Способ диагностики степени эндотелиальной дисфункции у больных гипертонической болезнью, осложненной ишемическим инсультом

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и неврологии. Для осуществления способа диагностики степени эндотелиальной дисфункции у больных гипертонической болезнью, осложненной ишемическим инсультом, центрифугируют периферическую венозную кровь больного на градиенте плотности фиколл-верографин р=1,077 и с помощью фазово-контрастной микроскопии осуществляют подсчет в 10 полях зрения количества спущенных эндотелиоцитов на 100 лимфоцитов. При значении количества спущенных эндотелиоцитов, равном 1-3 клеткам, расценивают дисфункцию эндотелия как 1 степень, 4-9 - как 2 степень, 10-16 - как 3 степень, 17 и больше - как 4 степень; крайне тяжелому поражению эндотелия соответствует количество спущенных эндотелиоцитов 25 и больше. Использование изобретения позволяет эффективно оценить степень эндтелиальной дисфункции у пациентов с гипертонической болезнью, осложненной ишемическим инсультом, что дает возможность начать раннюю патогенетическую гипотензивную терапию, направленную на коррекцию артериального давления и дисфункции эндотелия, а также оценить эффективность применяемой терапии. 3 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и неврологии, и может быть использовано для оценки степени эндотелиальной дисфункции у пациентов с гипертонической болезнью, осложненной ишемическим инсультом.

Гипертоническая болезнь рассматривается как основной предиктор острого нарушения мозгового кровообращения. Главные осложнения гипертонической болезни, инфаркт миокарда и острое нарушение мозгового кровообращения (в 78% случаев ишемический инсульт), являются тромботическими - парадокс гипертонии или Birmingham paradox.

Основной составляющей гипертонической болезни на современном этапе развития медицины представляется эндотелиальная дисфункция. Эндотелий, являясь пограничным органом между кровью и тканями органов, обладает различными функциями, регулирующими гомеостаз организма (иммунитет, гемостаз, вазоконстрикция и др.). Нарушение функционирования эндотелия приводит к запуску каскада патологических реакций, которые усугубляют друг друга по механизму "замкнутого круга". Прогрессирование эндотелиальной дисфункции и апоптотические процессы, происходящие в условиях гипоксии, обусловленной изменением эластичности сосудистой стенки при гипертонической болезни и остром нарушении мозгового кровообращения, сопровождаются повышением концентрации маркеров дисфункции и повреждения эндотелия, маркеров апоптоза в периферической крови. На современном этапе существуют некоторые трудности, сопряженные с определением концентрации маркеров эндотелиальной дисфункции, таких как оксид азота. Это связано с чрезвычайной нестойкостью молекулы NO. NO-продуцирующая активность по биохимическим критериям может быть оценена лишь косвенно - путем регистрации метаболитов NO, что приближенно отражает действительность (Курбанов, Р.Д. Гуморальные маркеры дисфункции эндотелия при эссенциальной гипертонии / Р.Д.Курбанов, М.Р.Елисеева. P.P.Турсунов и др. // Кардиология - 2003 - №7 - С.61-64).

Большинство исследователей, изучающих эндотелиальную дисфункцию при различных кардиоваскулярных заболеваниях, предлагают оценивать количество десквамированных эндотелиоцитов в периферической крови.

Существуют различные подходы к определению количества циркулирующих эндотелиоцитов в крови. Известны способы количественного определения (Hiadovec, J. Circulating endothelial cells in acute myocardial infarction and angina pectoris / J.Hiadovec, I.Prerovsky, V.Stanek, J.Fabian // Klin Wochenschr - 1978 - №56 - P.1033-1036), иммуноцитометрические и иммунномагнитные способы (Bory, M. Detection des cellules endotheliales circulantes: un nouveau test diagniostique de l' angor de repos / M.Bory, J.Sampol, S.Yvorra et al. // Arch. Mal. Coeur. Vaiss. - 1995 - Vol.88 - №12 - P.1827-1831).

Известен способ Dignat-George F. et al. (Dignat-George, F. Circulating endothelial cells in vascular disorders: new insights into an old concept / F.Dignat-George, J.Sampol // Eur J Haematol - 2000 - N.65 - P.215-220), заключающийся в том, что эндотелиальные клетки крови отделяют с помощью иммунномагнитного метода с использованием CD146, затем посредством флюорисцентной микроскопии проводят идентификацию клеток по морфологии и связыванию CD146.

Недостаток способа: несмотря на высокую чувствительность способа он является дорогостоящим, трудо- и времязатратным, что делает его малодоступным к применению в клиниках нашей страны.

Существует способ оценки эндотелиальной дисфункции в зависимости от содержания sPECAM-1 (молекула тромбоцитарно-эндотелиоцитарной клеточной адгезии) в плазме крови методом ИФА (human sPECAM-1 ELISA, Bender Med Systems GmbH, Vienna, Austria). При гипертонической болезни концентрация sPECAM-1 увеличивается в несколько раз по сравнению с нормой (Muller, W.A. PECAM-1 is required for transendothelial migration of leukocytes / W.A.Muller, S.A.Weigl, X.Deng, D.M.Phillips // J. Exp.Med. - 1993 - N.178 - P.449-460).

Этот способ признается эффективным, однако стоимость реактивов настолько высока, что внедрение в широкую практику невозможно.

Известен способ Hiadovec J. (1978), заключающийся в выделении эндотелиоцитов вместе с тромбоцитами с последующим осаждением тромбоцитов при помощи АДФ. Забор венозной крови проводят в объеме 4-5 мл, в качестве стабилизатора используют 3,8% раствор цитрата натрия из расчета 1:9. Затем с помощью центрифугирования 1000 оборотов/мин в течение 10 мин отделяют тромбоцитарную массу. Супернатант собирают и вновь центрифугируют при тех же условиях 20 мин. К осадку добавляют 0,1 мл физиологического раствора. Подсчет осуществляют в двух сетках камеры Горяева с последующим пересчетом на 1 мл плазмы.

Недостатки данного способа диагностики: трудоемкость, выделение эндотелиоцитов в тромбоцитарной фракции, определение нормального количества эндотелиоцитов, циркулирующих в периферической крови, в то время как инструментально не подтверждается эндотелиальная дисфункция.

Наиболее близким к заявленному способу из описанных в уровне техники источников информации является способ диагностики эндотелиальной дисфункции у женщин (Патент РФ №2234094; G01N 33/49, А61В 5/02, 10.08.2004), заключающийся в предварительном перед забором крови создании на 4 минуты положительного давления в области плеча, превышающего систолическое артериальное давление на 40-50 мм рт.ст. с последующим определением количества десквамированных эндотелиоцитов в периферической крови способом Hiadovec J. (1978). Эндотелиальную дисфункцию диагностируют при значении показателя, превышающем 2,77·10⁵ в 1 л плазмы.

Недостатком способа являются трудоемкость и длительность, что делает способ мало применимым в условиях клинико-лабораторных исследований.

Задача изобретения: снижение риска развития осложнений гипертонической болезни, в том числе повторных.

Поставленную задачу осуществляют за счет того, что после центрифугирования периферической крови больного на градиенте плотности фиколл-верографин ρ=1,077 с помощью фазово-контрастной микроскопии осуществляют подсчет в 10 полях зрения количества спущенных эндотелиоцитов на 100 лимфоцитов; при значении количества спущенных эндотелиоцитов, равном 1-3 клеткам, расценивают дисфункцию эндотелия как 1 степень, 4-9 - как 2 степень, 10-16 - как 3 степень, 17 и больше - как 4 степень; крайне тяжелому поражению эндотелия соответствует количество спущенных эндотелиоцитов 25 и больше.

Способ осуществляют следующим образом: забор венозной крови в объеме 5 мл проводят толстой иглой из локтевой вены пациента в пластмассовую пробирку с рисками, содержащую 0,15 мл гепарина; затем тщательно перемешивают кровь с гепарином в пробирке. Допустимо хранение пробирки с кровью в холодильнике при +5С° в течение 3-4 часов. В условиях лаборатории проводят повторное ресуспензирование крови в пробирке.

Для выделения лимфоцитарной фракции периферической крови используют градиент плотности фиколл-верографин. Для этого в отдельную пластмассовую пробирку вносят 2 миллилитра фиколл-верографина (Pharmacia hemical, Uppsala, Sweden) плотностью ρ=1.077; после чего по стенке пробирки осторожно, медленно дозатором на фиколл-верографин наслаивают 4 мл ресуспензированной крови, затем центрифугируют при комнатной температуре в течение 15 минут со скоростью 3000 оборотов/мин.

После центрифугирования на границе раздела фаз пастеровской пипеткой собирают кольцо клеток в отдельную пластмассовую пробирку. Пробирку с выделенным клеточным кольцом повторно центрифугируют при комнатной температуре в течение 5 минут со скоростью 3000 оборотов/мин. После центрифугирования убирают супернатант, к осадку добавляют 500 мкл PBS (фосфатный буфер) или раствора Хенкса, тщательно ресуспензируют дозатором с большим наконечником.

Перед микроскопированием на предварительно обезжиренное предметное стекло наносят 50 мкл суспензии клеток, на покровное стекло - небольшое количество эмерсионного масла.

Микроскопируют с использованием фазово-контрастной насадки; увеличение ×900. В поле зрения микроскопа видны эндотелиоциты (клетки полигональной формы, размером 20-50 микрометров), лимфоциты (клетки округлой формы размером 9-10 микрометров).

Исследование количества спущенных эндотелиоцитов проведены в периферической крови больных гипертонической болезнью, осложненной ишемическим инсультом (110 человек), и больных гипертонической болезнью (50 человек) без сердечно-сосудистых катастроф в анамнезе (табл.1).

Таблица 1
Содержание спущенных эндотелиоцитов в периферической крови пациентов с осложненной и неосложненной гипертонической болезнью
Исследуемый параметр	Количество эндотелиоцитов, М±m
Больные гипертонической болезнью, осложненной инсультом	Больные гипертонической болезнью без сердечно-сосудистых катастроф
Спущенные эндотелиоциты	12,83±0,54	1,54±0,15
р<0,001 по сравнению с контрольной группой.

Принимая во внимание литературные данные, динамику изменения содержания спущенных эндотелиоцитов в периферической крови больных гипертонической болезнью, осложненной и не осложненной инсультом, а также высокие корреляционные отношения (табл.3) с другим гуморальным маркером эндотелиальной дисфункции sPECAM-1, нами разработана шкала экспресс-диагностики степени эндотелиальной дисфункции (табл.2).

Таблица 2
Шкала оценки степени эндотелиальной дисфункции по количеству спущенных эндотелиоцитов в мазке лимфоцитарной фракции периферической крови больных гипертонической болезнью, осложненной инсультом
Степень выраженности эндотелиальной дисфункции	Количество спущенных эндотелиоцитов
1 степень	1-3
2 степень	4-9
3 степень	10-16
4 степень	≥17

Крайне тяжелому поражению эндотелия соответствует количество спущенных эндотелиоцитов ≥25.

Мы выявили высокие корреляционные отношения (0,97) между содержанием клеточных (слущенные эндотелиоциты) и гуморальных (sPECAM-1) маркеров эндотелиальной дисфункции. Для расчета коэффициента корреляции мы использовали параметрический корреляционный анализ Пирсона.

Таблица 3
Корреляционный анализ между клеточными и гуморальными маркерами эндотелиальной дисфункции
Изучаемый параметр	Показатель корреляции
Количество спущенных эндотелиоцитов
Количество спущенных эндотелиоцитов	1
концентрация sPECAM-1	0,967

Приводим примеры - выписки из истории болезни.

Пример 1

Больной М., 57 лет, и/б №19390-2005. ОНМК по ишемическому типу в бассейне правой среднемозговой артерии с левосторонним гемипарезом. Фон: Гипертоническая болезнь III, риск 4.

Из анамнеза: около 15 лет страдает гипертонической болезнью, максимальные цифры артериального давления 180/100 мм рт.ст, «среднее» артериальное давление 150/95 мм рт.ст. Регулярную гипотензивную терапию не получал. Осуществлял прием лекарственных средств (капотен, коринфар) по потребности (выраженная головная боль, тошнота, головокружение, «мушки перед глазами»).

Поступил в тяжелом состоянии через 1 час после возникновения неврологической симптоматики.

На момент поступления: артериальное давление 210/100 мм рт.ст., ритм синусовый с ЧСС 80 в мин, левосторонний гемипарез, гипестезия лица слева.

В биохимическом анализе крови: гиперхолестеринемия (8,3 ммоль/литр), гиперфибриногенемия (6,22), резкая тромбинемия, угнетение фибринолиза.

По содержанию спущенных эндотелиоцитов в периферической крови больного М. диагностируется 4 степень эндотелиальной дисфункции (19 спущенных эндотелиоцитов).

На 7 сутки госпитализации: на фоне стандартной нейротропной и гипотензивной терапии (периндоприл 4 мг 1 таб.×2 раза/день, гипотиазид 12,5 мг/день) состояние средней степени тяжести, артериальное давление 130/80 мм рт.ст., ЧСС 75 в мин, сила в левой руке восстановлена (5 баллов), в левой ноге - 3 балла. По лабораторным анализам: 3 степень эндотелиальной дисфункции (13 спущенных эндотелиоцитов).

20 сутки госпитализации: состояние удовлетворительное, неврологическая симптоматика регрессировала, АД 130/70 мм рт.ст., ЧСС 70 в мин. Лабораторные показатели: 2 степень эндотелиальной дисфункции (6 спущенных эндотелиоцитов).

Эти результаты свидетельствуют об обратимости дисфункции эндотелия при патогенетической гипотензивной терапии, а также о том, что репарационный период после действия окислительного стресса не ограничивается 20 днями госпитализации.

Пример 2

Больная С., 52 года, и/б №30482-2005. ОНМК по ишемическому типу в бассейне правой средне-мозговой артерии с левосторонним гемипарезом. Фон: Гипертоническая болезнь III, риск 4.

Из анамнеза: гипертоническая болезнь более 10 лет, АД максимальное 160/100 мм рт.ст., АД «среднее» 130/80 мм рт.ст. Регулярно принимала эналаприл в дозе 10 мг 1 таб.×2 раз/день.

При поступлении в стационар: АД 140/90 мм рт.ст., ритм синусовый с ЧСС 76 в мин, головная боль, левосторонний гемипарез, гипестезия слева, сглажена левая носогубная складка.

Биохимический анализ крови: дислипидемия за счет увеличения концентрации β-липопротеидов; фибриногенемия (4,66 мг/л), нарушение фибринолиза.

Лабораторные показатели: количество спущенных эндотелиоцитов - 9 (2 степень эндотелиальной дисфункции).

Проводили стандартную нейротропную терапию, гипотензивную - периндоприл 4 мг 1 таб. в день, гипотиазид 12,5 мг /день.

7 сутки госпитализации: состояние средней степени тяжести. Сохраняется снижение силы в левой нижней конечности до 4 баллов, АД 120/80 мм рт.ст., ЧСС 70 в мин. Лабораторно: количество спущенных эндотелиоцитов - 4 (2 степень эндотелиальной дисфункции).

20 сутки госпитализации: состояние удовлетворительное, неврологическая симптоматика полностью регрессировала, АД 120/70 мм рт.ст., ЧСС 70 в мин. По лабораторным показателям: 2 степень эндотелиальной дисфункции (4 спущенных эндотелиоцита).

Таким образом, после восстановления больной неврологическая симптоматика регрессировала, улучшились показатели функции эндотелия, однако сохраняется поражение сосудистой стенки, которое не оказывает значительного влияния на фоне проводимой терапии на общее состояние пациентки.

Пример 3.

Больная Б., 60 лет, и/б №31687-2004. Повторное ОНМК по ишемическому типу в бассейне правой среднемозговой артерии с левосторонним гемипарезом. Фон: гипертоническая болезнь III, риск 4. Дисциркуляторная энцефалопатия III (смешанного генеза: гипертонического, дисметаболического).

Поступила в крайне тяжелом состоянии: оглушение I-II ст, контакт затруднен, дизартрия, адверсия взора вправо, левосторонний гемипарез; АД 180/100 мм рт.ст., ритм синусовый с ЧСС 90 в мин.

Со слов родственников, страдает гипертонической болезнью около 20 лет, АД максимальное 220/120 мм рт.ст., АД «среднее» 160/100 мм рт.ст. Предыдущее ОНМК в 2003 году на фоне АД 220/120 мм рт.ст. За АД не следила, гипотензивные препараты (адельфан) принимала редко.

Биохимический анализ крови: гиперхолестеринемия (8,7 ммоль/литр), гиперфибриногенемия (7,2 мг/литр), гипертромбинемия, выраженное угнетение фибринолиза.

Лабораторно: 28 спущенных эндотелиоцитов (крайне тяжелое поражение эндотелия).

Проводили интенсивную нейротропную терапию, инфузионную сердечнососудистую (поляризующая смесь с магнезией), через установленный желудочный зонд - эналаприл 20 мг 1 таб.×2 раза/день.

7 сутки госпитализации: отрицательная динамика состояния больной, оглушение III ст., нарастание общемозговых симптомов, выраженный эндотоксикоз, АД 140/100 мм рт.ст., ЧСС 100 в мин, глубокий левосторонний гемипарез. Лабораторно: 35 спущенных эндотелиоцитов (крайне тяжелое поражение эндотелия).

20 сутки госпитализации: АД 140/90 мм рт.ст., ЧСС 66 в мин, оглушение III ст., взор не фиксирует, прежняя очаговая и общемозговая симптоматика, менингиальных знаков нет. Лабораторно: 48 спущенных эндотелиоцитов.

На 23 сутки госпитализации больная скончалась. Патолого-анатомический диагноз: Повторное ОНМК по ишемическому типу. Инфаркт до 2/3 объема правой гемисферы в височно-затылочной области. Отек головного мозга, дислокация ствола головного мозга. Генерализованный атеросклероз сосудов.

В случае больной изначально и на протяжении стационарного лечения диагностировали крайне тяжелое поражение.

Использование заявляемого способа позволяет эффективно и с небольшими затратами оценить степень эндотелиальной дисфункции у пациентов с гипертонической болезнью, осложненной ишемическим инсультом, что дает возможность начать раннюю патогенетическую гипотензивную терапию, направленную на коррецию артериального давления и дисфункции эндотелия, а также оценить эффективность применяемой терапии по количеству содержания спущенных эндотелиоцитов, в конечном счете, способ позволяет снизить риск инвалидизации и развития повторных сосудистых катастроф.

Способ диагностики эндотелиальной дисфункции у больных гипертонической болезнью, осложненной ишемическим инсультом, включающий забор периферической венозной крови у больного в объеме 5 мл, отличающийся тем, что после центрифугирования периферической крови больного на градиенте плотности фиколл-верографин ρ=1,077 с помощью фазово-контрастной микроскопии осуществляют подсчет в 10 полях зрения количества спущенных эндотелиоцитов на 100 лимфоцитов; при значении количества спущенных эндотелиоцитов равному 1-3 клеткам расценивают дисфункцию эндотелия как 1 степень, 4-9 - как 2 степень, 10-16 - как 3 степень, 17 и больше - как 4 степень; крайне тяжелому поражению эндотелия соответствует количество спущенных эндотелиоцитов 25 и больше.