно вносят в пастеризованное молоко вместе с кефирной или ацидофильной закваской в объемах заквасок, предусмотренных для приготовления бифидокефира или бифацила, перемешивают и культивируют 4-18 ч до образования сгустка, после чего продукт охлаждают и фасуют в потребительскую тару. В результате получают лечебно-профилактические кисломолочные продукты с содержанием живых бифидобактерий не менее lg 6-7 в 1 мл симбиотического продукта.
Полученные продукты обладают выраженным иммунокоррегирующим действием.
Исследование аминокислотного состава жидкого концентрата бифидобактерий, приготовленного на основе заявляемого консорциума
В таблице 3 приведены данные аминокислотного анализа.
| Таблица 3 | |||
| Содержание аминокислот в ЖКБ на основе консорциума бифидобактерий | |||
| Наименование аминокислоты НЕЗАМЕНИМЫЕ | Содержание (мг/л) | Наименование аминокислоты ЗАМЕНИМЫЕ | Содержание (мг/л) |
| Треонин | 13.11 | Серин | 7.72 |
| Валин | 34.67 | Глутаминовая кислота | 14.88 |
| Метионин | 12.87 | Пролин | 27.47 |
| Изолейцин | 15.51 | Глицин | 2.71 |
| Лейцин | 56.20 | Аланин | 27.37 |
| Фенилаланин | 38.0 | Цистеин | 0 |
| Триптофан | - | Тирозин | 51.10 |
| Лизин | 32.38 | Гистидин | 45.04 |
| Глутамин | 6.83 | Аспарагиновая кислота | 0.4 |
| Аргинин | 32.13 | ||
| ИТОГО | 50% (209.57) | ИТОГО | 208.82 |
Таким образом, жидкий концентрат бифидобактерий, приготовленный на основе заявляемого консорциума, имеет высокую биологическую ценность и является поставщиком незаменимых аминокислот, которые находятся в легкоусвояемой форме. Богатый набор важнейших незаменимых аминокислот, таких как: валин - 8.3%, лейцин - 13.4%, лизин - 7.7%, а также метионин - 3.1%, имеет важное физиологическое значение, поскольку недостаток валина приводит к расстройству координации движений, недостаток лейцина вызывает изменения в почках и щитовидной железе, недостаток лизина приводит к нарушению процессов кровообразования.
В жидком концентрате бифидобактерий содержание аргинина удалось повысить до 7,7% против 2,0% в жидком концентрате бифидобактерий, полученном на основе консорциума-прототипа и технологии его получения. Повышение содержания аргинина очень важно, поскольку данная аминокислота способствует стимуляции иммунной системы организма, кроме того, она обладает антиоксидантными свойствами, что позволяет увеличивать срок хранения продукта.
Исследование длительности хранения консорциума штаммов бифидобактерий в жидком концентрате бифидобактерий
Исследована длительность хранения консорциума штаммов бифидобактерий в жидком концентрате бифидобактерий (таблица 4). Значительный срок (до 3-х месяцев) хранения жидкого концентрата бифидобактерий с титром не ниже 1010 КОЕ/мл связан с обеспечением начальной кислотности препарата консорциума бифидобактерий не более (140-145)°Т, получением исходного титра бифидобактерий (не ниже 1011 КОЕ/мл).
| Таблица 4 | |||||
| Данные по сохранности заявляемого консорциума бифидобактерий в ЖКБ | |||||
| № пробы ЖКБ на основе заявляемого консорциума | Кислотность Т° начальная | Кислотность Т° конечная 5 мес | Титр, начальный КОЕ/мл | Титр через 4 мес КОЕ/мл | Титр через 5 мес КОЕ/мл |
| 1 | 147 | 160 | 1×1011 | 1×1010 | 3×108 |
| 2 | 120 | - | 4×1010 | 8×109 | 1×108 |
| 3 | 125 | 165 | 1×1011 | 1×1010 | 2×108 |
| 4 | 150 | 170 | 8×1010 | 4×1010 | 7×108 |
Исследование активности сухого концентрата бифидобактерий, полученного на основе заявляемого консорциума (см. табл.5).
Исследованию подвергают сухой концентрат бифидобактерий, полученный в соответствии с примером 2.
| Таблица 5 | ||||||||
| Данные исследования активности консорциума бифидобактерий в сухом концентрате, полученном распылительным или лиофильном способами | ||||||||
| Производственная закваска | Жидкий концентрат бифидобактерий на основе консорциума (ЖКБ) | |||||||
| Наименование консорц. | Виды штаммов в консорциуме | Соотношение штаммов, % | Время культивирования, часы | Кислотность Т° | Титр ЖКБ перед сушкой | Титр (КОЕ/мл) ЖКБ после процесса высушивания | Влажность | |
| Лиофильной | Распылительной | |||||||
| Прототип | 1) B. bifidum БАГ 791 | 80 | 22 | 146 | 2×1010 | 8×109 | 1×108 | 1-2% |
| 2) B. longum (ДВА-13) | 10 | |||||||
| 3) B. bifidum 8-3 | 10 | |||||||
| Заявляемый | 1) B. bif. 8-3 | 60 | 22 | 146 | 3×1010 | 3×1010 | 1×1010 | 0,1% |
| 2) B. longum -Я3 | ||||||||
| 20 | ||||||||
| 3) B. adolescentis B1 | ||||||||
| 20 |
После лиофильной сушки ЖКБ (таблица 5) активность сухого ЖКБ на основе заявляемого консорциума выше в пять раз, а после распылительной сушки - на два порядка по сравнению с прототипом.
Промышленная применимость. Приведенные примеры показывают, что заявляемый консорциум штаммов 3-х видов бифидобактерий активно размножается в относительно бедных питательных средах с накоплением производственной биомассы в короткие сроки культивирования. Продукт обладает специфической активностью. Консорциум штаммов можно рекомендовать в составе заквасок для приготовления жидкого или сухого концентрата бифидобактерий, кисломолочных лечебно-диетических продуктов и бактерийных препаратов. Используемые питательные среды и реактивы общедоступны. Средства и приемы для получения и выращивания биомассы консорциума, а также средства и приемы, обеспечивающие сушку жидкого концентрата или закваски, традиционно используются в медицинской промышленности и биотехнологии.
1. Способ получения жидкого или сухого концентрата или закваски бифидобактерий, включающий введение посевной дозы культуры бифидобактерий в питательную среду, содержащую основу питательной среды с добавками цистеина соляно-кислого, автолизата или экстракта пекарских дрожжей и выращивание биомассы бифидобактерий при (37-38)±0,5°С до получения концентрата бифидобактерий, охлаждение и фасовку готового жидкого продукта или введение в жидкий продукт защитной среды и лиофильное высушивание его в стерильных условиях, отличающийся тем, что в питательную среду дополнительно вводят лактопептон, в качестве основы питательной среды используют обезжиренное молоко с содержанием сухого обезжиренного молочного остатка не более 8% при следующем соотношении компонентов питательной среды, мас.%:
| лактопептон | 5,0-7,0 |
| цистеин соляно-кислый | 0,001-0,005 |
| автолизат или экстракт | |
| пекарских дрожжей | 2,0-4,0 |
| обезжиренное молоко с содержанием сухого | |
| обезжиренного молочного | |
| остатка не более 8% | остальное до 100%, |
а в качестве посевной дозы бифидобактерий используют консорциум штаммов бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 8-3, Bifidobacterium longum Я3, Bifidobacterium adolescentis B1.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в посевной дозе штаммы Bifidobacterium bifidum 8-3, Bifidobacterium longum Я3, Bifidobacterium adolescentis В1 находятся в соотношении 3:1:1.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что посевную дозу бифидобактерий вносят в объеме 5,0-7,0% от объема питательной среды с титром бифидобактерий не менее 109 КОЕ/мл, культивирование осуществляют в течение времени, достаточного для получения концентрата бифидобактерий с биологическим титром не менее (0,8-1,0) 1011 КОЕ/мл и кислотностью 100-120°Т, а защитную среду вносят в готовый жидкий продукт в количестве не менее 40% от массы последнего.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что защитная среда для сушки биомассы концентрата или закваски на основе консорциума бифидобактерий содержит натрий хлористый, пептон, сахарозу, желатин, аскорбиновую кислоту при следующем содержании компонентов, мас.%:
| натрий хлористый | 0,4-0,5 |
| пептон | 0,7-1,0 |
| сахароза | 6,0-7,0 |
| желатин | 0,4-0,5 |
| аскорбиновая кислота | 0,07-0,1 |
| молоко с СОМО 12,0% | остальное до 100% |
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед сушкой после внесения защитной среды проводят коррекцию кислотности биомассы бифидобактерий раствором NaOH до pH 6,5-7,0.
