Терапевтические связывающие молекулы

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии. Предложены варианты молекулы, связывающей CD45RO и CD45RB, и антитело против CD45RO и CD45RB. В одном из вариантов указанная молекула содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт и включает последовательно расположенные гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3. Молекула представляет собой гуманизированное или моноклональное антитело. CDR1 имеет аминокислотную последовательность NYIIH, CDR2 имеет аминокислотную последовательность YFNPYNHGTKYNEKFKG и CDR3 имеет аминокислотную последовательность SGPYAWFDT. Молекула может дополнительно содержать последовательно расположенные гипервариабельные участки CDR1', CDR2' и CDR3'. CDR1' имеет аминокислотную последовательность RASQNIGTSIQ, CDR2' имеет аминокислотную последовательность SSSESIS и CDR3' имеет аминокислотную последовательность QQSNTWPFT. В другом варианте молекула содержит и тяжелую, и легкую цепи, аминокислотные последовательности которых содержат соответствующие CDR. Раскрыты варианты соответствующих кодирующих полинуклеотидов; экспрессионный вектор и система экспрессии на их основе. Раскрыта клетка-хозяин на основе системы экспрессии. Описано применение молекулы для получения лекарственного средства для лечения аутоиммунных заболеваний, отторжения трансплантата, псориаза, воспалительного заболевания кишечника и аллергий. Раскрыта также фармацевтическая композиция по указанному назначению. Использование изобретения позволяет индуцировать иммуносупрессию, ингибировать Т-клеточный ответ и первичную реакцию лимфоцитов в смешанной культуре (MLR), а также удлинять время выживания мышей с тяжелым комбинированнным иммунодефицитом SCID. 14 н. и 6 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к органическим соединениям, таким как связывающие молекулы изоформ антигена CD45, таким, например, как моноклональные антитела (МАт).

Предпосылки создания изобретения

Один из подходов к лечению различных заболеваний состоит в устранении или инактивации патогенных лейкоцитов и в возможности индукции толерантности к инактивации патологических иммунных реакций.

Отторжение трансплантатов органа, клетки и ткани и различные аутоиммунные заболевания, вероятно, являются, прежде всего, результатом опосредуемого Т-клеткой иммунного ответа, который запускается Т-клетками-хелперами, обладающими способностью распознавать специфические антигены, которые они захватывают, процессируют и представляют Т-клеткам-хелперам с помощью антигенпрезентирующих клеток (АПК), таких как макрофаги и дендритные клетки, в форме комплекса антиген-ГКС (главный комплекс гистосовместимости), т.е. распознавание специфических антигенов приводит к стимуляции Т-клетки-хелпера в отношении производства цитокинов, таких как IL-2, и экспрессии или повышающей регуляции некоторых рецепторов цитокинов и активации других молекул и пролиферации. Некоторые из этих активированных Т-клеток-хелперов могут действовать непосредственно или опосредовано, т.е. помогая эффекторным цитотоксическим Т-клеткам или В-клеткам разрушать клетки или ткани, экспрессирующие отобранный антиген. После прекращения иммунного ответа некоторые зрелые клонально отобранные клетки сохраняются в виде хелперных или цитотоксических Т-клеток памяти, которые циркулируют в организме и быстро распознают антиген, если он появляется вновь. Если антиген, запускающий этот ответ, представляет собой безвредный существующий во внешней среде антиген, то результатом является аллергия, если антиген представляет собой не чужеродный антиген, а аутоантиген, то он может привести к возникновению аутоиммунного заболевания; если антиген представляет собой антиген трансплантированного органа, то в результате может произойти отторжение трансплантата.

Иммунная система предназначена для распознавания «своего» от «не своего, чужого». Это свойство позволяет организму выживать в условиях постоянного заражения патогенами из окружающей среды. Эта специфичность в отношении «чужого» и толерантность в отношении «своего» возникает в процессе развития популяции Т-клеток в тимусе в виде процесса позитивного и негативного отбора, что включает также распознавание и элиминацию аутореактивных Т-клеток. Этот тип толерантности обозначают как основная толерантность. Однако некоторые из указанных аутореактивных клеток избегают этого механизма отбора и являются потенциально опасными с точки зрения развития аутоиммунных заболеваний. Для уничтожения аутореактивных Т-клеток, которые оказались на периферии, иммунная система имеет периферические регуляторные механизмы, обеспечивающие защиту от аутоиммунитета. Эти механизмы являются основой периферической толерантности.

Антигены клеточной поверхности, распознаваемые специфическими МАт, обычно обозначают как CD (дифференцировочный антиген лейкоцитов, выявляемых кластером моноклинальных антител) с им присваивают Международными комитетами по типированию лейкоцитов последовательные номера, а понятие CD45 в контексте настоящего описания относится к общему лейкоцитарному антигену CD45, находящемуся на клеточной поверхности, и МАт к этому антигену обозначено в контексте настоящего изобретения как «антитело к CD45 («анти-CD45»)».

Общий лейкоцитарный антиген (ЛОА) или CD45 представляет собой основной компонент антилимфоцитного глобулина (АЛГ). CD45 принадлежит к семейству трансмембранных тирозинфосфатаз и является как позитивным, так и негативным регулятором клеточной активации в зависимости от взаимодействия с рецептором. Фосфатазная активность CD45, вероятно, необходима для активации киназ Src-семейства, связанных с рецептором антигена В- и Т-лимфоцитов (Trowbridge I.S. и др., Annu Rev Immunol., 12 (1994), cc.85-116). Так, в механизме Т-клеточной активации CD45 имеет решающее значение для сигнала 1, и клетки с дефицитом CD45 обладают выраженными дефектами в отношении опосредуемого TCR (Т-клеточный рецептор) процесса активации.

Антиген CD45 существует в виде различных изоформ, представляющих собой семейство трансмембранных гликопротеинов. Различные изоформы CD45 отличаются по структуре их внеклеточного домена, что происходит в результате различного сплайсинга трех вариабельных экзонов, кодирующих часть внеклеточной области CD45 (Streuli M.F. и др., J. Exp. Med., 166 (1987), cc.1548-1566). Различные изоформы CD45 имеют различные внеклеточные домены, но несут одинаковые трансмембранный и цитоплазматический сегменты, которые имеют два гомологичных высококонсервативных фосфатазных домена, состоящих примерно из 300 остатков. Различные комбинации изоформ по-разному проявляются в субпопуляциях Т- и В-лимфоцитов (Thomas M.L. и др., Immunol. Today, 9 (1988), cc.320-325). Некоторые моноклональные антитела распознают эпитоп, общий для всех различных изоформ, а другие МАт имеют ограниченную (CD45R) специфичность, в зависимости от этого они распознают полученные в результате альтернативного сплайсинга экзоны (А, В или С). Например, моноклональные антитела, распознающие продукт экзона А, обозначают соответственно как CD45RA, антитела, распознающие различные изоформы, содержащие экзон В, были обозначены как CD45RB (Beverley P.C.L и др., Iimnunol. Supp. 1988; I: cc.3-5). Антитела, такие как UCHL1, избирательно связываются с имеющей молекулярную массу 180 кДа изоформой CD45RO (без каких-либо вариабельных экзонов А, В или С), которая, вероятно, ограничена поднабором активированных Т-клеток, клеток памяти и кортикальных тимоцитов и не присутствует на В-клетках (Terry L.A. и др., Immunol., 64 (1988), cc.331-336).

Описание чертежей

На фиг.1 показано, что ингибирование первичной MLR (реакция лимфоцитов в смешанной культуре) «МАт-кандидатом» зависит от дозы в диапазоне от 0,001 до 10 мкг/мл. «Концентрация» обозначает концентрацию «МАт-кандидата».

На фиг.2 показана плазмидная карта экспрессионного вектора HCMV-G1 HuAb-VHQ, содержащего тяжелую цепь, которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:12 (3921-4274), входящую в состав полной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:15 экспрессионного вектора.

На фиг.3 показана плазмидная карта экспрессионного вектора HCMV-G1 HuAb-VHE, содержащего тяжелую цепь, которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:11 (3921-4274), входящую в состав полной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:16 экспрессионного вектора.

На фиг.4 показана плазмидная карта экспрессионного вектора HCMV-K HuAb-humV1, содержащего легкую цепь, которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:14 (3964-4284), входящую в состав нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:17 экспрессионного вектора.

На фиг.5 показана плазмидная карта экспрессионного вектора HCMV-K HuAb-humV2, содержащего легкую цепь, которая имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:13 (3926-4246), входящую в состав нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:18 экспрессионного вектора.

Описание изобретения

При создании изобретения была выявлена связывающая молекула, которая содержит полипептидную последовательность, связывающуюся с CD45RO и CD45RB, далее в контексте настоящего описания обозначенная также как «CD45RO/RB-связывающая молекула». Эти связывающие молекулы по изобретению могут индуцировать иммуносуперессию, ингибировать первичные Т-клеточные ответы и индуцировать Т-клеточную толерантность. Кроме того, связывающие молекулы по изобретению ингибируют первичные реакции лимфоцитов в смешанной культуре (MLR). Клетки, полученные из культур, обработанных СD45RO/RD-связывающими молекулами, предпочтительно дают также ослабленные пролиферативные ответы во вторичных MLR даже при отсутствии СD45RO/RD-связывающих молекул во вторичных MLR. Такие ослабленные пролиферативные ответы во вторичных MLR являются показателем способности связывающих молекул по изобретению индуцировать толерантность. Кроме того, введение in vivo СD45RO/RD-связывающей молекулы мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) с последующим введением человеческих РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови), что сопровождалось реакцией «ксенотрансплантат против хозяина») (ксено-РТПХ), может удлинять время выживания мышей по сравнению с контрольными обработанными мышами, хотя даже у мышей, обработанных СD45RO/KD-связывающей молекулой, в кровотоке все еще могут присутствовать человеческие Т-клетки.

Понятие «СD45RO/RB-связывающая молекула» обозначает любую молекулу, которая обладает способностью специфично связываться с изоформами CD45RB и CD45RO антигена CD45 либо индивидуально, либо в сочетании с другими молекулами. Реакцию связывания можно обнаруживать с помощью стандартных методов (качественный анализ), включая, например, любой тип анализа связывания, такой как прямой или косвенный анализ иммунофлуоресценции в сочетании с флуоресцентной микроскопией или цитофлуориметрический (FACS [флуоресцентный метод разделения клеток лимфоцитов]) анализ, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) или радиоиммуноанализ, с помощью которых можно визуализировать связывание молекулы с клетками, экспрессирующими конкретную изоформу CD45. Кроме того, связывание этой молекулы может привести к изменению функции клеток, экспрессирующих эти изоформы. Например, можно определять ингибирование первичной или вторичной реакции лимфоцитов в смешанной культуре (MLR), в том числе с помощью анализа in vitro или биологического анализа, предназначенного для оценки ингибирования первичной или вторичной MLR, в присутствии СD45RO/RB-связывающей молекулы или без нее и определения различий в ингибировании первичной MLR.

В другом варианте можно также определять функциональные модулирующие действия in vitro путем оценки пролиферации РВМС или Т-клеток или CD4⁺ -Т- клеток, производства цитокинов, изменения экспрессии молекул клеточной поверхности, например, после активации клеток с помощью MLR или после стимуляции специфическим антигеном, таким как токсоид столбняка, или другими антигенами, или с использованием поликлональных стимуляторов, таких как фитогемагглютинин (ФГА) или антитело к CD3 и антитело к CD28 или сложные форболовые эфиры и Са²⁺ - ионофоры. Культуры создают таким же образом, как это описано для MLR, за исключением того, что вместо аллогенных клеток в качестве стимуляторов используют растворимые антигенные или поликлональные стимуляторы, например описанные выше стимуляторы. Т-клеточную пролиферацию предпочтительно оценивают описанным выше методом путем включения ³Н-тимидина.

Производство цитокинов предпочтительно оценивают с помощью сэндвич-ELISA, при осуществлении которого иммобилизованным антителом к цитокину сенсибилизируют поверхность 96-луночного планшета, добавляют супернатанты культур и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре и затем добавляют идентифицирующее антитело, специфическое для конкретного цитокина, а затем вторичное антитело, конъюгированное с ферментом, таким как пероксидаза из хрена, и далее добавляют соответствующий субстрат и с помощью планшетридера оценивают абсорбцию. Изменение молекул клеточной поверхности предпочтительно можно оценивать с помощью прямого или косвенного метода иммунофлуоресценции после окрашивания клеток-мишеней антителами, специфическими для конкретной молекулы клеточной поверхности. Антитело можно либо метить непосредственно с помощью флуорохрома или можно использовать флуоресцентномеченное вторичного антитело, специфическое для первого антитела, и анализировать клетки с помощью цитофлуориметра.

Связывающая молекула по изобретению обладает способностью специфично связываться как с CD45RO, так и с CD45RB («CD45RB/RO-связывающая молекула»).

Предпочтительно связывание связывающей молекулы с изоформами CD45RO характеризуется величиной константы диссоциации (Kd) <20 нМ, предпочтительно Kd<15 нМ или <10 нМ, более предпочтительно Kd<5 нМ.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения связывающая молекула по изобретению связывается с теми изоформами CD45, которые

1) включают эпитопы А и В, но не включают эпитоп С молекулы CD45, и/или

2) включают эпитоп В, но не включают ни эпитоп А, ни эпитоп С молекулы CD45, и/или

3) не включают никакой из эпитопов А, В или С молекулы CD45.

Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения связывающая молекула по изобретению не связывается с изоформами CD45, которые включают

1) все эпитопы А, В и С молекулы CD45, и/или

2) эпитопы В и С, но не включают эпитоп А молекулы CD45.

Согласно другим предпочтительным вариантам осуществления изобретения связывающая молекула по изобретению дополнительно

1) распознает обладающие памятью и in vivo аллоактивированные Т-клетки, и/или

2) связывается со своей мишенью на человеческих Т-клетках, таких, например, как PEER-клетки; причем это связывание предпочтительно характеризуется Kd<15 нМ, более предпочтительно Kd<10 нМ, наиболее предпочтительно Kd<5 нМ, и/или

3) ингибирует in vitro функцию аллореактивной Т-клетки, предпочтительно при этом величина IC₅₀ составляет примерно 5 нМ, более предпочтительно IC₅₀ составляет примерно 1 нМ, наиболее предпочтительно IC₅₀ составляет примерно 0,5 нМ или даже 0,1 нМ, и/или

4) индуцирует толерантность аллоантигенспецифической Т-клетки in vitro и/или

5) предупреждает летальную реакцию «ксеногенный трансплантат против хозяина (РТПХ), вызванную у SCID-мышей инъекцией человеческих РВМС, при введении в эффективном количестве.

Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления изобретения связывающая молекула по изобретению связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело «А6», описанное у Aversa и др., Cellular Immunology 158 (1994), cc.314-328.

Благодаря описанным выше способностям к связыванию и их биологическим активностям такие связывающие молекулы по изобретению особенно пригодны для применения в медицине для лечения и/или профилактики. Болезни, при которых предпочтительно применять связывающие молекулы по изобретению, включают аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантата, псориаз, воспалительное заболевание кишечника и аллергии, как это будет описано ниже.

При создании изобретения было установлено, что молекула, которая содержит полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:1, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:2, представляет собой CD45RO/RB-связывающую молекулу. Также были выявлены гипервариабельные участки CDR1', CDR2' и CDR3' в CD45RO/RB-связывающей молекуле, имеющей последовательность SEQ ID NO:1, где CDR1' имеет аминокислотную последовательность Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln (RASQNIGTSIQ), CDR2' имеет аминокислотную последовательность Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (SSSESIS) и CDR3' имеет аминокислотную последовательность Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (QQSNTWPFT).

Также были выявлены гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3 в CD45RO/RB-связывающей молекуле, имеющей последовательность SEQ ID NO:2, где CDR1 имеет аминокислотную последовательность Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH), CDR2 имеет аминокислотную последовательность Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG) и CDR3 имеет аминокислотную последовательность Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT).

CDR представляют собой 3 специфичные «определяющие комплементарность области», называемые также гипервариабельными участками, которые в основном определяют антигенсвязывающие характеристики. Эти CDR являются частью вариабельной области, например последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 соответственно, причем эти CDR чередуются с каркасными областями (FR), например константными областями SEQ ID NO:1 является частью легкой цепи, например, SEQ ID NO:3, a SEQ ID NO:2 являются частью тяжелой цепи, например, SEQ ID NO:4, в химерном антителе по настоящему изобретению. CDR тяжелой цепи в сочетании с CDR соответствующей легкой цепи в основном формируют антигенсвязывающий центр молекулы по настоящему изобретению. Известно, что вклад вариабельной области легкой цепи в энергетику связывания мал по сравнению с вкладом вариабельной области соответствующей тяжелой цепи и что выделенные вариабельные области тяжелой цепи сами обладают антигенсвязывающей активностью. Такие молекулы обычно обозначают как антитела с одним доменом.

Одним из объектов настоящего изобретения является молекула, включающая по меньшей мере один антигенсвязывающий центр, например CD45RO/RB-связывающая молекула, содержащая последовательно расположенные гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, например, где указанный CDR1 имеет аминокислотную последовательность Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH), указанный CDR2 имеет аминокислотную последовательность Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe -Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG) и указанный CDR3 имеет аминокислотную последовательность Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT), и ее непосредственные эквиваленты.

Следующим объектом настоящего изобретения является молекула, включающая по меньшей мере один антигенсвязывающий центр, например, CD45RO/RB-связывающая молекула, которая включает

а) первый домен, содержащий последовательно расположенные гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, где указанный CDR1 имеет аминокислотную последовательность Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH), указанный CDR2 имеет аминокислотную последовательность Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG) и указанный CDR3 имеет аминокислотную последовательность Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGYAWFDT), и б) второй домен, содержащий последовательно расположенные гипервариабельные участки CDR1', CDR2' и CDR3', например, где CDR1' имеет аминокислотную последовательность Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Gln (RASQNIGTSIQ), CDR2' имеет аминокислотную последовательность Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (SSSESIS) и CDR3' имеет аминокислотную последовательность Gln-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (QQSNTWPFT), и ее непосредственные эквиваленты.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения первый домен, который содержит последовательно расположенные гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, представляет собой тяжелую цепь иммуноглобулина, а второй домен, который содержит последовательно расположенные гипервариабельные участки CDR1', CDR2' и CDR3', представляет собой легкую цепь иммуноглобулина.

Следующим объектом настоящего изобретения является молекула, например CD45RO/RB-связывающая молекула, включающая полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:1 и/или полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:2, предпочтительно несущая в одном домене полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:1, и в другом домене полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:2, например, химерное моноклональное антитело, а еще одним объектом является молекула, например CD45RO/RB-связывающая молекула, содержащая полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:3, и/или полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:4, предпочтительно несущая в одном домене полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:3, и в другом домене полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:4, например, химерное моноклональное антитело.

Когда антигенсвязывающий сайт включает первый и второй домены или полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3 соответственно, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4 соответственно, то они могут быть локализованы на одном и том же полипептиде или предпочтительно каждый домен может быть расположен на различных цепях, например первый домен может представлять собой часть тяжелой цепи, например тяжелой цепи иммуноглобулина или ее фрагмента, а второй домен представлять собой часть легкой цепи, например легкой цепи иммуноглобулина или ее фрагмента.

При создании изобретения было установлено, что CD45RO/RB-связывающая молекула по настоящему изобретению представляет собой СD45RO/RB-связывающую молекулу из окружающей среды организма млекопитающего, например человека. Таким образом, CD45RO/RB-связывающую молекулу по настоящему изобретению можно обозначить как моноклональное антитело (МАт), при этом связывающая активность определяется главным образом CDR-участками, как описано выше, например, указанные CDR-участки могут быть связаны с другими молекулами, которые не обладают способностью к специфичному связыванию, такими как каркасные участки, например константные области, которые в основном являются человеческими.

Еще одним объектом настоящего изобретения является CD45RO/RB-связывающая молекула, которая не представляет собой моноклональное антитело «А6», описанное у Aversa и др., Cellular Immunology 158 (1994), cc.314-328.

Следующим объектом настоящего изобретения является CD45RO/RB-связывающая молекула по настоящему изобретению, которая представляет собой химерное, гуманизированное или полностью человеческое моноклональное антитело.

Примеры СD45RO/PRB-связывающих молекул включают химерные или гуманизированные антитела, например, полученные из антител, продуцируемых В-клетками или гибридомами, и их любые фрагменты, например F(ab')₂- или Fab-фрагменты, а также одноцепочечные антитела или антитела с одним доменом. Одноцепочечное антитело состоит из вариабельных областей тяжелых и легких цепей антитела, ковалентно связанных с пептидным линкером, как правило, состоящим из 10-30 аминокислот, предпочтительно 15-25 аминокислот. Таким образом, такая структура не включает константную часть тяжелых и легких цепей и, можно предположить, что небольшой пептидный спейсер должен обладать меньшими антигенными свойствами по сравнению с полной константной областью. Под химерным антителом понимают антитело, в котором константные области тяжелых и легких цепей или и тех и других цепей получают из антитела человека, а вариабельные области как тяжелых, так и легких цепей получают из антитела организма, кроме человека (например, мыши). Под гуманизированным антителом понимают антитело, в котором гипервариабельные участки (CDR) получают из организма кроме человека (например, мыши), в то время как все или практически все другие составляющие, например константные области и высококонсервативные участки вариабельных областей, имеют происхождение из организма человека. Однако гуманизированное антитело может включать небольшое количество аминокислот из последовательности мыши в участках вариабельных областей, примыкающих к гипервариабельным участкам.

Гипервариабельные участки, т.е. CDR, по настоящему изобретению могут быть связаны с любым типом каркасных участков, например, константных областей тяжелых и легких цепей, полученных из организма человека. Приемлемые каркасные участки описаны, например, в «Sequences of Proteins of Immunological Interest», Kabat E.A. и др., US Department of Health и Human Services, Public Health Service, National Institute of Health. Предпочтительно константная область человеческой тяжелой цепи может быть IgG1-типа, включая подтипы, предпочтительно константная область человеческой легкой цепи может быть κ- или λ-типа, более предпочтительно κ-типа. Предпочтительной константной областью тяжелой цепи является полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:4 (без участков последовательностей CDR1', CDR2' и CDR3', описанных выше), а предпочтительной константной областью легкой цепи является полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:3 (без участков последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, описанных выше).

Также было создано гуманизированное антитело, которое содержит вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, которая содержит CDR1', CDR2' и CDR3' по настоящему изобретению, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность SEQ:ID NO: 9 или SEQ:ID NO:10, которая содержит CDR1, CDR2 и CDR3 по настоящему изобретению.

Следующим объектом настоящего изобретения является гуманизированное антитело, которое включает полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8.

Еще одним объектом настоящего изобретения является гуманизированное антитело, которое включает

полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:9, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:7,

полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:9, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:8,

полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:10, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:7, или

полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:10, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:8.

Полипептид по настоящему изобретению, например, имеющий указанную последовательность, например, CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2', CDR3', или SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3. SEQ ID NO:4. SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, включает непосредственные эквиваленты указанных (поли)пептидов (последовательности); например, включает функциональное производное указанного полипептида. Функциональное производное может включать ковалентные модификации конкретной последовательности и/или функциональное производное может включать варианты аминокислотной последовательности конкретной последовательности.

Если не указано иное, то понятие «полипептид» включает любой пептид или протеин, состоящий из аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями, аминокислотная последовательность которых начинается на N-конце и заканчивается на С-конце. Предпочтительно полипептид по настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело, более предпочтительно химерное (с трансплантированными вариабельными областями [V-трасплантированное]) или гуманизированное (с трансплантированными гипервариабельными участками [CDR-трансплантированное]) моноклональное антитело. Гуманизированное (CDR-трансплантированное) моноклональное антитело может включать дополнительные мутации, интродуцированные в каркасные (FR) последовательности антитела-акцептора или может не включать такие мутации.

В контексте настоящего описания функциональное производное полипептида включает молекулу, которая обладает качественной биологической активностью, соответствующей активности полипептида по настоящему изобретению, т.е. которая обладает способностью связываться с CD45RO и CD45RB. Функциональное производное включает фрагменты и пептидные аналоги полипептида по настоящему изобретению. Фрагменты представляют собой области внутри последовательности полипептида по настоящему изобретению, например, имеющего конкретную представленную в настоящем описании последовательность. В контексте настоящего описания понятие «производное» относится к вариантам аминокислотной последовательности и ковалентным модификациям полипептида по настоящему изобретению, например, имеющему конкретную представленную в настоящем описании последовательность. Функциональные производные полипептида по настоящему изобретению, например, имеющие конкретную представленную в настоящем описании последовательность, предпочтительно по меньшей мере примерно на 65%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 75%, еще более предпочтительно примерно по меньшей мере на 85%, наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 95% гомологичны полной последовательности аминокислотной последовательности полипептида по настоящему изобретению, например, имеющей конкретную представленную в настоящем описании последовательность, и сохраняют в целом способность связываться с CD45RO и CD45RB.

Понятие «ковалентная модификация» включает модификации полипептида по настоящему изобретению, например, имеющего конкретную представленную в настоящем описании последовательность; или его фрагмента с использованием органического белкового или небелкового дериватизирующего агента, слияния с гетерологичными полипептидными последовательностями и посттрансляционные модификации. Ковалентно модифицированные полипептиды, например, имеющие конкретную представленную в настоящем описании последовательность, все еще сохраняют способность связываться путем поперечной связи с CD45RO и CD45RB. Как правило, ковалентные модификации интродуцируют путем взаимодействия аминокислотных остатков-мишеней с органическим дериватизирующим агентом, который обладает способностью взаимодействовать с выбранными боковыми или концевыми остатками, или путем принятых механизмов посттрансляционных модификаций, функционирующих в выбранных рекомбинантных клетках-мишенях. Определенные посттрансляционные модификации являются результатом воздействия рекомбинантных клеток-мишеней на экспрессирумый полипептид. Глутаминильные и аспарагинильные остатки часто деамидируют после трансляции с получением соответствующих глутамильных и аспартильных остатков. В другом варианте эти остатки деаминируют в мягких кислотных условиях. Другие посттрансляционные модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серила, тирозина или треонила, метилирование α-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина (см., например, Т.Е.Creighton, Proteins: Structure и Molecular Properties, W.H.Freeman & Co., San Francisco, cc.79-86 (1983)). Ковалентные модификации включают, например, слияние протеинов, содержащих полипептид по настоящему изобретению, например, имеющий конкретную представленную в настоящем описании последовательность, и их вариантов аминокислотных последовательностей, например, с использованием иммуноадгезинов, и N-концевые слияния с гетерологичными сигнальными последовательностями.

Понятие «гомология» применительно к нативному полипептиду и его функциональному производному в контексте настоящего описания обозначает процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, идентичных остаткам соответствующего нативного полипептида, после выравнивания последовательностей и при необходимости введения брешей для достижения максимального процента гомологии, и при оценке гомологии не учитываются никакие консервативные замены в качестве одного из критериев идентичности последовательностей. Никакие N- или С-концевые удлинения или инсерции не рассматриваются в качестве элементов, снижающих идентичность или гомологию. Методы и компьютерные программы, применяемые для сравнительного анализа, хорошо известны.

Понятие «аминокислота(ы)» относится ко всем встречающимся в естественных условиях, например, L-α-аминокислотам и включает D-аминокислоты. Аминокислоты обозначают либо с помощью хорошо известного однобуквенного кода, либо с помощью трехбуквенного кода.

Понятие «вариант аминокислотной последовательности» относится к молекулам, которые имеют некоторые отличия по аминокислотным последовательностям по сравнению с полипептидом по настоящему изобретению, например, имеющим конкретную представленную в настоящем описании последовательность. Варианты аминокислотной последовательности по настоящему изобретению, например конкретной представленной в настоящем описании последовательности, все еще сохраняют способность связываться с CD45RO и CD45RB. Полученные с помощью замены варианты представляют собой варианты, у которых по меньшей мере один аминокислотный остаток удален и вместо него другая аминокислота встроена в это же положение в полипептиде по настоящему изобретению, например, имеющему конкретную представленную в настоящем описании последовательность. Эти замены могут быть одиночными, когда заменена только одна аминокислота в молекуле, или они могут быть множественными, когда в одной и той же молекуле заменены две или большее количество аминокислот. Полученные с помощью инсерции варианты представляют собой варианты, в которых одна или несколько аминокислот встроены непосредственно по соседству с аминокислотой в определенном положении в полипептиде по настоящему изобретению, например, имеющему конкретную представленную в настоящем описании последовательность. Понятие «непосредственно по соседству с аминокислотой» обозначает соединение либо с α-карбокси-, либо с α-амино- функциональной группой аминокислоты. Полученные с помощью делеции варианты обозначает варианты, в которых одна или несколько аминокислот в полипептиде по настоящему изобретению, например, имеющему конкретную представленную в настоящем описании последовательность, удалены. Как правило, полученные путем делеции варианты должны иметь одну или две делеции аминокислот в конкретной области молекулы.

При создании изобретения были также выявлены полинуклеотидные последовательности

- GGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATACAGTG, которая кодирует аминокислотную последовательность CDR1,

- TTCTTCTGAGTCTATCTCTGG, которая кодирует аминокислотную последовательность CDR 2,

- ACAAAGTAATACCTGGCCATTCACGTT, которая кодирует аминокислотную последовательность CDR 3,

- TTATATTATCCACTG, которая кодирует аминокислотную последовательность CDR1',

- TTTTAATCCTTACAATCATGGTACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAG, которая кодирует аминокислотную последовательность CDR2',

- AGGACCCTATGCCTGGTTTGACACCTG, которая кодирует аминокислотную последовательность CDR3',

- SEQ ID NO:5, которая кодирует полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:1, т.е. вариабельную область легкой цепи МАт по настоящему изобретению;

- SEQ ID NO:6, которая кодирует полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:2, т.е. вариабельную область тяжелой цепи МАт по настоящему изобретению;

- SEQ ID NO:11, которая кодирует полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:9, т.е. варибельную область тяжелой цепи, включая CDR1, CDR2 и CDR3 по настоящему изобретению;

SEQ ID NO:12, которая кодирует полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:10, т.е. вариабельную область тяжелой цепи, включая CDR1, CDR2 и CDR3 по настоящему изобретению;

- SEQ ID NO:13, которая кодирует полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:7, т.е. вариабельную область легкой цепи, включая CDR1', CDR2' и CDR3' по настоящему изобретению, и

- SEQ ID NO:14, которая кодирует полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:8, т.е. вариабельную область легкой цепи, включая CDR1', CDR2' и CDR3' по настоящему изобретению. Другим объектом настоящего изобретения являются выделенные полинуклеотиды, содержащие полинуклеотиды, которые кодируют CD45RO/RB- связывающую молекулу, например, которые кодируют аминокислотную последовательность CDR1, CDR2 и CDR3 по настоящему изобретению и/или предпочтительно и полинуклеотиды, которые кодируют аминокислотную последовательность CDR1', CDR2' и CDR3' по настоящему изобретению; и полинуклеотиды, содержащие полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:5, и/или предпочтительно и полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:6; и полинуклеотиды, содержащие полинуклеотиды, которые кодируют полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, например, кодирующие

- полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:7, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:9,

- полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:7, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:10,

- полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:8, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:9, или

- полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:8, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:10, и

- полинуклеотиды, содержащие полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:12, и полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:13, или полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:14, предпочтительно содержащие

- полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:11, и полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:13,

- полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:11, и полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:14,

- полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:12, и полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:13, или

- полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:12, и полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:14.

Если не указано иное, то понятие «полинуклеотид» в контексте настоящего описания включает любой полирибонуклеотид или полидезоксирибонуклеотид, который может представлять немодифицированную РНК или ДНК или модифицированную РНК или ДНК, включая (но не ограничиваясь ими) одно- и двухцепочечную РНК и РНК, которая представляет собой смесь одно- и двухцепочечных областей.

Полинуклеотид по настоящему изобретению, например полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2', CDR3', или SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3. SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10 соответственно, такой как полинуклеотид, имеющий последовательность SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14 соответственно, включает его аллельные варианты и/или их комплементы; например, включает полинуклеотид, который гибридизуется с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14 соответственно; например, который кодирует полипептид, идентичный на 80% SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10 соответственно, например, включая функциональное производное этого полипептида, например, функциональное производное, которое по меньшей мере на 65% гомологично SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10 соответственно, например, функциональное производное, которое включает ковалентные модификации SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10 соответственно, например, функциональное производное, которое включает варианты аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7. SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10 соответственно; например, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6. SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 или SEQ ID NO:14 соответственно, включает последовательность, полученную вследствие избыточности (вырожденности) генетического кода, которая кодирует также полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10 соответственно, или кодирует полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10 соответственно.

CD45RO/RB-связывающую молекулу, например, представляющую собой химерное или гуманизированное антитело, можно получать с помощью методов рекомбинантной ДНК. Так, можно конструировать одну или несколько молекул ДНК, кодирующих CD45RO/RB, помещая их под контроль соответствующих регулирующих последовательностей и перенося в пригодного хозяина (организм) для экспрессии с помощью соответствующего вектора.

Следующим объектом настоящего изобретения является полинуклеотид, который кодирует одну тяжелую и/или легкую цепь CD45RO/RB-связывающей молекулы по настоящему изобретению, и применение полинуклеотида по настоящему изобретению для получения CD45RO/RB-связывающей молекулы по настоящему изобретению методами рекомбинации.

CD45RO/RB-связывающую молекулу можно получать, например, используя метод, аналогичный общепринятым, в сочетании с информацией, представленной в настоящем описании, например, на основе данных о аминокислотной последовательности гипервариабельных или вариабельных областей и полинуклеотидных последовательностях, кодирующих эти области. Способ конструирования вариабельного домена гена описан, например, в ЕР 239400 и его можно обобщить следующим образом: этот метод позволяет клонировать ген, кодирующий вариабельную область МАт, вне зависимости от его специфичности. Определяют сегменты ДНК, кодирующие каркасные и гипервариабельные участки, и удаляют сегменты ДНК, кодирующие гипервариабельные участки. Кассеты, несущие двухцепочечные синтетические CDR, получают путем синтеза ДНК на основе представленных в настоящем описании данных о последовательностях CDR и CDR'. Эти кассеты создают так, чтобы они имели «липкие» концы, благодаря чему их можно встраивать путем лигирования в стыки требуемой каркасной области человеческого происхождения. Полинуклеотиды, кодирующие одноцепочечные антитела, можно получать также, например, используя метод, аналогичный общепринятым. Полученный таким образом полинуклеотид по настоящему изобретению удобно переносить в соответствующий экспрессионный вектор.

Приемлемые линии клеток можно создавать, например, используя метод, аналогичный общепринятым. Экспрессионные векторы, например, содержащие приемлемый(ые) промотор(ы) и гены, кодирующие константные области тяжелой и легкой цепи, например, являются известным и имеются в продаже. Приемлемые хозяева являются известными или их можно получать, например, используя метод, аналогичный общепринятым, и они включают культуру клеток или трансгенных животных.

Еще одним объектом настоящего изобретение является экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид, который кодирует CD45RO/RB-связывающую молекулу по настоящему изобретению, например, имеющий последовательность SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 или SEQ ID NO:18.

Следующим объектом настоящего изобретения является

- система экспрессии, содержащая полинуклеотид по настоящему изобретению, причем эта система экспрессии или ее часть обладает способностью продуцировать CD45RO/RB-связывающую молекулу по настоящему изобретению, когда система экспрессии или ее часть присутствует в совместимой с ней клетке-хозяине, и

- выделенная клетка-хозяин, содержащая систему экспрессии, как она определена выше.

При создании изобретения было также установлено, что CD45RO/RB-связывающая молекула по настоящему изобретению ингибирует первичные аллоиммуннные ответы в зависимости от дозы, что определено in vitro с помощью MLR. Эти результаты свидетельствуют о том, что у клеток, которые являлись аллоактивированными, в присутствии CD45RO/RB-связывающей молекулы по настоящему изобретению, снижались ответы на аллоантиген. Это подтверждает предположение о том, что CD45RO/RB-связывающая молекула по настоящему изобретению может оказывать непосредственное воздействие на эффекторные аллореактивные Т-клетки и модулировать их функцию. Кроме того, функциональные свойства Т-клеток, полученных с помощью первичной MLR, дополнительно исследовали в экспериментах по повторной стимуляции (рестимуляции) с помощью вторичной MLR, используя специфичные клетки-стимуляторы или дополнительные второстепенные стимуляторы для оценки специфичности наблюдаемых функциональных воздействий. При создании изобретения было установлено, что у клеток, полученных с помощью первичных MLR, в которых присутствовала СD45RO/RB-связывающая молекула по настоящему изобретению, снижалась способность реагировать на последующую оптимальную стимуляцию с помощью специфичных клеток-стимуляторов, хотя во вторичные культуры не добавляли никакого антитела. Специфичность ингибирования оценивали по способности клеток, обработанных CD45RO/RB-связывающей молекулой по настоящего изобретению, нормально реагировать на клетки-стимуляторы из неродственных дополнительных второстепенных доноров. Таким образом, эксперименты по рестимуляции с использованием Т-клеток, полученных из первичных MLR-культур, свидетельствуют о том, что клетки, которые были аллоактивированными, в присутствии CD45RO/RB-связывающей молекулы по настоящему изобретению становились гипореактивными, т.е. толерантными к исходному аллоантигену.

Кроме того, было установлено, что клеточную пролиферацию в клетках, предварительно обработанных СD45RO/RB-связывающей молекулой по настоящему изобретению, можно прекращать с помощью экзогенного IL-2. Это свидетельствует о том, что обработка аллореактивных Т-клеток CD45RO/RB-связывающей молекулой по настоящему изобретению индуцирует состояние толерантности. Так, пониженная способность к пролиферации, наблюдаемая в клетках, обработанных СD45RO/RB-связывающей молекулой по настоящему изобретению, приводит к ухудшению Т-клеточной функции, и эти клетки приобретают способность реагировать на экзогенный IL-2, что свидетельствует о том, что эти клетки приобретают анергическое, истинное состояние иммуннологической толерантности. Специфичность этого ответа доказана по способности клеток, обработанных СD45RO/RB-связывающей молекулой по настоящему изобретению, к нормальной для неродственных клеток-доноров пролиферации, соответствующей уровню пролиферации контрольных необработанных клеток.

Кроме того, эксперименты, свидетельствуют о том, что связывание СD45RO/RB-связывающей молекулы по настоящему изобретению с CD45RO и CD45RB может ингибировать вторичные иммунные ответы (бустер-реакции) мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) иммунизированных доноров на специфический «воскресший» антиген. Таким образом, связывание СD45RO/RB-связывающей молекулы по настоящему изобретению с CD45RO и CD45RB эффективно также в отношении ингибирования вторичных иммунных ответов на растворимый антиген (Аг). Способность CD45RO/RB- связываю щей молекулы по настоящему изобретению ингибировать вторичные иммунные ответы на столбнячный токсин в РВМС иммунизированных доноров свидетельствует о том, что СD45RO/RB-связывающая молекула по настоящему изобретению обладает способностью направлять и модулировать активацию Т-клеток памяти. Например, эти данные свидетельствуют о том, что CD45RO/RB-связывающая молекула по настоящему изобретению помимо способности распознавать аллореактивные и активированные Т-клетки может модулировать их функцию, что приводит к индукции Т-клеточной толерантности. Эта особенность может быть важна для лечения индуцирования иммунных ответов на аутоантигены и аллергены и, возможно, на аллоантигены, которые обнаружены при аутоиммуных заболеваниях, аллергии и хроническом отторжении, и при таких болезнях, как псориаз, хроническое воспалительное заболевание кишечника, при которых вторичные иммунные ответы играют роль в поддержании болезненного состояния. Вероятно, это является важным для болезненного состояния, такого как аутоиммунные заболевания, при которых вторичные иммунные ответы на аутоантигены могут играть основную роль в поддержании болезненного состояния.

При создании изобретения было установлено, что CD45RO/RB-связывающая молекула по настоящему изобретению может модулировать Т-клеточные пролиферативные иммунные ответы в реакции лимфоцитов в смешанной культуре (MLR) in vivo, т.е. установлено, что CD45RO/RB-связывающая молекула по настоящему изобретению обладает соответствующими ингибирующими свойствами при тестировании in vivo.

Таким образом, СD45RO/RB-связывающая молекула по настоящему изобретению может обладать иммуносупрессорными и вызывающими иммунологическую толерантность свойствами и ее можно применять in vivo и ex vivo для индукции толерантности к аллоантигенам, аутоантигенам, аллергенам и антигенам бактериальной флоры, например, CD45RO/RB-связывающую молекулу по настоящему изобретению можно применять для лечения и профилактики заболеваний, например, включая аутоиммунные заболевания, такие как (но не ограничиваясь ими) ревматоидный артрит, аутоиммунный тиреоидит, болезнь Грейвса, диабет типа I и типа II, рассеянный склероз, системная красная волчанка, синдром Шегрена, склеродермия, аутоиммунный гастрит, гломерулонефрит, отторжение трансплантата, например, отторжение аллотрансплантата и ксенотрансплантата органа и ткани, реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ), а также псориаз, воспалительное заболевание кишечника и аллергии.

Еще одним объектом настоящего изобретения является применение СD45RO/RB-связывающей молекулы по настоящему изобретению в качестве фармацевтического средства, предназначенного, например, для лечения и профилактики аутоиммунных заболеваний, отторжения трансплантата, псориаза, воспалительного заболевания кишечника и различных видов аллергии.

Следующим объектом настоящего изобретения является CD45RO/RB-связывающая молекула по настоящему изобретению, предназначенная для приготовления лекарственного средства для лечения и профилактики заболеваний, связанных с аутоиммунными заболеваниями, отторжением трансплантата, псориазом, воспалительным заболеванием кишечника и аллергиями.

Еще одним объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая СD45RO/RB-связывающую молекулу по настоящему изобретению в сочетании по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

Фармацевтическая композиция может содержать дополнительно, например, действующие вещества, например, другие антитела-иммуномодуляторы, такие как (но не ограничиваясь ими) антитела к ICOS, антитела к CD154, антитела к CD134L, или рекомбинантные протеины, такие как (но не ограничиваясь ими) rCTLA-4 (CD152), rOХ40 (CD134), или иммуномодуляторы, такие как (но не ограничиваясь ими) циклоспорин A, FTY720, RAD, рапамицин, FK506, 15-дезоксиспергуалин, стероиды.

Следующим объектом настоящего изобретения является способ лечения и/или профилактики заболеваний, связанных с аутоиммунными заболеваниями, отторжением трансплантата, псориазом, воспалительным заболеванием кишечника и аллергиями, который предусматривает введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении и/или профилактике, эффективного количества СD45RO/RB-связывающей молекулы по настоящему изобретению, например, в форме фармацевтической композиции по настоящему изобретению.

Аутоиммунные заболевания, подлежащие лечению с помощью связывающей молекулы по настоящему изобретению, включают дополнительно (но не ограничиваясь ими) ревматоидный артрит, аутоиммунный тиреоидит, болезнь Грейвса, диабет типа I и типа II, рассеянный склероз, системную красную волчанку, синдром Шегрена, склеродермию, аутоиммунный гастрит, гломерулонефрит; отторжение трансплантата, например отторжение аллотрансплантата и ксенотрансплантата органа и ткани, реакцию «трансплантат против хозяина» (РТПХ).

Примеры

Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах, которые не ограничивают его объем. В приведенных ниже примерах все температуры даны в градусах Цельсия.

«МАт-кандидат» или «химерное антитело» представляет собой CD45RO/RB-связывающую молекулу по настоящему изобретению, которая содержит легкую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO:3, и тяжелую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO:4.

Использовали следующие сокращения:

ELISA твердофазный иммуноферментый анализ

FACS флуоресцентный метод разделения клеток лимфоцитов

ФИТЦ флуоресцинизоцианат

ФБС фетальная бычья сыворотка

РТПХ реакция «трансплантат против хозяина»

HCMV промотор человеческого цитомегаловируса

IgE иммуноглобулин изотипа Е

IgG иммуноглобулин изотипа G

ЗФР забуференный фосфатом физиологический раствор

ПЦР полимерная цепная реакция

кРТПХ реакция «ксенотрансплантат против хозяина»

Пример 1. Первичная реакция лимфоцитов в смешанной культуре (MLR)

Клетки

Образцы крови получают из крови здоровых добровольцев. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяют путем центрифугирования в фиколе-паке (фирма Pharmacia LKB) из лейкоцитов цельной периферической крови, лейкоцитов, полученных в результате процедуры, связанной с реинфузией очищенной донорской крови, или лейкоцитарных пленок известного типа крови, но неизвестного HLA-типа. В некоторых MLR-экспериментах РВМС используют непосредственно в качестве клеток-стимуляторов после облучения (40 Гр). В других экспериментах Т-клетки получают из РВМС с использованием гранул типа CD2 или CD3 Dynabead (фирма Dynal, Осло, Норвегия). Гранулы и сопутствующие клетки выделяют с помощью магнитного поля. РВМС с удаленными Т-клетками («истощенные» РВМС) после облучения используют в качестве клеток-стимуляторов.

РВМС, CD3⁺-Т-клетки или CD4⁺-Т-клетки применяют в MLR в качестве клеток-респондеров. Клетки получают из доноров, отличных от клеток-стимуляторов. CD3⁺-Т клетки очищают путем негативной селекции с использованием МАт к CD16 (фирма Zymed, штат Калифорния), гранул типа Dynabead, нагруженных козлиным антителом к IgG мыши, гранул типа Dynabead, нагруженных антителом к CD14, гранул типа Dynabead, нагруженных антителом к CD19. Кроме того, для очистки CD4⁺-Т-клеток используют гранулы типа Dynabead, нагруженные антителом к CD8. Полученные клетки анализируют с помощью FACScan или FACSCalibur (фирма Becton Dickinson & Co., штат Калифорния), чистота полученных клеток составляет >75%. Клетки суспендируют в среде RPMI1640, дополненной 10% инактивированной с помощью тепловой обработки ФБС, пенициллином, стрептомицином и L-глутамином.

Реагенты

Также конструируют химерное МАт к CD45RO/RB, т.е. «МАт-кандидат», и химерное тело соответствующего изотипа. Мышиное (человеческое) контрольное антитело IgG₁, специфическое в отношении KLH (гемоцианин лимфы улитки) или рекомбинантный человеческий IL-10 получают от фирмы BD Pharmingen (Сан Диего, штат Калифорния). МАт к человеческому CD154 5с8 получают согласно методу, описанному у Lederman и др. 1992.

Первичная реакция лимфоцитов в смешанной культуре (MLR)

Аликвоты по 1×10⁵ РВМС или 5×10⁴ CD3⁺- или CD4⁺-клеток смешивают с 1×10⁵ облученных РВМС или 5×10⁴ облученных (50 Гр) РВМС с удаленными Т-клетками в каждой лунке 96-луночных культуральных планшетов (фирма Costar, Кэмбридж, штат Массачусетс) в присутствии указанного МАт или без Ат. В некоторых экспериментах к МАт-кандидату добавляют F(ab')₂-фрагмент козьего антимышиного Ig или козьего античеловеческого Ig, специфичного для Fc-фрагмента (фирма Jackson Immuno Research, Вест Гров, штат Пенсильвания) в количестве 10 мкг/мл для того, чтобы гарантировать оптимальное сшивание in vitro с молекулами-мишенями CD45.

Смешанные клетки культивируют в течение 4-5 дней при 37°С в 5% СО₂ и определяют их пролиферацию путем введения в клетки метки ³Н-тимидина в течение последних 16-20 ч культивирования.

Другие эксперименты проводят аналогичным методом, но со следующими изменениями: 1) применяемая среда представляет собой среду EX-VIVO (фирма Bio-Whittaker), которая содержит 10% ФБС и 1% человеческой плазмы; 2) на стадии вторичного поперечного сшивания используют общее антитело к IgG мыши (5 мкг/мл); 3) облучение осуществляют при 60 Гр.

Первичную MLR осуществляют в присутствии «МАт-кандидата» или контрольного химерного IgG₁ (10 мкг/мл) в обоих случаях с реагентом для второй стадии, F(ab')₂-фрагментом козьего антитела к Ig человека, специфического для Fc-фрагмента (10 мкг/мл). Процент ингибирования «МАт-кандидатом» рассчитывают путем сравнения клеточной пролиферации в присутствии контрольного IgG₁. Результаты представлены ниже в таблице 1.

Таблица 1
Ингибирование первичной MLR с помощью 10 мкг/мл «МАт-кандидата» по настоящему изобретению
Респондер	Стимулятор (облученные, РВМС)	% ингибирования
№211 CD4	№219 CD3	63,51
№220 CD4	№219 CD3, «истощенные»	63,07
№227 CD4	№220 CD3, «истощенные»	65,96
№229 CD4	№219 CD3, «истощенные»	50,76
Среднее±ско	60,83±6,83*
* Достоверное отличие от полученных в контроле данных (Р<0,001)

Как видно из таблицы 1, «МАт-кандидат» по настоящему изобретению ингибирует первичную MLR. Среднее ингибирующее действие составляет 60,83±6,83 % при использовании CD4⁺-Т клеток, полученных из 4 различных доноров, и является статистически достоверным.

Установлено, что ингибирование первичной MLR «МАт-кандидатом» зависит от дозы в диапазоне от 0,001 до 10 мкг/мл «МАт-кандидата», что видно из фиг.1.

Значение IC₅₀ для ингибирования первичной MLR «МАт-кандидатом» определяют на основе результатов трех различных MLR-экспериментов с использованием РВМС одного донора в качестве клеток-респондеров. Так, респондерные CD4⁺-Т-клетки доноров №229 и №219 и облученные РВМС с удаленными Т-клетками в качестве стимуляторов смешивают в присутствии «МАт-кандидата» или химерного Ат с 10 мкг/мл F(ab')₂ -фрагмента козьего античеловеческого Ig. Эксперименты повторяют трижды и рассчитывают процент пролиферации в присутствии «МАт-кандидата» в сравнении с Т-клеточной пролиферацией в присутствии контрольного Ат. Значение IC₅₀ рассчитывают с помощью программы Origin (V. 6.0®). Рассчитанное значение IC₅₀ для клеточной активности составляет 0,87±0,35 нМ (0,13±0,052 мкг/мл).

Пример 2. Вторичная MLR

Для оценки способности «МАт-кандидата» индуцировать иммунологическую толерантность CD4⁺ -Т клеток к специфическим аллоантигенам после первичной MLR осуществляют вторичную MLR в отсутствие каких-либо антител. CD4⁺-Т-клетки культивируют вместе с облученными аллогенными клетками-стимуляторами (РВМС с удаленными Т-клетками) в присутствии указанного антитела в 96-лунных культуральных планшетах в течение 10 дней (первичная MLR). Затем клетки собирают, наслаивают в градиенте фикол-пака для удаления мертвых клеток, промывают дважды средой RPMI и повторно стимулируют с помощью такого же стимулятора, другими второстепенными клетками-стимуляторами или IL-2 (50 ед./мл). Клетки культивируют в течение 3 дней и определяют пролиферативную реакцию путем введения в клетки метки ³Н-тимидина в течение последних 16 -20 ч культивирования.

В частности, CD4⁺-Т-клетки культивируют с облученными аллогенными клетками-стимуляторами (полученными из крови других доноров РВМС с удаленными Т-клетками) в присутствии 10 мкг/мл «МАт-кандидата», контрольного IgG1, химерного Ат и F(ab')₂-фрагмента козьего античеловеческого Ig. Пролиферацию при первичной MLR определяют на 5-й день. Для вторичной MLR респондер и клетки-стимуляторы культивируют в течение 10 дней в присутствии «МАт-кандидата», затем клетки собирают, промывают дважды с помощью RPMI 1640 и повторно стимулируют специфичным стимулятором, другими второстепенными стимуляторами или IL-2 (50 ед./мл) в отсутствие какого-либо Ат. Клеточную пролиферацию оценивают на 3-й день. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2
№ донора CD4+ Т-клеток-респондеров	% ингибирования при вторичной MLR
№211	49,90*
№220	59,33*
№227	58,68*
* Достоверно различие от полученных в контроле данных (р=<0,001 при оценке с помощью t-критерия, программа SigmaStat V.2.03). #р=<0,046

Для оценки того, является ли ухудшенная пролиферация результатом иммунологической толерантности вследствие обработки «МАт-кандидатом», полученные в результате первичной MLR клетки культивируют в присутствии IL-2 (50 ед./мл). При первичной MLR добавление IL-2 приводит к восстановлению пролиферативных реакций Т-клеток, обработанных «МАт-кандидатом», до уровней, аналогичных уровням, наблюдаемым в присутствии контрольного антитела в виде IgG₁. Эти данные свидетельствуют о том, что ухудшенная вторичная реакция Т-клеток, обработанных «МАт-кандидатом», является результатом функционального изменения Т-клеток-респондеров, которые становятся нечувствительными по отношению к специфическим клеткам-стимуляторам.

Процент ингибирования рассчитывают из следующей формулы:

Статистический анализ осуществляют с помощью программы SigmaStat (версия 2.03).

Данные анализируют с помощью двунаправленного дисперсионного анализа с последующим анализом согласно методу Dunnett. Во всех процедурах анализа вероятность <0,05 рассматривается как статистически достоверная. В некоторых экспериментах используют t-критерий (программа SigmaStat V.2.03).

Пример 3. Анализ выживания in vivo с использованием SCID-мышей

Приживление hu-PBL (человеческие лимфоциты периферической крови) у SCID-мышей

Мононуклеарные клетки человеческой периферической крови (РВМС) инъецируют внутрибрюшинно SCID-мышам линии С.В17/GbmsTac-Prkdc^scid Lyst^bg (фирма Taconic, Германтаун, штат Нью-Йорк) в количестве, достаточном для индукции летальной реакции «ксенотрансплантат против хозяина» (кРТПХ) у >90% мышей в течение 4 недель после переноса клеток. Обработанные таким образом SCID-мыши обозначены далее как hu-PBL-SCID-мыши.

Обработка МАт hu-PBL-SCID-мышей

Hu-PBL-SCID-мышей обрабатывают «МАт-кандидатом» или мышиным или химерным изотипом соответствующих контрольных МАт в день 0, т.е. сразу же после инъекции РВМС, затем в день 3, день 7 и далее с недельными интервалами. МАт вводят подкожно в 100 мкл ЗФР в конечной концентрации 5 мг/кг веса тела. Обработку прекращают после гибели всех контрольных мышей.

Оценка результатов обработки

В этом эксперименте основным критерием для оценки эффективности «МАт-кандидата» является выживание hu-PBL-SCID-мышей. Достоверность этих результатов оценивают с помощью статистического метода анализа выживаемости с помощью Log-рангового критерия (метод Мантеля (Mantel)) с помощью программы Systat v9.01. Метод анализа выживаемости представляет собой непараметрический критерий, при котором учитываются не только данные о выживании конкретной мыши, но и тот факт, что мышь была умерщвлена по причинам, не связанным с обработкой/заболеванием, например с целью анализа ее органов/клеток in vitro. С целью дополнительного исследования берут биопсии печени, легкого, почки и селезенки мертвых мышей. Кроме того, hu-PBL-SCID-мышей взвешивают в начале (перед переносом клеток) и в процессе эксперимента (каждые два эксперимента), что является косвенным критерием их состояния здоровья. Строят график линии линейной регрессии на основе данных о весе тела каждой мыши в зависимости от количества дней после переноса РВМС и затем осуществляют сравнение наклонов кривых (полученных для контрольных мышей в сравнении с обработанными антителом CD45 мышами) с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (Mann-Whitney).

Результаты

У всех hu-PBL-SCID-мышей, обработанных мышиными контрольными МАт, обнаружена инфильтрация человеческих лейкоцитов в легкое, печень и селезенку, и они погибли (4/4) в течение примерно 2-3 недель после переноса клеток. Их гибель, вероятно, является результатом кРТПХ. Кроме того, у обработанных контрольным МАт мышей происходила линейная потеря веса, примерно 10% и более, в течение 3 недель.

Все hu-PBL-SCID-мыши, обработанные «МАт-кандидатом», выжили (4/4) и не имели никаких симптомов болезни в течение более 4 недель, даже, если обработку «МАт-кандидатом» прекращали спустя 3 недели. У обработанных «МАт-кандидатом» мышей происходило линейное прибавление веса примерно до 5% в течение 4 недель.

Пример 4. Экспрессия антитела по изобретению

Экспрессия гуманизированного антитела, содержащего SEQ ID NO:7, SEO ID NO:8, SEQ ID NO:9 или SEO ID NO:10

Конструируют экспрессионные векторы, плазмидная карта которых представлена на фиг.2-5, содержащие соответствующие нуклеотиды, которые кодируют аминокислотную последовательность гуманизированной вариабельной области легкой цепи humVl (SEQ ID NO:7), гуманизированной вариабельной области легкой цепи humV2 (SEQ ID NO:8), гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи VHE (SEQ ID NO:9) или гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи VHQ (SEQ ID NO:10) соответственно. Эти экспрессионные векторы имеют нуклеотидные (ДНК) последовательности SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17 или SEQ ID NO 18 соответственно.

Конструирование экспрессионных векторов, несущих тяжелую и легкую цепь гуманизированного антитела

Экспрессионные векторы для версий VLh и VLm человеческой легкой каппа-цепи

Для конструирования конечного экспрессионного вектора, кодирующего полную гуманизированную легкую цепь человеческого каппа-изотипа, фрагменты ДНК, кодирующие вариабельные области полной легкой цепи (VLh и VLm), вырезают из содержащих VLh и VLm клонирующих векторов PCR-Script (фирма Stratagene) (VLm-область), с использованием HindIII и BglII. Очищенные на геле фрагменты затем субклонируют в сайтах HindIII и BamHI экспрессионного вектора C21-HCMV Карра, созданного в процессе конструирования гуманизированного антитела к IgE TESC-21 (Kolbinger и др. 1993), которое первоначально было получено от М. Bendig (MRC Collaborative Centre, Лондон, Великобритания) (Maeda и др. 1991). Полученные путем лигирования продукты очищают с помощью экстракции фенолом/хлороформом и переносят путем электропорации в компетентный для электропорации штамм Epicurian Coli® XL1-Blue (каталожный №200228, фирма Stratagene). После посева на агаровые пластинки LB/amp (среда LB/ампициллин) и инкубации в течение ночи при 37°С, каждые 12 колоний собирают для приготовления плазмидной ДНК из 3 мл культуры с использованием устройства BioRobot 9600 (фирма Qiagen). Это позволяет получать экспрессионные векторы для легких цепей версий VLh и VLm соответственно гуманизированного антитела, что дополнительно представлено на чертежах.

Экспрессионные векторы для версии VHO человеческой тяжелой гамма-1-цепи

Для конструирования экспрессионного вектора VHQ используют стадийный подход. Сначала с помощью ПЦР создают вариабельную область VHQ согласно методике, описанной у Kolbinger и др. (Protein Eng., 1993 Nov; 6(8): cc.971-80), и субклонируют в экспрессионном векторе C21-HCMV-gamma-1, из которого вставка С21 была удалена с использованием этих же ферментов. Затем HindIII/BamHI-фрагмент PCRScript клона VHQ, содержащий полную вариабельную область, субклонируют в экспрессионном векторе C21-HCMV-gamma-1, расщепленном с помощью этих же ферментов. Таким образом получают конечный экспрессионный вектор для версии VHQ гуманизированного антитела.

Экспрессионные векторы для версии VHE человеческой тяжелой гамма-1-цепи

Конструирование конечного VHE-экспрессионного вектора, кодирующего полную гуманизированную тяжелую цепь человеческого гамма-1-изотипа, осуществляют непосредственным встраиванием путем лигирования расщепленного с помощью HindIII и BamHI ПЦР-фрагмента, кодирующего вариабельную область, в сайты HindIII и BamHI экспрессионного вектора С21-HCMV gamma-1, который был создан при конструировании гуманизированного антитела к IgE TESC-21 (Kolbinger и др. 1993) и который также первоначально был получен от М. Bendig (MRC Collaborative Centre, Лондон, Великобритания) (Maeda и др. 1991).

Кратковременная экспрессия в клетках COS

Приведенный ниже протокол трансфекции применяют для прикрепленных клеток COS в 150-миллиметровых чашках для культивирования с использованием реагента SuperFect™ Transfection Reagent (каталожный №301305, фирма Qiagen). Для кратковременной трансфекции клеток используют 4 различных описанных выше экспрессионных вектора. Для экспрессии гуманизированного антитела каждым из двух клонов, содержащих встроенные тяжелые цепи (VHE или VHQ соответственно), трансфектируют клетки совместно с каждым из двух клонов, кодирующих легкие цепи (humVl или humV2 соответственно), получая в целом 4 различные комбинации экспрессионных векторов тяжелых и легких цепей (VHE/humVl, VHE/humV2, VHQ/humV1 и VHQ/humV2). Перед трансфекцией плазмиды линеаризуют с помощью рестриктазы PvuI, которая осуществляет расщепление в области, кодирующей ген устойчивости к ампициллину. За 1 день до трансфекции 4×10⁶ клеток COS в 30 мл свежей культуральной среды высевают в 150-миллиметровые чашки для культивирования. Посев клеток с указанной плотностью, как правило, позволяет достичь 80%-ной конфлюэнтности через 24 ч. В день осуществления трансфекции 4 различные комбинации линеаризированных экспрессионных векторов, несущих ДНК тяжелых и легких цепей (по 15 мкг каждого), разбавляют в общем объеме 900 мкл свежей бессывороточной среды, не содержащей антибиотиков. Затем 180 мкл реагента SuperFect Transfection Reagent тщательно смешивают с раствором ДНК. Содержащую ДНК смесь инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре, давая образоваться комплексу. После формирования комплекса из культур клеток COS удаляют среду для роста и клетки однократно промывают ЗФР. Затем по 9 мл свежей культуральной среды (содержащей 10% ФБС и антибиотики) добавляют в каждую реакционную пробирку, содержащую комплекс для трансфекции, и хорошо перемешивают. Конечный продукт немедленно переносят в каждую из 4 культур, подлежащих трансфекции, и осторожно перемешивают. Затем клеточные культуры инкубируют с комплексами ДНК в течение 3 ч при 37°С и 5% СО₂. После инкубции среду, содержащую комплексы для трансфекции, удаляют и заменяют 30 мл свежей культуральной среды. Через 48 ч после трансфекции собирают супернатанты культур.

Концентрирование супернатантов культур

Для анализа с помощью ELISA и FACS супернатанты культур, собранные с клеток COS, трансфектированных плазмидами, которые несут тяжелые и легкие цепи, концентрируют с использованием следующей методики. По 10 мл каждого супернатанта добавляют в устройства для фильтрации центрифугированием типа Centriprep YM-50 Centrifugal Filter Devices (каталожный номер 4310, фирма Millipore) согласно инструкции производителя. Фильтры Centriprep центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин при комнатной температуре. Затем стадию центрифугирования повторяют вновь с использованием оставшихся 20 мл супернатанта, осуществляя при этом центрифугирование в течение только 5 мин и контролируя изменение концентрации. Полученные в качестве промежуточного продукта 500 мкл концентрированного супернатанта отбирают, переносят в новые устройства типа Microcon Centrifugal Filter Devices (каталожный номер 42412, фирма Microcon) и дополнительно концентрируют, используя протокол производителя. Концентрированные супернатанты центрифугируют 4 раза в течение 24 мин при 3000 об/мин при комнатной температуре, один раз в течение 10 мин при 6000 об/мин и затем три раза в течение 5 мин, осуществляя также контроль за изменением концентрации. Конечный объем полученной концентрированной кондиционированной среды составляет 100-120 мкл, что соответствует исходной культуральной среде, концентрированной в 250-300 раз, и полученный продукт хранят при 4°С до применения. Для сравнения и контроля культуральную среду нетрансфектированных клеток концентрируют аналогичным образом, используя описанный выше протокол центрифугирования.

Пример 5. Оценка экспрессии рекомбинантного человеческого IgG с помощью ELISA

Для оценки концентраций IgG рекомбинантного человеческого антитела, экспрессируемого в супернатантах культур, был разработан и оптимизирован протокол сэндвич-ELISA, включающий применение человеческого IgG в качестве стандарта. Плоскодонные 96-луночные титрационные микропланшеты (каталожный номер 4-39454, фирма Nunc Immunoplate Maxisorp) сенсибилизируют в течение ночи при 4°С 100 мкл козьего античеловеческого IgG (полная молекула, каталожный номер I1011, фирма SIGMA) в конечной концентрации 0,5 мкг/мл в ЗФР. Затем лунки промывают трижды буфером для промывки (ЗФР, содержащий 0,05% Твина 20) и блокируют в течение 1,5 ч при 37°С блокирующим буфером (0,5% БСА в ЗФР). После трех циклов промывки образцы антитела и стандартный человеческий IgG (каталожный номер I4506, фирма SIGMA) готовят путем серийных 1,5-кратных разведений в блокирующем буфере. По 100 мкл разбавленных образцов или стандарта переносят с дублированием в сенсибилизированный планшет и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубации планшеты промывают трижды буфером для промывки и затем инкубируют в течение 1 ч с 100 мкл пероксидазы из хрена, конъюгированной с легкой каппа-цепью козьего античеловеческого IgG (каталожный номер А-7164, фирма SIGMA), разбавленной из расчета 1/4000 блокирующим буфером. В контрольные лунки вносят по 100 мкл блокирующего буфера или концентрированную обычную культуральную среду. После промывки осуществляют колориметрическое количественное определение связанной пероксидазы в содержащих образцы (опытных) и стандартных лунках, используя набор ТМВ Peroxidase EIA Substrate (каталожный номер 172-1067, фирма Bio-Rad), согласно инструкциям производителя. Содержащую пероксидазу смесь добавляют из расчета 100 мкл на лунку и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Колориметрическую реакцию прекращают, добавляя 100 мкл 1 М серной кислоты, и оценивают абсорбцию в каждой лунке при 450 нм с помощью планшет-ридера для ELISA (модель 3350-УФ, фирма BioRad).

При коэффициенте корреляции 0,998 для стандартной кривой IgG были получены следующие концентрации для концентратов четырех различных культур (концентрированных примерно в 250-300 раз):

супернатант VHE/humV1=8,26 мкг/мл

супернатант VHE/humV2=6,27 мкг/мл

супернатант VHQ/humV1=5,3 мкг/мл

супернатант VHQ/humV2=5,56 мкг/мл

Пример 6. Конкурентный анализ FACS (аффинность связывания)

Человеческие Т-клетки линии PEER выбирают в качестве клетки-мишени для FACS-анализа в связи с тем, что они экспрессируют на их клеточной поверхности антиген CD45. Для оценки аффинности связывания супернатантов гуманизированных антител осуществляют конкурентные анализы с использованием меченного с помощью ФИТЦ химерного антитела в качестве стандарта и проводят сравнение с ингибированием очищенного мышиного антитела и химерного антитела. Культуры клеток линии PEER центрифугируют в течение 10 с при 3000 об/мин и среду удаляют. Клетки повторно суспендируют в FACS-буфере (ЗФР, содержащий 1% ФБС и 0,1% азида натрия) и высевают в 96-луночный круглодонный титрационный микропланшет с плотностью клеток 1×10⁵ клеток на лунку. Планшет центрифугируют и супернатант отбрасывают. Для экспериментов по оценке блокирующего действия сначала в каждую лунку добавляют по 25 мкл взятых в указанных концентрациях концентрированной нетрансфектированной среды или изотипа, соответствующего контрольному антителу (негативные контроли), немеченого мышиного антитела или химерного антитела (позитивные контроли), а также концентрированного супернатанта, содержащего различные комбинации гуманизированного антитела (образцы, опытные антитела). После инкубации в течение 1 ч при 4°С клетки линии PEER промывают 200 мкл FACS-буфера путем центрифугирования. Затем клетки инкубируют в течение 1 ч при 4°С с химерным антителом, конъюгированным с ФИТЦ, в 25 мкл FACS-буфера в конечной концентрации 20 мкг/мл. Клетки промывают и ресуспендируют в 300 мкл FACS-буфера, содержащего 2 мкг/мл йодида пропидия, что позволяет открыть окно в клеточном сортере для жизнеспособных клеток. Препарат клеток анализируют с помощью проточного цитометра (FACSCalibur, фирма Becton Dickinson).

FACS-анализ свидетельствует о зависящей от дозы блокаде меченного с помощью флуорохрома химерного антитела концентрированными клеточными супернатантами гуманизированного антитела. При использовании изотипа, соответствующего контрольному антителу, не выявлено никакой зависящей от дозы блокады связывания химерного антитела, что свидетельствует о том, что блокирующее действие различных комбинаций гуманизированного антитела является эпитопспецифичным и что эпитопспецифичность, вероятно, сохраняется после процесса гуманизации.

Пример 7. Биологическая активность СD45RB/RO-связывающих молекул

В этом эксперименте оценивают возможность СD45RB/RO-связывающего химерного антитела, если оно присутствует в культурах поликлонально активированных первичных человеческих Т-клеток, (I) поддерживать дифференцировку Т-клеток с характерным Treg-фенотипом (фенотип Т-регуляторных клеток), (II) предупреждать или повышать апоптоз после активации Т-клетки и (III) оказывать воздействие на экспрессию субпопуляции антигенов и рецепторов после рестимуляции.

СD45RB/RO-связывающее химерное антитело повышает гибель клеток в культурах поликлонально активированных Т-клеток

Первичные Т-клетки (смесь CD4+- и СD8+-Т-клеточных субпопуляций) подвергают активации с помощью МАт к CD3 плюс к CD28 (по 200 нг/мл каждого) в присутствии СD45RB/RO-связывающего химерного антитела или без него (контроль). Избыток антител удаляют промывкой на второй день. Для оценки гибели клеток после активации используют 7-аминоактиномицин D (7-AAD) в качестве красителя для ДНК, который поглощается апоптозными и некротическими клетками. Результаты свидетельствуют о том, что активация Т-клеток в присутствии СD45RB/RO-связывающего химерного антитела повышает фракцию 7-AAD-позитивных клеток более чем в 2 раза на второй день после активации. На седьмой день фракции 7-AAD-позитивных клеток вновь становятся практически одинаковыми в культурах, обработанных CD45RB/RO-связывающим химерным антителом, и в контрольных культурах.

СD45RB/RO-связывающее химерное антитело не контролирует обработанные МАт Т-клетки, проявляющие фенотип Т-регуляторных клеток (Treg)

Повышенный уровень экспрессии CD25 и обусловливающего понижающую регуляцию протеина CTLA-4 (CD 152) является маркером Treg-клеток. Функциональная супрессия первичных и вторичных Т-клеточных ответов CD45RB/RO-связывающим химерным антителом может быть следствием индукции Treg-клеток. Для доказательства этого предположения Т-клетки активируют с помощью МАт к CD3+CD28 и культивируют в присутствии CD45RB/RO-связывающего химерного антитела или контрольного МАт к LPS (липополисахарид). Изучение экспрессии CTLA-4 и CD25 в зависимости от времени свидетельствует о выраженных различиях между Т-клетками, обработанными контрольными антителами и CD45RB/RO-связывающим химерным антителом в дни 1 и 3 после вторичной стимуляции.

Внутриклеточная экспрессия CTLA-4 поддерживается в присутствии СD45RB/RO-связывающего химерного антитела

Известны данные о том, что значительные количества CTLA-4 можно обнаружить также внутри клеток. Поэтому параллельно с окрашиванием CTLA-4 на поверхности клеток анализируют внутриклеточную экспрессию CTLA-4. На 4-й день после стимуляции между Т-клеточными культурами выявлены небольшие различия. Однако после продолжительного культивирования высокие уровни внутриклеточного CTLA-4 обнаружены только в Т-клетках, обработанных СD45RB/RO-связывающим химерным антителом, но не в контрольных Т-клетках.

Т-клетки, обработанные СD45RB/RO-связывающим химерным антителом, становятся дважды позитивными в отношении и CD4 и CD8

После стимуляции в Т-клетках происходит индукция и повышающая регуляция экспрессии нескольких локализованных на поверхности рецепторов, таких как CD25, CD152 (CTLA-4), CD154 (СD40-лиганд) и др. В противоположность этому, уровень экспрессии CD4 или CD8, вероятно, остается относительно постоянным. Получены воспроизводимые результаты, касающиеся значительного увеличения уровня обоих антигенов CD4 и CD8 на поверхности Т-клеток, обработанных CD45RB/RO-связывающим химерным антителом, но не на поверхности обработанных контрольным Ат Т-клетках после их активации. Появление дважды позитивной в отношении CD4/CD8 Т-клеточной популяции, вероятно, является результатом повышающей регуляции CD4 на CD8+-субпопуляции и наоборот, т.е. CD8 на CD4+-субпопуляции. Это контрастирует с относительно низким процентом дважды позитивных Т-клеток в контрольных культурах.

Высокий уровень экспрессии альфа-цепи рецептора IL-2, но очень низкий уровень экспрессии бета-цепи после обработки Т-клеток CD45RB/RO-связывающим химерным антителом

Известно, что Treg-клетки являются конститутивно позитивными в отношении CD25, т.е. альфа-цепи IL-2. Отсутствуют данные о регуляции других субъединиц тримерного рецептора IL-2 на Treg-клетках. При создании изобретения проведено сравнение экспрессии бета-цепи рецептора IL-2, например CD 122, на Т-клетках, активированных и размноженных в присутствии CD45RB/RO-связывающего химерного антитела или без него. Результаты свидетельствуют о том, что Т-клетки, обработанные CD4 5 RB/RO-связывающим химерным антителом, имеют примерно в 10 раз более низкий уровень экспрессии CD 122 по сравнению с Т-клетками в контрольных культурах. Это различие может свидетельствовать о том, что Treg-клеткам для пролиферации требуется фактор, отличный от IL-2.

Пример 8. Последовательности по изобретению (CDR-последовательности по изобретению подчеркнуты), смотри после формулы изобретения.

1. Связывающая молекула, которая является гуманизированным антителом, связывающимся с CD45RO и CD45RB, содержащая по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, которая включает последовательно расположенные гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, где CDR1 имеет аминокислотную последовательность Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH), CDR2 имеет аминокислотную последовательность Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG) и CDR3 имеет аминокислотную последовательность Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phc-Asp-Thr(SGPYAWFDT).

2. Связывающая молекула по п.1, которая включает

а) первый домен, включающий последовательно расположенные гипервариабельные участки CDR1, CDR2 и CDR3, где CDR1 имеет аминокислотную последовательность Asn-Tyr-Ile-Ile-His (NYIIH), CDR2 имеет аминокислотную последовательность Tyr-Phe-Asn-Pro-Tyr-Asn-His-Gly-Thr-Lys-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Gly (YFNPYNHGTKYNEKFKG) и CDR3 имеет аминокислотную последовательность Ser-Gly-Pro-Tyr-Ala-Trp-Phe-Asp-Thr (SGPYAWFDT); и дополнительно

б) второй домен, включающий последовательно расположенные гипервариабельные участки CDR1', CDR2' и CDR3' легкой цепи, где CDR1' имеет аминокислотную последовательность Arg-Ala-Ser-Gln-Asn-Ile-Gly-Thr-Ser-Ile-Ghi (RASQNIGTSIQ), CDR2' имеет аминокислотную последовательность Ser-Ser-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser (SSSESIS) и CDR3' имеет аминокислотную последовательность GIn-Gln-Ser-Asn-Thr-Trp-Pro-Phe-Thr (QQSNTWPFT).

3. Связывающая молекула по п.1 или 2, представляющая собой гуманизированное моноклональное антитело.

4. Связывающая молекула по п.2, представляющая собой полипептид, который имеет последовательность SEQ ID NO:1 и полипептид, который имеет последовательность SEQ ID NO:2.

5. Связывающая молекула по п.2, включающая полипептид, который имеет последовательность SEQ ID NO:3 и полипептид, который имеет последовательность SEQ ID NO:4.

6. Связывающая молекула по любому из пп.4 или 5, представляющая собой моноклональное антитело.

7. Связывающая молекула, представляющая собой гуманизированное антитело, которое связывается с CD45RO и CD45RB и включает полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, и полипептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8.

8. Антитело, которое связывается с CD45RO и CD45RB, включающее

полипептид, который имеет последовательность SEQ ID NO:9 и полипептид, который имеет последовательность SEQ ID NO:7,

полипептид, который имеет последовательность SEQ ID NO:9 и полипептид, который имеет последовательность SEQ ID NO:8,

полипептид, который имеет последовательность SEQ ID NO:10 и полипептид, который имеет последовательность SEQ ID N0:7, или

полипептид, который имеет последовательность SEQ ID N0:10 и полипептид, который имеет последовательность SEQ ID NO:8.

9. Полинуклеотид, кодирующий связывающую молекулу по любому из пп.1-8.

10. Полинуклеотид по п.9, кодирующий аминокислотную последовательность CDR1, CDR2 и CDR3, CDR1', CDR2' и CDR3' связывающей молекулы по п.2.

11. Полинуклеотид, кодирующий гипервариабельный участок легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO:1 и имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:5.

12. Полинуклеотид, кодирующий гипервариабельный участок тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO:2 и имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:6.

13. Полинуклеотид, кодирующий гипервариабельный участок легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8, и гипервариабельный участок тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10.

14. Полинуклеотид, имеющий

нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:11, кодирующую гипервариабельный участок тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO:9 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:13, кодирующую гипервариабельный участок легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO:7

15. Полинуклеотид, имеющий

нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:12, кодирующую гипервариабельный участок тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO:10 и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:14, кодирующую гипервариабельный участок легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO:8.

16. Экспрессионный вектор, включающий полинуклеотид по любому из пп.9-15.

17. Система экспрессии, включающая полинуклеотид по любому из пп.9-15, где система экспрессии или ее часть обладает способностью продуцировать полипептид по любому из пп.1-8, когда система экспрессии или ее часть присутствует в совместимой с ней клетке-хозяине.

18. Выделенная клетка-хозяин, включающая систему экспрессии по п.17.

19. Применение молекулы или гуманизированного антитела по любому из пп.1-8 для получения лекарственного средства для лечения аутоиммунных заболеваний, отторжения трансплантата, псориаза, воспалительного заболевания кишечника и аллергий.

20. Фармацевтическая композиция для лечения аутоиммунных заболеваний, отторжения трансплантата, псориаза, воспалительного заболевания кишечника и аллергий, включающая молекулу или гуманизированнос антитело по любому из пп.1-8 в сочетании по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.