Суппозитории индуктора интерферона

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, медицине и фармакологии, конкретно к разработке противовирусных препаратов в виде суппозиториев. В состав предлагаемого суппозитория наряду с консистентно-образующей основой (липофильной, гидрофильной или дифильной) и стабилизатором, выбранным из хлоргексидина биглюконата, нипагина и натрий карбоксиметилцеллюлозы, в качестве индуктора эндогенного интерферона природного происхождения вводится комплекс натриевых солей одно- и двуспиральных РНК из киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Количественное содержание указанных ингредиентов на суппозиторий массой 1,0 г составляет: комплекс натриевых солей одно- и двуспиральных РНК из киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae - 50-150 мкг; стабилизатор - 10-30 мкг; вспомогательные вещества - остальное. Предложенный состав позволяет расширить номенклатуру лечебных противовирусных препаратов - индукторов неспецифической резистентности организма, обладающих сниженной токсичностью при сохранении эффективности. 5 з.п. ф-лы, 3 табл.

 

Изобретение относится к медицине и фармакологии, конкретно к области разработки противовирусных препаратов в виде суппозиториев.

Эффективными средствами профилактики и терапии вирусных инфекций являются индукторы интерферона, стимулирующие выработку в организме человека и животных эндогенного интерферона. При этом необходим поиск средств, которые не только обладают интерферониндуцирующей активностью, но и могут быть просты в изготовлении и применении. Перспективными в этом отношении являются препараты, которые не требуют парентерального или инъекционного введения, в частности - суппозитории. Кроме того, обращение к такого рода лекарственной форме позволило бы расширить возможности терапевтического использования индукторов интерферона за счет белее четкого дозированного высвобождения активного начала при исключении нежелательных побочных эффектов - раздражение, воспаление и т.д. Следует также отметить, что отказ от инъекционного способа введения противовирусных препаратов исключает опасность инфицирования гепатитами В и С, а также ВИЧ-инфекцией; кроме того, введение противовирусной композиции в форме свечи обеспечивает быстрое поступление препарата в кровь и органы, богатые макрофагоцитарными и лимфоидными элементами.

К наиболее активным индукторам интерферона относятся синтетические полирибонуклеотиды и двуспиральные РНК (дсРНК) природного происхождения [1].

Известно использование в качестве индуктора интерферона двутяжевого комплекса полирибоуридиловой (поли-rU) и полирибоадениловой (поли-rA) кислот, который под названием "Полудан" используется при вирусных заболеваниях глаз [2]. Однако препараты индукторов интерферона на основе синтетических полирибонуклеотидов наряду с высокой эффективностью обладают токсичностью [3] и проявляют мутагенную активность [4].

На российском фармацевтическом рынке присутствует мазь "Ларифан" (производство Латвии) - высокополимерный индуктор интерферона природного происхождения, представляющий собой двуспиральную РНК фага f2 [5]. Недостатком препарата является то, что его активную основу составляет фаговая нуклеиновая кислота, представляющая потенциальную опасность для человека в связи с обнаружением массовой контаминации фагами вирусных вакцин.

Интерферон индуцирующих препаратов на основе двуспиральных РНК, выполненных в виде суппозитория, известно очень не много. Так американская фирма "Merck" Co. Inc. запатентовала мазь, которая предназначена для лечения герпетических поражений глаза и содержит синтетический индуктор интерферона - поли-rI - поли-rC, а также носитель: простые или сложные эфиры целлюлозы, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, карбоксивиниловые эфиры и полиэтиленгликоль [6]. В этом же изобретении описаны вагинальные и ректальные суппозитории на основе указанной полирибонуклеотидной композиции, которые имеют обычный размер и форму и содержат примерно от 2,5 до 250 мг индуктора интерферона на 1 г композиции.

Наиболее близким препаратом индуктора интерферона является лекарственная форма двутяжевого комплекса поли-rU* поли-rA* (200-250 мкг), выполненная в виде ректальной свечи, которая помимо индуктора интерферона содержит еще гиалуроновую кислоту (10-20 мг) в качестве иммуномодулятора и витамины С и Е (30-40 мг) в массовом соотношении 1:1 в качестве антиоксидантов в основе [7, прототип]. Недостатком препарата является то, что в качестве индуктора интерферона используется двутяжевый комплекс поли-rU* - поли-rA*, который имеет синтетическое происхождение и, как указывалось выше, проявляет токсичность и обладает мутагенной активностью.

Технической задачей изобретения является расширение номенклатуры противовирусных препаратов - индукторов неспецифической резистентности организма, путем создания лекарственной формы индуктора интерферона - суппозитория на основе дсРНК природного происхождения, обладающего сниженной токсичностью.

Поставленная задача решается путем введения в состав суппозитория наряду с консистентно-образующей основой (липофильной, гидрофильной или дифильной) и стабилизатором в качестве индуктора интерферона природного происхождения комплекса натриевых солей одно- и двуспиральных РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

В настоящее время известен препарат индуктора интерферона для наружного применения (мазь), обладающий выраженной противовирусной активностью, биологически активной частью которого является комплекс натриевых солей одно- и двуспиральных РНК киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae [8]. Этот препарат обладает высокой эффективностью, сниженной токсичностью и хорошей переносимостью.

Предлагаемый в данной разработке суппозиторий включают в качестве индуктора интерферона природного происхождения комплекс натриевых солей одно- и двуспиральных РНК киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, стабилизатор и вспомогательные вещества. Количественное содержание указанных ингредиентов на суппозиторий массой 1,0 г составляет:

Комплекс натриевых солей одно- и двуспиральных РНК
киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae	50-150 мкг
Стабилизатор	10-30 мкг
Вспомогательные вещества	остальное.

В качестве стабилизатора - бактериостатика (стабилизатора микробиологической чистоты) предлагаемый суппозиторий на основе комплекса натриевых солей одно- и двуспиральных РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae может содержать нипагин или хлоргексидина биглюконат и/или производное метилцеллюлозы (NaКМЦ).

Суппозитории в качестве вспомогательных веществ содержат жировую основу, включающую твердый кондитерский жир или кулинарный жир и эмульгатор Т-2, поверхностно-активное вещество (ПАВ) Твин - 80, являющееся также солюбилизатором высокополимерной дс РНК; при этом основа может дополнительно содержать масло какао до 0,15 г в 1 г смеси и парафин до 0,10 г, а содержание ПАВ Твин - 80 составляет 0,03 г в 1 г смеси.

В качестве консистентно-образующей основы может быть использована дифильная основа, содержащая полиэтиленоксиды, твердый пищевой жир и ПАВ Твин - 80, или гидрофильная основа, содержащая полиэтиленоксиды и глицерин (в количестве 0,05 г на 1 г смеси).

В качестве антиоксиданта средство может дополнительно содержать витамин Е в количестве 0,0001-0,0005 г в 1 г смеси.

Консистентно-образующие композиции готовят с использованием вспомогательных веществ, разрешенных к медицинскому применению.

Кроме того, средство дополнительно может содержать диметилсульфоксид для увеличения проницаемости слизистых оболочек в количестве 0,0005-0,0025 г в 1 г смеси.

Сочетание индуктора интерферона в виде комплекса натриевых солей одно- и двуспиральных РНК природного происхождения (из киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae) со стабилизаторами - бактериостатиками (стабилизаторами микробиологической чистоты) и антиоксидантами в суппозиторной консистентно-образующей основе позволяет расширить номенклатуру лечебных противовирусных препаратов - индукторов неспецифической резистентности организма, обладающих сниженной токсичностью, при сохранении эффективности.

Изучена стабильность физических свойств и активность предложенных суппозиториев индукторов интерферона. Проведены доклинические испытания на лабораторных животных. Исследованы токсичность, пирогенность, местнораздражающее действие, фармакокинетика, фагоцитозстимулирующая активность суппозиториев на модели генитального герпеса морских свинок, а также интерфе-рониндуцирующая активность препарата.

Результаты исследований на модели лабораторных животных показывают, что препарат суппозитория эффективен, безвреден, малотоксичен, не обладает пирогенностью и местно-раздражающим действием.

Новая лекарственная форма - суппозиторий индуктора интерферона использован в клинической практике при лечении хламидиоза. Показана его выраженная интерферониндуцирующая активность при эффективных лечебных свойствах.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.

Пример 1. Получение суппозиториев с липофильной консистентно-образующей основой.

Для получения суппозиториев массой 1 г в расплавленную основу - кулинарный жир, парафин, масло какао и эмульгатор Т-2 вводят ПАВ твин-80 в качестве солюбилизатора высокополимерной дс РНК, диметилсульфоксид для усиления проницаемости слизистых оболочек и хлоргексидина биглюконат в качестве стабилизатора микробиологической чистоты. Затем в полученную смесь добавляют раствор комплекса натриевых солей одно- и двуспиральных РНК Saccharomyces cerevisiae. Смесь выливают в формы для суппозиториев, охлаждают и упаковывают.

Указанные компоненты берут в следующем соотношении в 1 г смеси:

Комплекс натриевых солей одно- и двуспиральных РНК	50-150 мкг
Масло какао	0-15 мг
Парафин	10 мг
Твин-80	3 мг
Вода очищенная	5 мг
Эмульгатор Т-2	3 мг
Диметилсульфоксид	100 мкг
Хлоргексидина биглюконат	250 мкг
Кулинарный жир	остальное

Пример 2. Получение суппозиториев с гидрофильной консистентно-образующей основой.

Для получения суппозиториев массой 1 г в консистентно-образующую основу - расплав полиэтиленоксидов 1500 и 400 вводят глицерин, диметилсульфоксид для усиления проницаемости слизистых оболочек и хлоргексидина биглюконат в качестве стабилизатора микробиологической чистоты. В подготовленную основу вводят раствор комплекса натриевых солей, одно- и двуспиральных РНК Saccharomyces cerevisiae. Смесь выливают в формы для суппозиториев, охлаждают и упаковывают.

Указанные компоненты берут в следующем соотношении в 1 г смеси:

Комплекс натриевых солей одно- и двуспиральных РНК	50-150 мкг
Глицерин	5 мг
Вода очищенная	5 мг
Полиэтиленоксид 1500	20 мг
Хлоргексидина биглюконат	250 мкг
Полиэтиленоксид 400	остальное

Пример 3. Получение суппозиториев с дифильной консистентно-образующей основой.

Для получения суппозиториев массой 1 г в расплавленную гидрофильную основу - расплав полиэтиленоксидов 1500 и 400, добавляют раствор комплекса натриевых солей одно- и двуспиральных РНК Saccharomyces cerevisiae. Затем вводят расплавленную гидрофобную основу (ТКЖ), ПАВ твин-80, эмульгатор Т-2, диметилсульфоксид, антиоксидант Е-2 и нипагин в качестве стабилизатора микробиологической чистоты (бактериостатика). Смесь выливают в формы для суппозиториев, охлаждают и упаковывают.

Указанные компоненты берут в следующем соотношении в 1 г смеси:

Комплекс натриевых солей одно- и двуспиральных РНК	50-150 мкг
ТКЖ	240 мг
ПЭГ 400	350 мг
ПЭГ 1500	25 мг
Твин-80	4 мг
Эмульгатор Т-2	2 мг
Диметилсульфоксид	100 мкг
Нипагин	10 мкг
Антиоксидант Е-2	10-20 мкг
Вода очищенная	Остальное

Состав суппозиториев с дифильной консистентно-образующей основой может быть и несколько иным.

Для получения суппозиториев массой 1 г в гидрофильную основу - раствор NaКМЦ добавляют раствор комплекса натриевых солей одно- и двуспиральных РНК Saccharomyces cerevisiae. Затем вводят глицерин и расплавленную гидрофобную основу (ТКЖ), эмульгатор Т-2, нипагин в качестве стабилизатора микробиологической чистоты (бактериостатика). Смесь вымешивают до получения однородной консистенции при температуре 37°, выливают в формы для суппозиториев, охлаждают и упаковывают.

Указанные компоненты берут в следующем соотношении в 1 г смеси:

Комплекс натриевых солей одно- и двуспиральных РНК	50-150 мкг
NaКМЦ	300 мкг
Глицерин	150 мкг
Эмульгатор Т-2	3 мг
Нипагин	10 мкг
ТКЖ	240 мг
Вода очищенная	Остальное

Пример 4. Определение биологической активности суппозиториев на основе комплекса натриевых солей одно- и двуспиральных РНК.

Известно, что вирусы герпеса способны угнетать функциональную активность макрофагов и синтез интерферона, что сказывается на неспособности элиминировать вирус из организма. Очевидно, что при отборе перспективных антигерпетических средств следует оценивать их влияние на фагоциты.

Биологическую активность заявляемых суппозиториев оценивают по фагоцитарной активности на монослойной культуре перитонеальных макрофагов мышей ICR, самцов. Образцы суппозиториев, приготовленных согласно примерам 1-3, т.е. с различными консистентно-образующими основами и вспомогательными веществами, вводят мышам ректально в дозе 70 мг/мышь. В контрольных группах используют основу суппозиториев, которую вводят аналогичным образом.

Исследование фагоцитоза макрофагов проводят через 24 ч после введения суппозиториев.

Макрофаги выделяют из перитониальной полости мышей путем вымывания средой Хенкса с гепарином (5 ед. акт. на мл среды). Культивирование и все последующие операции проводят в среде Хенкса с 3% сыворотки крупного рогатого скота (КРС). Суспензию макрофагов (1×10⁶ в мл) высевают на покровное стекло, помещенное в бюкс диаметром 35 мм.

Инкубацию проводят 1 ч при температуре 37°С. Для исследования фагоцитоза монослой отмывают от непрекрепившихся клеток и в качестве объекта фагоцитоза наносят 20 мкл суспензии опсонизированных эритроцитов барана (ЭБ) из расчета 20 эритроцитов на макрофаг. Монослой макрофагов продолжают инкубировать в течение 45 мин, отмывают, высушивают, готовят для микроскопического анализа.

Оценку фагоцитоза проводят путем пересчета перитонеальных макрофагов, поглотивших эритроциты барана.

Фагоцитарную активность (ФА) оценивают от общего числа макрофагов. Достоверность различий (Р) данных, полученных в опыте и контроле, оценивают с помощью критерия Стьюдента при обсчете 250 клеток на монослой. Процент стимуляции определяют по отношению показателей опытных групп животных к контролю по формуле:

Результаты этих экспериментов представлены в Таблице 1.

Данные представлены для суппозиториев, приготовленных по примеру 1.

Таблица 1.
Фагоцитоз стимулирующая активность суппозиториев
Условия опыта	Показатели фагоцитоза
Препарат, Серия	Время исследования	ФА, (%)	Фагоцитозстимулирующая активность	Достоверность различий (Р)
Суппозитории с 020900 Основа суппозиториев	24 ч	22,3±3,2 15,8±1,8	141,1%	0,05
Суппозитории с 010301 Основа суппозиториев	24 ч	27,8±1,8 12,75±2,6	218,0%	0,05
Суппозитории с 091100 Основа суппозиториев	24 ч	27,1±2,2 11.3±0,9	239,8%	0,05

Проведенное исследование показывает, что патентуемые суппозитории обладают выраженной способностью активировать фагоцитоз. Это указывает на лечебное антигерпетическое действие препарата.

Пример 4. Исследование интерферониндуцирующей активности суппозиториев на животной модели.

Уровень интерферониндуцирующей активности суппозиториев, содержащих комплекс натриевых солей одно- и двуспиральных РНК в липофильной основе, оценивают в сыворотке крови мышей, полученной через сутки после интравагинального введения суппозиториев животным (опытные) или их основы (контрольные), а также у интактной группы животных. Образцы крови объемом 0,8-1,0 мл забирают в стерильные пробирки; сыворотку получают центрифугированием при 2,5 тыс.об/мин, переносят по 0,3-0,5 мл в стерильные пробирки и замораживают при - 20°С до анализа.

Титр интерферона определяют микрометодом в 96-луночных полистироловых планшетах с плоским дном. О наличии интерферона судят по подавлению цитопатического действия тест-вируса в культуре клеток мышиных фибробластов линии L-929. В качестве тест-вируса был использован вирус энцефаломиокардита (ЕМС) штамм "Колумбия" в дозе 100 ЦПД₅₀ 0,1 мл. За титр сывороточного интерферона принимают величину его наибольшего разведения, при котором наблюдается защита 50% клеток культуры от 100 ЦПД₅₀ тест-вируса. Полученные данные, представленные в Таблице 2, показывают, что предложенные препараты суппозиториев обладают ярко выраженной интерферониндуцирующей активностью.

Таблица 2
Интерферониндуцирующая активность суппозиториев на животной модели
Группа животных Препарат суппозитория	№ сывороток	Титр интерферона
Индивидуальное значение	M±m
1. Контрольные живо тные.	1 2	<1:10 1:10
Липофильная основа.	3	1:10
	4	<1:10	<1:10
	5	<1:10
	6	<1:10
2. Опытные животные	7	1:10
Лечебные свечи	8	1:10
	9	1:80
	10	1:20	23,3±11,5
	11	1:10
	12	1:10
3. Интактные животные	13	<1:10
	14	<1:10
	15	<1:10	<1:10
	16	<1:10
	17	<1:10
	18	<1:10

Пример 5. Исследование индукции интерферона при использовании суппозиториев в клинической практике.

Свечами, полученными согласно Примеру 1, в условиях стационара лечили больных (мужчины) по поводу хламидиоза. Курс лечения составил 10 свечей по 1 суппозиторию ежедневно утром или вечером. Контроль титра интерферона проводили в сыворотке крови пациентов до лечения, во время приема суппозиториев на 2, 3, 5 день и через 10 дней после окончания курса терапии. Интерферониндуцирующую активность определяли титрованием сывороток крови, полученных от больных, в 96-луночных планшетах в перевиваемой линии клеток легкого эмбриона человека Л-68 по стандартной методике в среде Игла-МЕМ с добавлением 7% сыворотки КРС. Полученные данные представлены в Таблице 3.

Таблица 3.
Интерферониндуцирующая активность суппозиториев
Пациент	Титр интерферона в сыворотке крови до лечения	Титр интерферона в сыворотке крови во время лечения	Титр интерферона в сыворотке крови после лечения
Больной К., 31 год	1:8	1:32	1:2
Больной Ч., 57 лет	1:2	1: 16	1:2
Больной Б., 26 лет	1:2	1:16	1:4

Данные лабораторных исследований свидетельствуют о том, что ректальные свечи активно индуцируют эндогенный интерферон in vivo, оказывая системное действие. Показано, что в ответ на проводимое лечение (курс из 10 свечей) уровень сывороточного интерферона возрастает через 48 часов в среднем в 2-4 раза.

У всех больных отмечалось значительное уменьшение или полное исчезновение воспалительных процессов.

Таким образом, полученные данные показали высокую эффективность применения индуктора интерферона на основе комплекса натриевых солей одно- и двуспиральных РНК природного происхождения в виде свечи.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ф.И.Ершов, В.М.Жданов, в кн. "Индукторы интерферона", М., 1982 г., стр.7-18.

2. М.Д.Машковский, в кн. "Лекарственные средства", М.: Медицина, 1988 г., т.2, стр.386-387.

3. В.И.Масычева, И.Г.Надолинная // Острая токсичность и кумулятивные свойства полирибонуклеотидных комплексов поли И: поли Ц и поли Г: поли Ц // Фармакол. токсикол. // 1981 г., №3, стр.353-358.

4. В.Г.Матвеева // Исследование мутагенной активности синтетических индукторов интерферона на лабораторных мышах // Вопр. вирусологии // 1982 г., №5, стр.540-543.

5. Ф.И.Ершов, Н.П.Чижов, З.Б.Тазулахова // Противовирусные средства (справочник) // С-Петербург, 1993 г., УДК 616.988-085.281.8, стр.68-70.

6. Патент США №4283393, кл. А61К 31/70, опубл. 11.08.1981 г.

7. Патент РФ №2162687, кл. А61К 9/02, опубл. БИ №4 за 2001 г.

8. Патент РФ №2123339, кл. А61К 31/70, опубл. БИ №35 за 1998 г.

1. Суппозиторий на основе индуктора интерферона, характеризующийся тем, что содержит в качестве индуктора интерферона комплекс натриевых солей одно-двуспиральных РНК природного происхождения из киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, стабилизатор, выбранный из группы хлоргексидина биглюконат, нипагин, натрий карбоксиметилцеллюлоза, а в качестве вспомогательных веществ гидрофильную, или липофильную, или дифильную основы при следующем соотношении ингредиентов на 1 свечу массой 1,0 г:

Комплекс натриевых солей одно- и двуспиральных РНК киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae	50-150 мкг
Стабилизатор, выбранный из группы хлоргексидина биглюконат, нипагин, натрий карбоксиметилцеллюлоза	10-3 0 мкг
Вспомогательные вещества	Остальное

2. Суппозиторий по п.1, отличающийся тем, что в качестве вспомогательных веществ он содержит жировую основу, включающую твердый кондитерский жир или кулинарный жир и эмульгатор Т-2, и поверхностно-активное вещество (ПАВ) Твин - 80; при этом основа может дополнительно содержать масло какао до 0,15 г в 1 г смеси и парафин до 0,10 г, а содержание эмульгатора Т-2 и ПАВ Твин-80 составляет по 0,03 г в 1 г смеси.

3. Суппозиторий по п.1, отличающийся тем, что он содержит гидрофильную основу, включающую полиэтиленоксиды (1500 и 400) и глицерин в количестве 0,05 г на 1 г смеси.

4. Суппозиторий по п.1, отличающийся тем, что он содержит дифильную основу, включающую полиэтиленоксиды (1500 и 400), твердый пищевой жир и эмульгатор Т-2 и ПАВ Твин-80.

5. Суппозиторий по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что он дополнительно содержит в качестве антиоксиданта витамин Е в количестве 0,0001-0,0005 г в 1 г смеси.

6. Суппозиторий по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что он дополнительно содержит диметилсульфоксид для увеличения проницаемости слизистых оболочек в количестве 0,0005-0,0025 г в 1 г смеси.