Штамм бактерий bacillus megaterium, мобилизующий фосфор и кремний из объектов литосферы и устойчивый к полигексаметиленгуанидину

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и геохимии. Штамм Bacillus megaterium var. phosphaticum BKM В-2357 Д способен выщелачивать фосфор и кремний из объектов литосферы и устойчив к полигексаметиленгуанидину. Штамм перспективен для получения бактериального препарата, повышающего приживаемость в почве и урожайность сельскохозяйственных культур, для рекультивации техногенно загрязненных земель, а также в биотехнологических работах в области геохимии. 15 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, геохимии и касается получения нового штамма микроорганизмов, способного выщелачивать фосфор и кремний из объектов литосферы и устойчивого к полигексаметиленгуанидину.

В настоящее время основными критериями систем земледелия остаются экономическая эффективность и экологическая безопасность. Выращивание высокоурожайных сортов требует высоких доз минеральных удобрений и пестицидов, что приводит к истощению плодородия почв и снижению качества сельхозпродукции. Среди современных технологий биологизации земледелия, наряду с районированием новых сортов, севооборотами, агротехникой применяются различные биопрепараты, активизирующие растительно-микробные взаимодействия. Использование живых микроорганизмов позволяет сократить геологический круговорот за счет их способности переводить метаболически неактивные, связанные химические элементы в доступные для растений формы.

Доказано, что фосфор находится в почве в составе химических соединений, усвоение которых недоступно растениям. Такого неподвижного, необменного фосфора в почве содержится очень много, до 5-6 тонн в каждом гектаре. Бактерии Bacillus megaterium var. phosphaticum живут в почве, разлагают органические вещества и высвобождают содержащийся в них фосфор, переводя его в растворимые соли фосфорной кислоты. Образуемые в дальнейшем соединения фосфорной кислоты становятся доступны для усвоения растениями. Установлено, что использование бактериальных препаратов особенно эффективно на плодородных почвах. Поскольку таких почв на нашей планете осталось немного, особенно важно выделить штаммы микроорганизмов, потенциально активные в мобилизации биогенных элементов не только из органической, но и из неорганической составляющей почвы, например вторичных минералов.

Анализ минеральных фосфорных удобрений показал, что простой суперфосфат содержит лишь 18-21% Р₂O₅, 80% остатка - это примеси, пятую часть которых составляет алюминий, а также сопутствующие элементы - загрязнители: фтор, железо и редкоземельные элементы гафний, цирконий, скандий. Двойной суперфосфат содержит около 45-46% Р₂O₅, на загрязнения приходится около 50%. В России фосфорные удобрения изготавливаются из природных оливиновых бокситов на Ангарском алюминиевом заводе, поэтому после их применения на полях остается большое количество алюминия. Этот элемент опасен не только для людей, но и для развития растений его повышенное количество нежелательно, поскольку алюминий вреден тем, что он сильно влияет на гидролитическую кислотность почвы, то есть связывает катионы калия, натрия и других жизненно необходимых растению элементов. Внесение живых бактерий Bacillus megaterium var. phosphaticum в "зафосфаченные" почвы позволяет в 2-3 раза снизить норму расхода минеральных фосфорных удобрений и повысить качество сельхозпродукции.

Существует проблема обогащения почв сельскохозяйственного назначения органо-минеральными компонентами для поддержания устойчивого земледелия. Данная задача решается различными способами, положительно сказывающимися на плодородии почв, в том числе внесением в нее удобрительных смесей. По ряду причин, обусловленных физико-химическими и бактериальными свойствами почв, мобилизация растениями полезных компонентов бывает малоэффективной. В настоящее время резко сокращено применение фосфорных удобрений, поэтому перспективной технологией считается использование кремнийсодержащих соединений для мобилизации запасов почвенных фосфатов. Установлено, что именно изменение фосфатного режима почв после внесения кремниевых удобрений является одной из причин увеличения урожайности растений. Известно, что минеральный каркас из соединений кремния разрушается под действием силикатных бактерий за счет слизей и фермента силиказы [1].

С начала прошлого века разработаны и внедряются агробиотехнологии с использованием бактериальных препаратов, улучшающих взаимоотношения почвы и растений [2]. Установлено, что главным моментом в механизме действия микробных препаратов является их приуроченность к корневым зонам растений, а также способность мобилизовать полезные компоненты не только из удобрительных комплексов, вносимых в почву, но и из самой почвы [3]. В этой связи актуальным является вопрос о выявлении и селекции микроорганизмов, обладающих высокой активностью в процессах мобилизации биогенных элементов для усиленного развития растений.

Известно, что основой получения любого бактериального препарата является классическая схема асептического биотехнологического производства. Однако при этом культивирование каждого конкретного штамма предполагает выполнение специфических условий, необходимых для максимального проявления штаммом его промышленно значимых свойств. Особенно важно сохранить свойства исходной матричной культуры после допустимого периода хранения препарата. В современном промышленном биотехнологическом производстве многие биопрепараты изготавливаются на основе различных штаммов бактерий рода Bacillus sp. Одним из существенных негативных эффектов подобного производства является фаголиз бактериальной культуры, особенно Bacillus megaterium. Фаголиз - эффект разрушения (лизирования) бактериальных клеток под действием вирусов бактерий - бактериофагов, которые могут попасть в клетку снаружи, либо могут активироваться в определенных условиях в виде провируса, встроенного в бактериальный геном. Основными способами борьбы с лизогенными вирусами бактерий являются поддержание строжайшей стерильности исходной матричной культуры для производства препарата и селекция устойчивых к бактериофагам штаммов.

Известны штаммы Bacillus megaterium var. phosphaticum de Вагу (В200-B208), обладающие свойством мобилизовать фосфор. Штаммы - аналоги находятся на хранении в ВКПМ (Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов). Данные об этих штаммах получены из «Каталога штаммов Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов, 1997 г.»

Наиболее близким к полученному является штамм Bacillus megaterium de Bary 1884 [4], обладающий свойством мобилизовать фосфор. Недостатками известного штамма являются его ограниченная функциональная способность - выщелачивать фосфор и большая подверженность лизису колоний на скошенной агаризованной среде.

При создании изобретения ставилась задача - получение культурального штамма, обладающего фосфат- и кремний мобилизующими свойствами из объектов литосферы и устойчивого к полигексаметиленгуанидину.

Указанная задача решается новым штаммом Bacillus megaterium var. phosphaticum ВКМВ-2357Д, который получен из лабораторного штамма Bacillus megaterium путем его постепенной адаптации к полигексаметиленгуанидину.

Полученный штамм Bacillus megaterium var. phosphaticum Pl-04 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина (г.Москва) 24.05.2005 под №ВКМ В-2357Д. Штамм депонирован с научным описанием и паспортом.

Полученный штамм Bacillus megaterium var. phosphaticum P1-04 ВКМ В-2357Д селекционирован из лабораторного штамма Bacillus megaterium по оригинальной методике путем постепенной адаптации к полигексаметиленгуанидину. Адаптация проведена путем многостадийного повышения концентрации с целенаправленным инкубированием клеток.

Полигексаметиленгуанидин относится к классу биоцидных катионных полиэлектролитов, который помимо флокуляции обладает высокой и разнообразной биоцидной активностью: бактерицидной, фунгицидной, вирулицидной, алгицидной. Спекулирующее действие полигексаметиленгуанидина обеспечивается присутствием в каждом его элементарном звене катионной гуанидиновой группировки, этот же фактор делает его и высокоэффективным биоцидом. В промышленности его используют в качестве флокулянта для одновременной очистки и обеззараживания природных и сточных вод, а также для предотвращения биообрастаний промышленной теплообменной аппаратуры, водоводов и другого оборудования, контактирующего с водой. Соли полигексаметиленгуанидина - гидрохлорид и фосфат являются флокулирующими дезинфицирующими средствами с комплексным неокисляющим действием, не летучи, стабильны, малотоксичны, устойчивы и безопасны при хранении, не разрушают и не обесцвечивают материалов, их водные растворы бесцветны и не имеют запаха, взрыво- и пожаробезопасны, не накапливаются в организме.

Штамм Bacillus megaterium var. phosphaticum P1-04 ВКМ В-2357Д характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки

Родословная штамма: группа грамположительных палочек и кокков, образующих эндоспоры; Род Bacillus; вид Bacillus megaterium.

Клетки штамма - прямые палочки с закругленными концами. Располагаются одиночно или в парах, иногда образуют цепочки. Размер клеток: 0,5-1,5 мкм. При окраске по Граму (кристаллическим фиолетовым и последующей обработкой раствором Люголя, спиртом и фуксином) получена положительная реакция.

Спорообразование: образуют сферические эндоспоры. Тип деления: простой.

Подвижность: клетки подвижные. Пигментация колоний/ биомассы.

На мясопептонном агаре (МПА) клетки штамма образуют колонии грязно-белого цвета. Не выделяют пигменты в питательную среду.

Мясопептонный агар (31°С, 48 час) образует резко окаймленные колонии грязновато-белого цвета. Старые колонии желтеют.

Физиолого-биохимические признаки

Аэроб.

Оптимальная температура роста +31°С

Оптимум pH 7,0

Образует кислоту из глюкозы

Каталазоположительный.

Мобилизует фосфор ортофосфатов кальция со скоростью 5,1 мг/л.

Хорошо хранится в стеклянных пробирках на скошенной агаризованной среде (на МПА с добавлением MnSO₄ - 10 мг/л)при температуре +4°С.

Штамм не является зоопатогенным или фитопатогенным, не представляет опасности по другим причинам.

Дополнительные свойства: для штамма P1-04 Bacillus megaterium var. phosphaticum характерна повышенная способность к продуцированию индолилуксусной кислоты и гиббереллинов.

Штамм ВКПМ №ВКМ В-2357Д идентифицирован по "Определителю" Берги (1974) как штамм вида BACILLUS MEGATERIUM.

Штамм Bacillus megaterium var. phosphaticum P1-04 №ВКМ В-2357Д отличается от штамма-прототипа Bacillus megaterium de Bary 1884 способностью к выщелачиванию фосфора и кремния из неорганического субстрата и устойчивостью к полигексаметиленгуанидину.

Изобретение поясняется следующим конкретным примером использования штамма Bacillus megaterium var. phosphaticum P1-04 №ВКМ В-2357Д.

Пример

Для выращивания посевной культуры Bacillus megaterium var. phosphaticum Pl-04 №ВКМВ-2357Д в пробирках используют питательную среду следующего состава:

Натрий хлористый - 5 г;

Пептон - 5-10 г;

Мясной экстракт - 3 г;

Марганец сернокислый - 10 мг;

Агар - 15 г;

Полигексаметиленгуанидин - 1,5 г;

Вода водопроводная - до 1000 мл.

Для культивирования штамма в жидкой культуре используют питательную среду следующего состава:

-Питательный бульон для культивирования микроорганизмов сухой pH 7,2±0,2 - 15.5 г.

-Марганец сернокислый - 10 мг.

-Вода водопроводная - 1000 мл, оптимальный диапазон pH: 7,0-7,5.

Оптимальная температура роста плюс 31±1°С. Рекомендуется выращивать штамм методом глубинного культивирования в колбах на качалке при 200 об/мин.

Штамм следует хранить в пробирках на скошенной агаризованной среде при температуре плюс 5°С. Добавление полигексаметиленгуанидина в питательную агаризованную среду снижает лизогенность культуры и увеличивает срок хранения без пересева на новые скошенные агаризованные среды до 6 месяцев.

Все соли растворяют в небольшом количестве воды на магнитной мешалке, добавляют пептон и мясной экстракт. Затем раствор доводят до заданного объема водопроводной водой. Сразу доводят pH среды 40% раствором едкого натра или 10% раствором соляной кислоты до значения pH 6,0-6,2, чтобы после стерилизации величина pH была равной 6,5-7,5. После доведения pH в среду добавляют агар и расплавляют его на водяной бане. Агаризованную среду разливают в пробирки и стерилизуют в автоклаве 40 минут при 1,0 ат.

Поскольку штамм Bacillus megaterium var. phosphaticum P1-04 №ВКМ В-2357Д получен впервые и ранее не использовался в промышленной технологии, можно сделать вывод о соответствии его критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Далее приведены результаты исследований - изучения микробиологических характеристик и мобилизации кремния и фосфора бактериями штамма Bacillus megaterium var. phosphaticum Pl-04 №ВКМВ-2357Д

Цель испытаний:

1.Определить чистоту и численность бактерий в жидкой культуре Bacillus megaterium var. phosphaticum, штамм P1-04 №ВКМ В-2357Д.

2.Определить присутствие патогенной микрофлоры.

3. Определить потенциальную геохимическую активность бактерий Bacillus megaterium var. phosphaticum, штамм P1-04 №ВКМ В-2357Д в мобилизации кремния и фосфора из объектов литосферы.

Материалы и методы исследований

Бактериальная культура Bacillus megaterium var. phosphaticum штамм P1-04 №ВКМ В-2357Д.

Определение потенциальной активности бактерий в мобилизации кремния и фосфора проводили по методике РД 52.24.3.-82 (SiO₂) и ГОСТ 18309-72 (PO₄)², используя материально-техническую базу проблемной научно-исследовательской лаборатории гидрогеохимии Института геологии и нефтегазового дела Томского политехнического университета, зарегистрированной в Системе аналитических лабораторий Госстандарта России, №РОСС RU. 0001.511901 от 12.08.2002 г. Определение концентрации фосфора и кремния выполнено с использованием масс-спектрометрического метода с индуктивно-связанной плазмой (ICP-MS) на приборах фирмы Perkin-Elmer ELAN-DRC-e по методике №480-Х МПР РФ «Методика определения элементного состава природных и питьевых вод методом ICP-MS» (Москва, 2002), разработанной Институтом проблем технологии микроэлектроники и особо чистых материалов РАН и аттестованной в соответствии с ГОСТ 8.563-96 и ОСТ 41-08-205-99.

Было поставлено три серии опытов, в качестве тест-объекта выщелачивания использована фосфоритная руда "Джерой" Сардаринского месторождения в Узбекистане установленного состава, %: P₂O₅ - 13,6; СаО - 44,75; MgO - 1,05; CO₂ - 20,88; Fe₂О₃ - 3,03;. SiO₂ - 2,7; С_орг - 0,11. Методика исследований состояла в проведении серий опытных и контрольных вариантов по следующей схеме.

Опытные варианты. Навеска стерильной среды заливалась стерильной питательной средой, содержащей 0,1 мл суточной суспензии, полученной из соответствующего бактериального препарата путем его асептического разведения в 100 раз [5]. Соотношение твердого и жидкого компонентов составляло 1:3. Контрольные варианты ставили в соответствии с опытными образцами, но без добавления бактерий.

Общий срок опыта составил 30 суток, которые были разделены на повторности в 5, 10 и 30 дней. По истечении каждого временного этапа растворы сливали в чистую стерильную посуду с целью определения количества бактерий к данному сроку, а также количества выщелоченных кремния и фосфора.

Питательная среда для разведения и учета бактерий имела следующий состав: NH₄Cl - 0,2 г; MgSO₄·7Н₂O - 0,1 г; NaCl - 0,2 г; MnSO₄ - следы; FeSO₄·7Н₂O - следы; глюкоза - 20 г; pH - 7,0; вода дистиллированная - 1000 мл.

Стерилизацию фосфоритной породы, измельченной до размера 0,2 мм, осуществляли в экспериментальных колбах в жарочном шкафу при температуре 130°С ежедневно по 20 минут в течение трех дней. Остальные необходимые материалы, а также питательные среды стерилизовали в автоклаве при температуре 120°С в течение 30 минут. Раствор глюкозы стерилизовали при 100°С по 10 минут ежедневно в течение трех дней.

Подсчет бактерий в экспериментальных растворах осуществляли в конце каждого временного отрезка методом 10-кратных разведений с последующим высевом на агаризованную среду соответствующего состава но не содержащую фосфорных соединений как в жидкой, так и в твердой формах [6].

Результаты

Патогенной микрофлоры (среда Эндо) во всех исследуемых препаратах не обнаружено. Проверка препаратов на численность живых клеток и чистоту культуры осуществлялась путем подсчета клеток в суспензии методом разведений и высева в чашках Петри на питательную среду типа мясопептонного агара.

Все проверенные культуры были чистыми, колонии однородные. Визуально выглядела как непрозрачная суспензия песочного цвета. Бактерии Bacillus megaterium var. phosphaticum образуют выпуклые колонии: мелкие, с ровными краями, круглые, матовые, гладкие, без слизи, непрозрачные, желтовато-белые. Общий титр - 1,8×10⁹/мл. Результаты по изучению мобилизации фосфора и кремния бактериями Bacillus megaterium var. phosphaticum, штамм P1-04 представлены в таблице 1. Выщелачивание (мобилизация) кремния (SiO₂) и фосфора (PO₄)² из фосфоритной руды с участием бактерий

На фигурах 1-12 изображены электронные микрофотографии поверхности измельченной руды (горной породы) после 30-дневной инкубации с бактериями или без них при различных увеличениях. Для сравнения опытных и контрольных вариантов выбраны крупные однотипные округлые частицы.

Фигура 1. Контрольный вариант после инкубации с питательной средой без бактерий. Увеличение х300.

Фигура 2. Контрольный вариант после инкубации с питательной средой без бактерий. Фрагмент поверхности частицы Фиг.1. Увеличение ×2000.

Фигура 3. Крупная частица руды после 30-дневной инкубации с комплексом бактерий естественного биоценоза, выделенных из серой лесной почвы Томской области. Увеличение х300.

Фигура 4. Фрагмент крупной частицы руды после 30-дневной инкубации с комплексом бактерий естественного биоценоза, выделенных из серой лесной почвы Томской области. Увеличение ×5000.

Фигура 5. Опытный вариант после 30-дневной инкубации с Bacillus megaterium P1-04 №ВКМ В-2357. Поверхность гладкой частицы руды на Фиг.6. Увеличение ×5000.

Фигура 6. Опытный вариант после 30-дневной инкубации с Bacillus megaterium P1-04 №ВКМ В-2357. Гладкая частица руды. Увеличение х300.

Фигура 7. Опытный вариант после 30-дневной инкубации с Bacillus megaterium P1-04 №ВКМ В-2357. "Изъеденная" после выщелачивания элементов бактериями поверхность частицы руды. Увеличение ×2000.

Фигура 8. Опытный вариант после 30-дневной инкубации с Bacillus megaterium P1-04 №ВКМ В-2357. "Изъеденная" после выщелачивания элементов бактериями поверхность частицы руды. Увеличение ×2000.

Фигура 9. Опытный вариант после 30-дневной инкубации с Bacillus megaterium P1-04 №ВКМ В-2357. Рыхлая частица руды после разрушающего действия бактерий. Увеличение ×500.

Фигура 10. Опытный вариант после 30-дневной инкубации с Bacillus megaterium P1-04 №ВКМ В-2357. Фрагмент поверхности рыхлой частицы руды Фиг.9. Увеличение ×2000.

Фигура 11. Опытный вариант после 30-дневной инкубации с Bacillus megaterium P1-04 №ВКМ В-2357. Рыхлая частица руды после разрушающего действия бактерий. Увеличение ×2000.

Фигура 12. Опытный вариант после 30-дневной инкубации с Bacillus megaterium P1-04 №ВКМ В-2357. Фрагмент поверхности рыхлой частицы руды Фиг.11 Увеличение ×5000.

Обсуждение результатов

В настоящее время известно, что перевод фосфора и кремния в растворимое состояние из почвы осуществляется различными группами микроорганизмов. Это явление нашло практическое применение в виде изготовления биопрепаратов, способствующих мобилизации вышеуказанных элементов из твердого состояния в растворимую форму, которая является доступной для культурных растений. Таким образом, с помощью бактерий возможно повышение плодородия почв.

Данные таблицы 1 показывают, что бактерии полученного штамма способны к мобилизации кремния и фосфора из объектов литосферы, в данном случае из фосфоритной породы. Анализируя количественные характеристики эксперимента, обращает внимание наличие большой потенциальной активности полученного штамма бактерий в мобилизации кремния и фосфора, что ясно из большого количества выщелоченных элементов в расчете на одну бактериальную клетку.

Следует отметить, что полученный штамм проявляет активность по отношению к трудноразлагаемому объекту литосферы - горной породе. Геохимическая активность бактерий полученного штамма будет более интенсивной и весомой по отношению к почвам.

Далее приведены результаты электронно-микроскопического исследования поверхности руды после 30-дневного инкубирования с бактериями Bacillus megaterium var. Phosphaticum, штамм P1-04 №ВКМ В-2357Д.

Параллельно с определением скорости выщелачивания кремния и фосфора проводили электронно-микроскопические исследования породы после 30-дневного инкубирования с бактериями Bacillus megaterium var. phosphaticum, штамм P1-04 №ВКМ В-2357Д. Для этого объектный столик покрывали тонким слоем клея, на него насыпали исследуемый порошок. После высыхания клея объектный столик помещали в вакуумный пост JEE-4B, где на поверхность наносили тонкий (20-30 нм) слой серебра методом термического напыления в вакууме. Полученный препарат исследовали в растровой приставке ASID-4D ("JEOL", Япония) к электронному микроскопу "JEM-100 СХП" ("JEOL", Япония) при ускоряющем напряжении 20 кВ.

Для сравнительного изучения прямого разрушающего действия бактерий на неорганический субстрат руду "Джерой" были выбраны однотипные частицы руды округлой формы. Контролем служила питательная среда без бактерий (Фиг.1 -2), в качестве естественного биоценоза использовали комплекс бактерий, выделенных из серой лесной почвы Томской области (Фиг.3-4), опытным вариантом служили бактерии штамма Bacillus megateriun var. phosphaticum P1-04 №ВКМ В-2357Д.

(Фиг.5-12). Здесь на большом увеличении отчетливо видно, что именно в варианте с чистой культурой бактерий (опыт) поверхность частиц неравномерная, "изъеденная" и более рыхлая, что является последствием выщелачивания элементов питания для бактерий. Полученные снимки свидетельствуют о прямом биогенном воздействии данного штамма Bacillus megaterium var. phosphaticum на минеральный субстрат.

Было проведено изучение влияния кислотности среды на содержание фосфора в культуральной среде штамма Bacillus megaterium var. phosphaticum Pl-04 №BKMB-2357Д.

В ходе опыта измеряли концентрацию биомасс исследуемых микроорганизмов, содержание фосфатов и pH культуральных сред. Каждый вариант проводили в трех аналитических повторностях. Контролем служила жидкая среда, на которой выращивались микроорганизмы.

Была проанализирована зависимость между кислотностью среды и концентрацией PO₄ ^3-. Показано, что с увеличением кислотности увеличивается содержание фосфора в культуральной среде, что соответствует литературным данным (Фиг.13).

На Фиг.13 приведена зависимость между pH среды штамма Bacillus megaterium var. phosphaticum P1-04 №BKM B-2357Д и концентрацией фосфора, (PO₄ ^3-), перешедшего в раствор. График отображает отрицательную линейную зависимость указанных параметров.

Контролем в экспериментах служила среда, на которой выращивались исследуемые микроорганизмы. При измерении количества фосфора в контроле обнаружено, что его содержание с течением времени увеличивается.

На Фиг.14 представлены результаты измерения кислотности в опытных вариантах.

Где

Вас pH - изменение кислотности культуральной жидкости штамма

Bacillus megaterium var. Phosphaticum P1-04 №ВКМ В-2357Д

Nb pH - изменение кислотности культуральной жидкости штамма

Pseudomonas sp. В - 6798

Is pH - изменение кислотности культуральной жидкости

фосфатмобилизующим изолятом ВК 2134Д

К pH - в контроле

К pH - изменение кислотности в контроле

На основании исследований можно сделать вывод о том, что во всех вариантах происходит смещение pH в кислую сторону.

Снижение pH было отмечено так же и в контроле. Наряду с изменением кислотности в контроле происходил переход в раствор иона РО₄ ^3- (Фиг.14). Анализ состава среды показал, что в среде происходит естественное ее подкисление, так как в качестве источника азота используется аммоний хлорид (NH₄Cl). Это соль слабого основания и сильной кислоты, поэтому в растворе происходит гидролиз:

NH₄Cl→NH₄ ⁺+Cl^-

Подкисление среды в контроле, в свою очередь, влияет на растворение Са₃PO₄. По-видимому, подобный эффект возможен и в почвах при применении удобрений, содержащих аммоний.

В литературе встречаются данные о том, что бактерии Bacillus megaterium являются К-стратегами с инертным, постепенным ростом и "сглаженной" динамикой [6]. Это свойство штамма Bacillus megaterium var. Phosphaticum BKM В-2357 Д подтверждается данными проведенных опытов.

Во избежание эффекта мобилизации фосфата за счет гидролиза была произведена замена источника азота с хлорид аммония на мочевину (0,43 г/л). Во второй серии экспериментов в качестве контрольного штамма бактерий был взят штамм кишечной палочки Escherichia coli В-899, который не является почвенным микроорганизмом.

После замены состава среды было обнаружено, что в ходе эксперимента в вариантах со всеми изученными штаммами pH среды, так же как и в первом случае, подкисляется (Фиг.15). Накопление фосфатов в среде с мочевиной под действием штамма Bacillus megaterium P1-04 №BKM B-2357Д и контроля, где:

Вас pH - изменение кислотности культуральной жидкости штамма Bacillus megaterium var. phosphaticum P1-04 №ВКМ В-2357Д.

Nb pH - изменение кислотности культуральной жидкости штамма

Pseudomonas sp. В-6798

Is pH - изменение кислотности культуральной жидкости

фосфатмобилизующим изолятом ВК 2134Д

Ec pH - изменение кислотности культуральной жидкости штаммом

кишечной палочки В-889

К pH - изменение кислотности в контроле

Анализ содержания растворимых фосфатов в ходе опыта показал следующее: содержание фосфата в контроле не увеличивается, так как не происходит изменения pH в кислую сторону, то есть нет естественного подкисления среды. Первые 12 часов содержание растворимого фосфата в контрольном варианте резко снизилось, затем в течение следующих 12 часов концентрация фосфата возросла и составила 0,12 мг РО₄ ^3-/л. На фиг.3 видно, что концентрация растворимого фосфата в контроле на вторые сутки стала снижаться, этот процесс продолжался в течение следующих 24 часов. Концентрация фосфата в контроле составила 0,02 мг РО₄ ^3-/л.

В варианте со штаммом Bacillus megaterium P1-04 №ВКМ В-2357Д накопление фосфата в первые 12 часов возрастало, концентрация РО₄ ^3- составила 0,42 мг Р/л по сравнению с исходным значением 0,32 мг Р/л. Следующие 10 часов концентрация фосфата стала незначительно снижаться до 0,38 мг Р/л. Снижение растворимого фосфата связано с потреблением его самими бактериями Bacillus megaterium, так как в это время происходит рост бактерий. На вторые сутки эксперимента концентрация фосфата стала увеличиваться и составила 0,42 мг/л, этот процесс продолжался в течение остального времени.

Следует подчеркнуть, что во второй серии экспериментов была исключена возможность влияния низкой кислотности среды на растворение фосфата кальция. На основании полученных данных сделан вывод о том, что накопление фосфата в культуральной жидкости Bacillus megaterium var. phosphaticum P1-04 №ВКМ В-2357Д полностью связано с процессами жизнедеятельности самих бактерий изучаемого штамма.

Селекция микроорганизмов Bacillus megaterium var. phosphaticum, устойчивых к полигексаметиленгуанидину

Устойчивость к полигексаметиленгуанидину определяли в ходе посева бактерий штамма Bacillus megaterium var. phosphaticum P1-04 №ВКМ В-2357Д на скошенный мясопептонный агар. Для этого в незастывший мясопептонный агар добавляли полигексаметиленгуанидин следующих концентраций: 50 мкл на 10 мл среды; 100 мкл на 10 мл среды и 150 мкл на 10 мл среды. В качестве исходного раствора использовали промышленный 20% водный раствор полигексаметиленгуанидина гидрохлорида, представляющий собой прозрачную жидкость от бесцветного до желтого цвета (pH раствора 7-7-9,5). Затем давали агару застыть и засевали скошенный мясопептонный агар бактериями с помощью микробиологической петли. В таблице 2 представлены результаты пяти независимых экспериментов, каждый из которых проведен в семи аналитических повторностях.

Пробирки помещали в термостат при температуре +31°С. Через двое суток отмечали рост колоний Bacillus megaterium var. phosphaticum на косяках соответственно добавленному к питательной среде количеству полигексаметиленгуанидина. Выросшие колонии визуально выглядели как складчатые, округлые, крупные, 6-7 мм в диаметре, беловато-кремовые образования. При повторных пересевах косяки, содержащие 100 мкл полигексаметиленгуанидина на 10 мл среды, наблюдали пигментацию колоний в виде окрашивания до розовато-кремового цвета.

Было отмечено, что при хранении скошенной агаризованной среды с культурой Bacillus megaterium var. phosphaticum P1-04 №ВКМ В-2357Д в холодильнике при температуре +5°C происходит лизирование бактериальных колоний через 4-8 недели. Однако в тех пробирках, где к мясопептонному агару был добавлен полигексаметиленгуанидин, колонии Bacillus megaterium var. phosphaticum P1-04 №ВКМ В-2357Д сохраняли характерные для данного штамма признаки - исходную форму, цвет и консистенцию. Жизнеспособность выращенных с добавлением полигексаметиленгуанидина бактерий сохранялась в течение шести месяцев, что в три раза превышает срок, который обычно необходим для пересева колоний Bacillus megaterium с целью поддержания морфофизиологических свойств определенной исходной чистой культуры бактерий.

Таким образом, был сделан вывод о целесообразности использования полигексаметиленгуанидина в качестве стабилизатора, позволяющего сохранять и поддерживать длительное время функционально активную жизнеспособность и заявленные свойства полученного штамма Bacillus megaterium var. phosphaticum P1-04 №ВКМ В-2357Д.

Добавка полигексаметиленгуанидина в агаризованные питательные среды, используемые для культивирования штамма, увеличивает в три раза продолжительность хранения маточных культур, способствует созданию условий для длительного и стабильного поддержания его промышленно значимых свойств, снизить трудоемкость процесса и повысить его экономическую эффективность.

Также полученный штамм Bacillus megaterium var. phosphaticum P1-04 №ВКМ В-2357Д является перспективным для получения бактериального препарата, повышающего приживаемость в почве и урожайность сельскохозяйственных культур, для рекультивации техногенно загрязненных земель, а также в биотехнологических работах в области геохимии.

Источники информации

1. Самсонова Н.Е. // Агрохимия. 2005. №8.

2. Degens B.P. et al. // Soil Biol. Biochem. 2000. V.32. №2.

3. Аристовская Т.В. Микроорганизмы как компонент биогеоценоза. М.: Наука, 1984.

4. В-847: INMI, VKM В-847; VNIISHM, 49. Received as: "Bacillus megaterium subsp. phosphaticum" Menkina 1950 (прототип).

5. Белканова Н.П., Каравайко Г.Н., Авакян З.А. // Микробиология. 1985. №1.

6. Калинина К.В., Кожевин П.А., Звягинцев Д.Г // Микробиология. 1999, т.68, №2.

Штамм бактерий Bacillus megaterium var. phosphaticum BKM В-2357Д, мобилизующий фосфор и кремний из объектов литосферы и устойчивый к полигексаметиленгуанидину.