Способ усиления мобилизации стволовых клеток
Владельцы патента RU 2330674:
ГУ Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН) (RU)
Изобретение относится к области экспериментальной медицины и может быть использовано для усиления мобилизации стволовых клеток. Для этого в условиях экстремальных воздействий или при патологических состояниях, сопровождающихся мобилизацией стволовых клеток, или в условиях воздействия на организм модификаторов функциональной активности стволовых клеток, вызывающих мобилизацию стволовых клеток в кровь, вводят гиалуронидазу внутрибрюшинно в дозе 500-1500 УЕ/кг в течение 2 дней 1 раз в сутки. Способ обеспечивает повышение уровня мобилизации стволовых клеток. 11 табл.
Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицине, конкретно к клеточным технологиям и фармакологии.
Известно, что экстремальные воздействия и развитие определенных заболеваний сопровождаются активацией механизмов адаптации «глубокого» резерва, связанных со стволовыми клетками (СК) [1, 2, 3, 4, 5]. При этом зачастую может происходить мобилизация в кровь тех или иных клеток-предшественников, способных в дальнейшем участвовать в регенерации пораженных органов-мишеней. Причем активация указанных механизмов в ряде случаев оказывается недостаточной для «успешной» адаптации организма [1, 4, 5].
Известны способы фармакологической мобилизации различных типов стволовых клеток, применяемые в эксперименте с целью разработки перспективных методов лечения заболеваний, с помощью различных цитокинов: гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) [1, 3, 6], фактора стволовой клетки (ФСК) [7], пептида-аналога SDF-1-фактора (СТСЕ-0214) [8] и пр. факторов (ГМ-ГСФ, ИЛ-2, ИЛ-8, ИЛ-11, MIP-1, 2, эритропоэтин, тромбопоэтин [6]). При этом самым распространенным (в связи с его эффективностью и безопасностью) является способ мобилизации СК с помощью Г-КСФ. В то же время для достижения более значимого мобилизирующего эффекта исследователи применяют и комбинации различных цитокинов [9]. Однако даже комплексное использование факторов, входящих в когорту, стимулирующих мобилизацию СК, дает весьма неоднозначные результаты [6].
Адекватный прототип авторами не обнаружен.
В связи с вышеизложенным усиление мобилизации СК при экстремальных воздействиях и определенных заболеваниях, а также при воздействиях различных фармакологических модификаторов функциональной активности СК представляется актуальной задачей, решение которой, в свою очередь, может стать важным этапом в повышении эффективности терапии различных заболеваний.
Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение уровня мобилизации стволовых клеток при экстремальных воздействиях, патологических состояниях и при введении в организм факторов, вызывающих мобилизацию стволовых клеток.
Поставленная задача достигается тем, что при экстремальных воздействиях и патологических состояниях, сопровождающихся мобилизацией стволовых клеток, либо при введении в организм факторов, вызывающих мобилизацию стволовых клеток, внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 2 дней вводят гиалуронидазу в дозе 500-1500 УЕ/кг.
Новым в предлагаемом способе является введение 1 раз в сутки в течение 2 дней гиалуронидазы в дозе 500-1500 УЕ/кг.
В настоящее время весьма перспективными для лечения различных заболеваний представляются способы клеточной терапии, в том числе и с помощью фармакологических агентов, способных регулировать функции стволовых клеток. Вместе с тем на сегодняшний день известна важная роль гиалуроновой кислоты (ГК) в регуляции функционального состояния различных типов стволовых клеток. ГК является наиболее распространенным гликозаминогликаном (ГАГ), участвующим в образовании межклеточного матрикса различных тканей, в том числе и костного мозга [10, 11, 12]. При этом стволовые клетки и клетки-предшественники различной степени зрелости in situ связаны с гиалуронатом через CD44 и RHAMM-рецепторы [13, 14]. Участие гиалуроновой кислоты в реализации процесса мобилизации СК до сих пор остается не изученным. Известен фермент, расщепляющий ГК - гиалуронидаза, введение которого способно нарушать энграфтинг экзогенных СК в костный мозг [13], но абсолютно не известна возможность гиалуронидазы влиять на выход клеточных элементов из органов гемопоэза в кровь.
Диапазон доз гиалуронидазы, предлагаемых в заявленном изобретении, был определен как эффективный и выявлен в отдельных сериях экспериментов. Отсутствие самостоятельного мобилизирующего эффекта гиалуронидазы в отношении СК было показано в предварительных экспериментах.
Факт применения гиалуронидазы с целью усиления мобилизации СК при экстремальных воздействиях и патологических состояниях, а также при воздействиях различных фармакологических модификаторов функциональной активности СК для специалиста не является очевидным и не вытекает явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют повысить эффективность способа мобилизации стволовых клеток, и предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение для создания новых эффективных способов клеточной терапии. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.
Исходя из вышеизложенного следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Способ осуществляют следующим образом.
Лабораторному животному (мыши) при экстремальном воздействии, либо при патологическом состоянии, сопровождающемся мобилизацией стволовых клеток, либо при введении в организм факторов, вызывающих мобилизацию стволовых клеток, внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 2 дней вводят гиалуронидазу в дозе 500-1500 УЕ/кг.
Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac в количестве 678 штук, массой 18-20 г. Мыши 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).
В качестве экстремальных воздействий были выбраны модели, абсолютно отличающиеся по вызывающим их причинам, различные по механизмам развивающихся изменений на разных уровнях организации, а также эффектам и исходам: иммобилизационный стресс (ИС), представляющий собой «ярко» выраженное гемопоэзстимулирующее воздействие, - 12-часовая иммобилизация мягкими вязками в положении лежа на спине [15] и цитостатическая миелосупрессия, вызванная однократным внутрибрюшинным введением максимально переносимой дозы циклофосфана (250 мг/кг) [16].
При этом в костном мозге и периферической крови на 3-и сутки при ИС и на 5-е сут при цитостатическом воздействии методом клонирования в полувязкой среде определяли содержание коммитированных мезенхимальных клеток-предшественников - фибробластных колониеобразующих единиц (КОЕ-Ф) и стволовых кроветворных клеток (СКК) - гранулоцитарно-эритро-макрофагально-мегакариоцитарных единиц (КОЕ-ГЭММ) [17], а также на 3-и сутки опыта с помощью метода лимитирующих разведений - количество мезенхимальных (истинных) стволовых клеток (МСК) [3, 18].
В качестве моделей патологических состояний были выбраны заболевания, занимающие основное место в структуре общей заболеваемости и социальной значимости. При этом выбранные модели заболеваний: постгипоксическая энцефалопатия [1], инфаркт миокарда [3] и хронический токсический гепатит [2] существенно отличаются между собой по этиологии и патогенезу. Указанное обстоятельство (в связи со схожестью многих звеньев патогенеза при различных заболеваниях и наличием единых регуляторных и адаптивных механизмов макроорганизма) дает возможность во многом экстраполировать получаемые на данных моделях результаты на большинство известных патологических состояний.
На данных моделях патологии в костном мозге и периферической крови в каждом случае в определенные сроки (указанные в конкретных примерах) при инфаркте миокарда с помощью метода лимитирующих разведений определяли количество МСК [3, 18], при экспериментальном гепатите оценивали содержание МСК и КОЕ-Ф [9], а при энцефалопатии определяли число МСК, СКК (КОЕ-ГЭММ) и КОЕ-Ф [3, 9, 18].
Для фармакологической мобилизации СК использовали: Г-КСФ в дозе 125 мкг/кг [1, 3], ФСК в дозе 50 мкг/кг [7], пептид-аналог SDF-1-фактора - СТСЕ-0214 в дозе 10 мг/кг [8] и совместное назначение Г-КСФ и ФСК в указанных дозах. Выбор цитокинов был основан на различных спектрах их специфической активности, механизмов действия, биологическом назначении и способности вызывать мобилизацию различных типов СК.
При этом при введении Г-КСФ, ФСК и при их совместном введении определяли количество МСК, КОЕ-Ф и СКК (КОЕ-ГЭММ) в костном мозге и периферической крови, а при введении СТСЕ-0214 только содержание СКК (КОЕ-ГЭММ).
Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вил-коксона-Манна-Уитни.
Пример 1.
Иммобилизационный стресс (ИС) у животных вызывали путем 12-часовой иммобилизации на спине с помощью мягких вязок. При этом опытным животным сразу после воздействия 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 500 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным внутрибрюшинно вводили 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора.
В ходе эксперимента иммобилизационный стресс на 3-и сутки после воздействия приводил к повышению в костном мозге количества КОЕ-Ф и СКК. При этом в периферической крови наблюдалось увеличение содержания стволовых кроветворных клеток до 191,7% от фона. В то же время введение гиалуронидазы в дозе 500 УЕ/кг достоверно увеличивало по отношению к контролю как КОЕ-Ф, так и СКК в периферической крови, а также приводило к возрастанию числа циркулирующих МСК до 200% от фона (табл.1).
Таким образом, двукратное введение гиалуронидазы в дозе 500 УЕ/кг на фоне моделирования иммобилизационного стресса приводило к возрастанию в периферической крови как мезенхимальных клеток-предшественников различной степени зрелости (в том числе МСК), так и стволовых кроветворных клеток.
| Таблица 1 Содержание различных типов стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при иммобилизационном стрессе и при введении 500 УЕ/кг гиалуронидазы на фоне иммобилизационного стресса (М±m) | ||||||
| КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов | КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. миелокариоцитов | СКК в костном мозге, на 105 миелокариоцитов | СКК в периферической крови, на 105 мононуклеаров | МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов | МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров | |
| фон | 5,4±0,21 | 0,57±0,1 | 7,8±0,41 | 2,4±0,7 | 12,0±3,0 | 9,0±3,0 |
| Контроль (ИС) | 7,2±0,53* | 0,71±0,2 | 10,1±0,3* | 4,6±0,2* | 14,0±4,0 | 13,0±3,0 |
| ИС + гиалуронидаза | 7,45±0,4* | 1,6±0,21*# | 9,85±1,2 | 5,87±0,5*# | 12,0±3,0 | 18,0±3,0* |
| * - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05 | ||||||
| # - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05 |
Пример 2.
Иммобилизационный стресс у животных вызывали путем 12-часовой иммобилизации на спине с помощью мягких вязок. При этом опытным животным сразу после воздействия 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1500 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным внутрибрюшинно вводили 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора.
Введение гиалуронидазы в дозе 1500 УЕ/кг при моделировании иммобилизационного стресса сопровождалось достоверным увеличением содержания КОЕ-Ф и СКК в периферической крови относительно контроля (до 253,5% и 130,7% соответственно) (табл.2).
Пример 3.
Миелосупрессию вызывали однократным внутрибрюшинным введением циклофосфана (ЦФ) в МПД. При этом опытным животным на фоне введения цитостатика 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 500 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным внутрибрюшинно вводили 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора.
Введение циклофосфана приводило к снижению содержания в костном мозге коммитированных мезенхимальных клеток-предшественников и, напротив, увеличению количества в гемопоэтической ткани СКК и МКС на 5-е сутки эксперимента. В периферической крови наблюдалось увеличение содержания КОЕ-Ф и стволовых кроветворных клеток. При этом назначение гиалуронидазы сопровождалось выраженным увеличением выхода коммитированных мезенхимальных клеток-предшественников и СКК (табл.3).
| Таблица 2 Содержание различных типов стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при иммобилизационном стрессе и при введении 1500 УЕ/кг гиалуронидазы на фоне иммобилизационного стресса (М±m) | ||||||
| КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов | КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. миелокариоцитов | СКК в костном мозге, на 105 миелокариоцитов | СКК в периферической крови, на 105 мононуклеаров | МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов | МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров | |
| фон | 5,4±0,21 | 0,57±0,1 | 7,8±0,41 | 2,4±0,7 | 12,0±3,0 | 9,0±3,0 |
| Контроль (ИС) | 7,2±0,53* | 0,71±0,2 | 10,1±0,3* | 4,6±0,2* | 14,0±4,0 | 13,0±3,0 |
| ИС + гиалуронидаза | 6,3±0,7 | 1,8±0,4*# | 9,0±1,4 | 6,0±0,41*# | 12,0±3,0 | 14,0±4,0 |
| * - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05 | ||||||
| # - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05 |
Таким образом, двукратное введение гиалуронидазы в дозе 500 УЕ/кг на фоне цитостатического воздействия приводило к возрастанию в периферической крови определенных типов стволовых клеток.
| Таблица 3 Содержание различных типов стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при цитостатическом воздействии и при введении 500 УЕ/кг гиалуронидазы на фоне миелосупрессии (М±m) | ||||||
| КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов | КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. миелокариоцитов | СКК в костном мозге, на 105 миелокариоцитов | СКК в периферической крови, на 105 мононуклеаров | МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов | МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров | |
| фон | 5,4±0,21 | 0,57±0,1 | 7,8±0,41 | 2,4±0,7 | 12,0±3,0 | 9,0±3,0 |
| ЦФ | 0,2±0,03* | 0,99±0,14* | 14,7±1,1* | 3,9±0,09* | 24,0±4,0* | 8,0±2,0 |
| ЦФ + гиалуронидаза | 0,4±0,08* | 2,4±0,6*# | 12,8±0,7* | 8,0±0,31*# | 22,0±6,0 | 12,0±4,0 |
| * - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05 | ||||||
| # - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05 |
Пример 4.
Миелосупрессию вызывали однократным внутрибрюшинным введением циклофосфана (ЦФ) в МПД. При этом опытным животным на фоне введения цитостатика 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1500 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным внутрибрюшинно вводили 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора.
Введение гиалуронидазы в дозе 1500 УЕ/кг приводило к увеличению количества КОЕ-Ф и СКК в костном мозге. При этом, однако, имела место мобилизация в периферическую кровь лишь СКК (до 194,9% от контроля), но на аналогичном уровне таковой при введении гиалуронидазы в дозе 500 УЕ/кг (табл.4).
Таким образом, двукратное введение гиалуронидазы в дозе 1500 УЕ/кг на фоне цитостатического воздействия приводило к возрастанию в периферической крови стволовых кроветворных клеток.
| Таблица 4 Содержание различных типов стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при цитостатическом воздействии и при введении 1500 УЕ/кг гиалуронидазы на фоне миелосупрессии (М±m) | ||||||
| КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов | КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. миелокариоцитов | СКК в костном мозге, на 105 миелокариоцитов | СКК в периферической крови, на 105 мононуклеаров | МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов | МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров | |
| фон | 5,4±0,21 | 0,57±0,1 | 7,8±0,41 | 2,4±0,7 | 12,0±3,0 | 9,0±3,0 |
| ЦФ | 0,2±0,03* | 0,99±0,14* | 14,7±1,1* | 3,9±0,09* | 24,0±4,0* | 8,0±2,0 |
| ЦФ + гиалуронидаза | 1,4±0,04*# | 1,7±0,47* | 14,5±1,2* | 7,6±0,4*# | 18,0±4,0 | 10,0±3,0 |
| * - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05 | ||||||
| # - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05 |
Пример 5.
Постгипоксическую энцефалопатию моделировали с помощью гермокамеры объемом 500 мл. Мыши помещались в гермокамеру, крышка закрывалась, и мыши оставались там до агонального судорожного припадка или остановки дыхания, определяемой визуально, в течение 10-15 секунд. После извлечения из гермокамеры и восстановления самостоятельного дыхания, через 5-10 минут, мыши вновь помещались в гермокамеру также до наступления агонального состояния (генерализованного судорожного припадка или остановки дыхания). При этом опытным животным сразу после моделирования энцефалопатии 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 500 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным внутрибрюшинно вводили 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора.
Развитие энцефалопатии на 5-е сутки опыта приводило к увеличению числа в костном мозге как мезенхимальных клеток-предшественников различной степени зрелости, так и еще в большей степени количества СКК. При этом статистически значимая мобилизация происходила только в отношении стволовых кроветворных клеток (до 327,5% от фона). Отмечалась и четкая тенденция к увеличению содержания МСК в периферической крови (до 166,7% от фона), однако статистической достоверности данные изменения не достигали. Введение гиалуронидазы увеличивало содержание КОЕ-Ф в гемопоэтической ткани, а также способствовало их усиленному выходу в кровь. Кроме того, фермент значительно повышал количество СКК в периферической крови и приводил к развитию феномена мобилизации МСК (табл.5).
| Таблица 5 Содержание различных типов стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при развитии энцефалопатии и при введении 500 УЕ/кг гиалуронидазы на фоне моделирования энцефалопатии (М±m) | ||||||
| КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов | КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. миелокариоцитов | СКК в костном мозге, на 105 миелокариоцитов | СКК в периферической крови, на 105 мононуклеаров | МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов | МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров | |
| фон | 8,7±0,68 | 1,34±0,1 | 9,1±0,63 | 1,4±0,6 | 31,0±4,0 | 12,0±3,0 |
| энцефалопатия (ЭП) | 17,2±1,3* | 2,4±1,0 | 29,8±3,4* | 8,87±1,2* | 59,0±9,0* | 20,0±4,0 |
| ЭП + гиалуронидаза | 28,9±2,7*# | 4,6±1,2*# | 25,3±1,7* | 16,0±2,6*# | 47,0±8,0 | 28,0±4,0* |
| * - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05 | ||||||
| # - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05 |
Пример 6.
Постгипоксическую энцефалопатию моделировали с помощью гермокамеры объемом 500 мл. Мыши помещались в гермокамеру, крышка закрывалась, и мыши оставались там до агонального судорожного припадка или остановки дыхания, определяемой визуально, в течение 10-15 секунд. После извлечения из гермокамеры и восстановления самостоятельного дыхания, через 5-10 минут, мыши вновь помещались в гермокамеру также до наступления агонального состояния (генерализованного судорожного припадка или остановки дыхания). При этом опытным животным сразу после моделирования энцефалопатии 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1500 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным внутрибрюшинно вводили 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора. Введение гиалуронидазы в дозе 1500 УЕ/кг сопровождалось увеличением в гемопоэтической ткани на 5-е сутки не только КОЕ-Ф, но и МСК, и также как при применении более низкой дозы способствовало их усиленному выходу в кровь (табл.6).
| Таблица 6 Содержание различных типов стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при развитии энцефалопатии и при введении 1500 УЕ/кг гиалуронидазы на фоне моделирования энцефалопатии (М±m) | ||||||
| КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов | КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. миелокариоцитов | СКК в костном мозге, на 105 миелокариоцитов | СКК в периферической крови, на 105 мононуклеаров | МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов | МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров | |
| фон | 8,7±0,68 | 1,34±0,1 | 9,1±0,63 | 1,4±0,6 | 31,0±4,0 | 12,0±3,0 |
| энцефалопатия (ЭП) | 17,2±1,3* | 2,4±1,0 | 29,8±3,4* | 8,87±1,2* | 59,0±8,0* | 20,0±4,0 |
| ЭП + гиалуронидаза | 26,2±2,0*# | 5,1±0,87*# | 30,4±3,0* | 18,2±2,45*# | 86,0±9,0 | 28,0±4,0* |
| * - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05 | ||||||
| # - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05 |
Таким образом, гиалуронидаза приводила к увеличению степени мобилизации всех изучаемых типов стволовых клеток на фоне развития неоднозначных изменений их содержания в костном мозге.
Пример 7.
Инфаркт миокарда моделировали внутривенным введением адреналина в дозе 0,25 мг/кг [3] в собственной модификации. При этом опытным животным сразу после моделирования энцефалопатии 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1000 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным внутрибрюшинно вводили 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора.
Моделирование инфаркта миокарда приводило к увеличению количества МСК в костном мозге и периферической крови. При этом, однако, введение гиалуронидазы более значительно усиливало выход МСК в периферическую кровь на фоне отсутствия изменений со стороны костномозгового пула МСК (табл.7).
| Таблица 7 Содержание различных типов стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при инфаркте миокарда и при введении 1000 УЕ/кг гиалуронидазы на фоне моделирования инфаркта миокарда (М±m) | ||
| МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов | МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров | |
| фон | 31,0±4,0 | 12,0±3,0 |
| Инфаркт миокарда (ИМ) | 78,0±10,0* | 46,0±8,0* |
| ИМ + гиалуронидаза | 74,0±12,0* | 82,0±12,0*# |
| * - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05 | ||
| # - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05 |
Таким образом, введение гиалуронидазы усиливало мобилизацию мезенхимальных стволовых клеток в периферическую кровь.
Пример 8.
У мышей хронический гепатит (ХГ) моделировали внутрижелудочным введением тетрахлоруглерода (ТХУ) в виде 20% раствора на оливковом масле в объеме 0,2 мл/мышь живого веса в течение трех недель дважды в неделю [2]. При этом опытным животным сразу после моделирования ХГ 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1000 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным внутрибрюшинно вводили 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора.
В контрольной группе было обнаружено увеличение количества в костномозговой ткани КОЕ-Ф на 7-е сутки после последнего введения ТХУ, в состав которых входят как предшественники стромальных элементов, так и истинные СК, что подтверждалось возрастанием числа МСК в гемопоэтической ткани в те же сроки наблюдения. Кроме того, отмечалось увеличение содержания клеток-предшественников фибробластов и МСК в периферической крови, свидетельствующее о мобилизации стволовых клеток различной степени зрелости при данном виде воздействия, представляющем по своей сути экстремальное воздействие. При этом введение гиалуронидазы сопровождалось увеличением в гемопоэтической ткани в исследуемые сроки КОЕ-Ф на фоне резкого возрастания числа КОЕ-Ф и МСК в периферической крови (табл.8).
| Таблица 8 Содержание различных типов стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при развитии хронического гепатита и при введении 1000 УЕ/кг гиалуронидазы на фоне моделирования гепатита (М±m) | ||||
| КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов | КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. миелокариоцитов | МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов | МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров | |
| фон | 15,17±1,3 | 6,5±0,99 | 24,0±4,0 | 31,0±7,0 |
| ХГ | 28,7±3,4* | 9,1±0,48* | 66,0±8,0* | 64,0±10,0* |
| ХГ + гиалуронидаза | 39,2±2,1*# | 14,09±0,7*# | 84,0±18,0* | 88,0±4,0*# |
| * - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05 | ||||
| # - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05 |
Таким образом, введение гиалуронидазы при экспериментальном гепатите приводило к увеличению выхода в кровь мезенхимальных клеток-предшественников различной степени зрелости.
Пример 9.
Опытным экспериментальным интактным животным на фоне введения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора («Нейпоген», Hoffman-la-Roche, Щвейцария) в дозе 125 мкг/кг 1 раз в сутки в течение 3 дней дополнительно 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 500 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным вводили подкожно гранулоцитарный колониестимулирующий фактор («Нейпоген», Hoffman-la-Roche, Щвейцария) в дозе 125 мкг/кг 1 раз в сутки в течение 3 дней в эквивалентном объеме (0,2 мл) и внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора.
В ходе эксперимента введение рчГ-КСФ приводило к снижению числа коммитированных клеток-предшественников в костном мозге на 4-е сутки после начала воздействия. При этом содержание МСК в костном мозге оставалось на уровне фоновых значений. Указанные изменения сопровождались достоверным увеличением в периферической крови числа МСК до 311,1% от фона, СКК до 201,6% от фона и КОЕ-Ф до 152,4% от фона. Дополнительное введение гиалуронидазы приводило к значительному накоплению МСК и КОЕ-Ф в костном мозге. Вместе с тем совместное применение рчГ-КСФ и гиалуронидазы сопровождалось существенно более выраженным возрастанием числа МСК (до 1000,0% от фона), СКК (до 386,6% от фона) и КОЕ-Ф (до 211,9% от фона) в периферической крови (табл.9).
Пример 10.
Опытным экспериментальным животным на фоне введения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора («Нейпоген», Hoffman-la-Roche, Щвейцария) в дозе 125 мкг/кг 1 раз в сутки в течение 5 дней дополнительно 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1500 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным вводили подкожно гранулоцитарный колониестимулирующий фактор («Нейпоген», Hoffman-la-Roche, Щвейцария) в дозе 125 мкг/кг 1 раз в сутки в течение 5 дней в эквивалентном объеме (0,2 мл) и внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 2 дней 0,5 мл физиологического раствора.
Совместное применение рчГ-КСФ и 1500 УЕ/кг гиалуронидазы сопровождалось более выраженным возрастанием числа МСК, СКК и КОЕ-Ф в периферической крови относительно контрольных животных, получавших только рчГ-КСФ (но менее значимым по сравнению с группой мышей, которым дополнительно вводили 500 УЕ/кг гиалуронидазы) (см. табл.9).
Таким образом, введение гиалуронидазы на фоне назначения рчГ-КСФ интактным животным значительно повышает степень мобилизации различных типов стволовых клеток костного мозга в периферическую кровь.
| Таблица 9 Динамика содержания стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при введении рчГ-КСФ (1) и совместном назначении рчГ-КСФ с 500 УЕ/кг (2) и 1500 УЕ/кг (3) гиалуронидазы (М±m) | ||||||
| КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов | КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. миелокариоцитов | СКК в костном мозге, на 105 миелокариоцитов | СКК в периферической крови, на 105 мононуклеаров | МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов | МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров | |
| фон | 3,17±0,48 | 7,0±0,37 | 14,3±2,1 | 7,0±0,98 | 28,0±4,0 | 9,0±5,0 |
| 1 | 2,0±0,26* | 10,67±0,7* | 12,6±1,2 | 14,1±2,3* | 22,0±4,0 | 28,0±4,0* |
| 2 | 7,5±0,76*# | 14,8±0,7*# | 16,31±4,5 | 27,2±1,4*# | 51,0±7,0*# | 90,0±26,0*# |
| 3 | 7,2±0,78*# | 15,1±0,84*# | 14,3±3,9 | 24,2±2,3*# | 37,0±12,0 | 62,0±18,0* |
| * - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05 | ||||||
| # - отмечена достоверность различий с показателями в группе животных, получавших только Г-КСФ, при р<0,05 |
Пример 10.
Интактным животным на фоне введения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора («Нейпоген», Hofrman-la-Roche, Щвейцария) в дозе 125 мкг/кг 1 раз в сутки в течение 3 дней совместно с внутрибрюшинным введением фактора стволовой клетки («Sigma», США) в дозе 50 мкг/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней дополнительно 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1000 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным вводили по аналогичным схемам только рчГ-КСФ и ФСК.
В ходе эксперимента на 4-е сутки после введения рчГ-КСФ и ФСК наблюдалось закономерное возрастание количества СК в периферической крови при изменениях неоднозначного характера со стороны их костномозговых пулов. При этом в большей степени отмечалось повышение числа циркулирующих коммитированных клеток-предшественников (КОЕ-Ф до 344,5% и СКК до 347% от фона), чем истинных (мезенхимальных) стволовых клеток (до 266,7% от фона). Дополнительное введение животным гиалуронидазы практически не оказывало влияния на содержание различных типов СК в гемопоэтической ткани по сравнению с контролем. Однако при этом имело место еще более выраженное возрастание числа родоначальных клеток в периферической крови. При этом максимальный уровень подъема отмечался, напротив, у наиболее примитивных - МСК (до 1088,2% от фона), чем у КОЕ-Ф (до 401,4% от фона) и СКК (до 502,0% от фона) (табл.10).
| Таблица 10 Динамика содержания стволовых клеток в костном мозге и периферической крови при введении рчГ-КСФ совместно с ФСК (1) и дополнительном введении 1000 УЕ/кг гиалуронидазы (2) (M±m) | ||||||
| КОЕ-Ф в костном мозге, на 250 тыс. миелокариоцитов | КОЕ-Ф в периферической крови, на 250 тыс. миелокариоцитов | СКК в костном мозге, на 105 миелокариоцитов | СКК в периферической крови, на 105 мононуклеаров | МСК в костном мозге, на 106 миелокариоцитов | МСК в периферической крови, на 106 мононуклеаров | |
| фон | 3,17±0,48 | 7,0±0,37 | 14,3±2,1 | 7,0±0,98 | 28,0±4,0 | 9,0±6,0 |
| 1 | 2,64±0,14* | 24,12±1,0* | 19,6±3,4 | 24,3±1,8* | 34,0±6,0 | 24,0±4,0* |
| 2 | 6,4±0,72*# | 28,1±1,09* | 14,4±0,78 | 36,4±2,3*# | 44,0±8,0* | 98,0±22,0*# |
| * - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05 | ||||||
| # - отмечена достоверность различий с контролем при р<0,05 |
Таким образом, введение гиалуронидазы при ее совместном назначении с рчГ-КСФ и ФСК приводило к усилению мобилизации СК, причем в большей степени наиболее низкодифференцированных.
Пример 11.
Интактным животным на фоне однократного внутривенного введения белка СТСЕ-0214 (пептида-аналога SDF-1-фактора) в дозе 10 мг/кг («Sigma», США) дополнительно 1 раз в сутки в течение 2 дней внутрибрюшинно вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ, Россия) в дозе 1000 УЕ/кг (в 0,5 мл физиологического раствора). Контрольным животным в эквивалентном объеме (0,2 мл) внутривенно и 0,5 мл внутрибрюшинно вводили физиологический раствор.
На 3-и сутки после начала эксперимента в костном мозге регистрировалось увеличение числа стволовых кроветворных клеток (КОЕ-ГЭММ). В то же время имело место и увеличение количества данных элементов в периферической крови (до 433,3% от фона). Введение гиалуронидазы отменяло влияние фактора на содердание СКК в костном мозге, но приводило к значительно более выраженному увеличению числа данных родоначальных клеток в периферической крови, достигающему 747,6% от фона (табл.11).
| Таблица 11 Динамика содержания стволовых кроветворных клеток в костном мозге и периферической крови при введении СТСЕ-0214 (1) и при дополнительном введении 1000 УЕ/кг гиалуронидазы (2) (M±m) | ||
| СКК в костном мозге, на 105 миелокариоцитов | СКК в периферической крови, на 105 мононуклеаров | |
| фон | 5,8±0,97 | 2,1±0,24 |
| 1 | 8,4±0,36* | 9,1±2,3* |
| 2 | 7,62±1,2 | 15,7±1,07*# |
| * - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при р<0,05 | ||
| # - отмечена достоверность различий с показателями в группе животных, получавших только Г-КСФ, при р<0,05 |
Таким образом, гиалуронидаза усиливала мобилизирующий эффект субстанции СТСЕ-0214 (пептида-аналога SDF-1-фактора) в отношении стволовых кроветворных клеток.
В целом, исходя из полученных данных, следует, что при введении гиалуронидазы на фоне моделирования экстремальных воздействий и при патологических состояниях различного генеза, а также при введении в организм веществ, вызывающих выход СК в кровь, наблюдается значительное возрастание уровня мобилизированных стволовых клеток. Причем в большей степени происходит усиление мобилизирующего эффекта в отношении наиболее ранних родоначальных элементов - мезенхимальных (истиных) стволовых клеток. При этом механизмом указанного специфического действия данного фермента, очевидно, является разрушение/ослабление связей СК с одним из основных компонентов межклеточного матрикса - гиалуроновой кислотой, связанной in situ со стволовыми клетками посредством специфических рецепторов.
Предлагаемый способ позволяет существенно увеличить уровень мобилизации различных типов стволовых клеток при экстремальных воздействиях и патологических состояниях, а также повысить степень мобилизирующего эффекта веществ, способных стимулировать выход СК в кровь, путем дополнительного введения гиалуронидазы.
Способ усиления мобилизации стволовых клеток, характеризующийся тем, что в условиях экстремальных воздействий или при патологических состояниях, сопровождающихся мобилизацией стволовых клеток, или в условиях воздействия на организм модификаторов функциональной активности стволовых клеток, вызывающих мобилизацию стволовых клеток в кровь, вводят гиалуронидазу внутрибрюшинно в дозе 500-1500 УЕ/кг в течение 2 дней 1 раз в сутки.
