Способ получения реактива для определения бактериальных эндотоксинов

Настоящее изобретение относится к получению реактивов, чувствительных к эндотоксинам грамотрицательных бактерий и предназначено для контроля допустимого содержания эндотоксина в различных средах, включая пищевое сырье. Способ включает взятие гемолимфы крабов рода Paralithodes, ее консервацию, выделение амебоцитов из гемолимфы путем центрифугирования, выделение ферментов амебоцитов разрушением их оболочек с последующим центрифугированием и лиофильной сушкой лизата. Разрушение оболочек амебоцитов проводят диализом против подщелаченной до рН 8,0 очищенной депирогенизированной воды в течение 24 часов при температуре 4-6°С со сменой воды через 12 ч. Перед лиофильной сушкой в лизат вводят 25%-ный раствор сульфата магния. Способ позволяет использовать в качестве сырья гемолимфу промысловых животных, обитающих у берегов России, причем сами животные после взятия гемолимфы поступают на переработку. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

 

Настоящее изобретение относится к химии биологически активных веществ белковой природы, точнее к получению реактивов для качественного и количественного определения эндотоксинов грамотрицательных бактерий.

Сущность изобретения сводится к разработке способа получения лиофилизированного лизата амебоцитов гемолимфы краба рода Paralithodes, который может быть использован в качестве чувствительного реактива для определения бактериальных эндотоксинов в различных средах.

Реактивы для определения бактериальных эндотоксинов в настоящее время получают из мечехвостов Limulus polyphemus (LAL-реактив, Limulus Amebocite Reagent), Tachipleus tridentates (TAL-реактив) и других видов. Эти реактивы нашли широкое применение в медицине и фармацевтике для проведения экспресс-анализа на содержание эндотоксинов в различных субстанциях и готовых препаратах. В комплект соответствующего теста для проверки среды на эндотоксин, например, LAL-теста, кроме LAL-реактива входят контрольный стандарт эндотоксина для построения калибровочной кривой и апирогенная вода для проведения реакций. LAL-тест может также использоваться для контроля качества продукции или сырья в пищевой промышленности. В настоящее время такой контроль осуществляется путем определения микробной обсемененности (традиционный тест), требующей значительных затрат времени и специально оборудованной лаборатории.

Для производства требуемых реактивов в настоящее время используются пять современных видов мечехвоста (класс морских членистоногих, подтип хелицеровых), обладающих механизмом коагуляции гемолимфы в ответ на попадание в нее эндотоксинов. Последние представляют собой липополисахариды, являющихся вместе с фосфолипидами и белками составными частями наружных мембран (оболочек) грамотрицательных бактерий, определяющими их важнейшие свойства, в частности взаимодействие бактерий с высшими организмами. В биосреды они попадают в результате процессов обсеменения бактериями из внешней среды.

Однако мечехвосты обитают только на мелководье теплых морей у берегов южной части Северной Америки (Атлантический океан, 1 род, 1 вид), Восточной и Юго-Восточной Азии и прилегающих островов (1 род, 4 вида); их запас ограничен. Кроме того, несмотря на то, что от животных отбирается только часть гемолимфы и они возвращаются в море для восстановления количества и качества последней, их смертность в результате операции по взятию гемолимфы увеличивается на 3-10%. К снижению запаса мечехвостов также ведет отлов их на сувениры и в качестве пищевого деликатеса. Все это приводит к необходимости ограничения вылова этих видов.

Потребность в LAL-реактиве и его аналогах постоянно увеличивается как за счет повышения требований к качеству инфузионных лекарственных препаратов и субстанций для их изготовления, так и к сырью для получения пищевых продуктов (введение системы управления качеством продукции на основе принципов ХАССП [1]). Для обеспечения работы контрольных лабораторий ведется как разработка физико-химических методов определения эндотоксинов, так и биотестов на основе сырья, способного, если не заменить мечехвоста, то хотя бы снизить нагрузку на существующий запас реликтовых животных. Поэтому проводятся исследования, в которых in vivo и in vitro исследуется эффект эндотоксина на коагуляционные системы различных беспозвоночных. Например, еще в работе [2], приведены данные по изучению свойств гемолимфы корнеголовых паразитов ракообразных, к которым относится, например Sacculina carcini.

В российской экономической зоне в Охотском море и северо-западной части Берингова моря у равношипого краба Litodes aequispina, обитающего на глубинах 120-830 м, встречается относящийся к этой группе паразит Briarosaccus callosus (Boschma). Оцененная к настоящему времени величина промыслового запаса краба-хозяина этого паразита в Охотском море составляет около 25 тыс. т при площади ареала примерно 100 тыс.кв.км. В Беринговом море запас значительно ниже. Зараженность этим паразитом равношипого краба составляет примерно 4%, т.е. запас В. callosus при средней массе краба 3 кг можно примерно оценить в 1000 т, что в пересчете на самого паразита составляет не более 100 т. Такого количества явно недостаточно для промышленной переработки. Поэтому внимание и было обращено на промысловые виды рода Paralithodes, также обладающие защитным механизмом гелирования гемолимфы с несколько менее выраженной активностью, но при существенно (в тысячи раз) большем промысловом запасе животных (Охотское и Баренцево моря).

Эксперименты, выполненные авторами, показывают, что при более низкой чувствительности к эндотоксину "сырого" лизата, получаемого из гемолимфы указанных выше животных (примерно на порядок ниже, чем нижний предел чувствительности LAL-реактива, 0,5 ЕЭ/мл), последний без разработки специальных мер повышения чувствительности может быть использован в пищевой промышленности, где соответствующий показатель достаточно обеспечить, например, в пределах требуемой кратности разведения реактива 10-5-2,5 ЕЭ/мл [3].

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения LAL-реактива из гемолимфы мечехвоста, описанный в часто цитируемой в патентной литературе по LAL-тесту работе [4] (Levin J., Bang F.B., 1964). Гемолимфа в лабораторных экспериментах бралась пункционной иглой из полости сердца животного и помещалась в стеклянный сосуд центрифуги, содержавший антикоагулянт - 0.125% раствор N-этиленмаленимида в 3%-ом апирогенном растворе натрия хлорида при температуре 42°С при соотношении гемолимфа-антикоагулянт 1:1. Затем вся смесь подогревалась до 42°С в течение 8 мин и 10 мин центрифугировалась при перегрузке 150 g. Супернатант удалялся декантацией, а отфильтрованные амебоциты повторно заливались антикоагулянтом. Клетки вновь отделялись центрифугированием при том же режиме, а затем заливались апирогенным 0,9% раствором натрия хлорида, после чего смесь разливалась по апирогенным пластиковым пробиркам емкостью 50 мл. Промытые клетки вновь ценрифугировались при 150 g. После отделения супернатанта разрушались с помощью апирогенной воды для инъекций в отношении 7 мл воды на 3 мл амебоцитов. После перемешивания с помощью мешалки в течение 10-15 секунд смесь оставлялась на 24 ч при температуре 1-5°С для полного разрушения оболочек, после чего их части осаждались центрифугированием при 1500 g в течение приблизительно 15 минут. Лизат фильтровался и хранился при температуре 1-5°С. В цитируемой статье были только заложены основы промышленного получения LAL-реактива, причем первичная переработка велась при достаточно высоких температурах, свойственных среде обитания этих животных.

Детально вопрос был проработан в патенте США 3915805 (Levin J., 1975, [5]), где был описан метод количественного определения эндотоксина в биосредах и способ получения LAL-реактива, до сих пор лежащий в основе его производства. Способ включает консервирование гемолимфы мечехвоста рода Limulus, выделение из нее центрифугированием амебоцитов, их разрушение с помощью осмотического шока с последующим центрифугированием, экстракцию хлороформом и лиофильную сушку лизата.

Описанный способ предполагает использование для получения чувствительного реактива только мечехвоста и на начальной стадии переработки гемолимфы реализуется при температуре 42°С, что недопустимо при работе с холодолюбивыми крабами рода Paralithodes. Кроме того, оболочки амебоцитов этого рода не разрушаются указанным выше способом.

Современное состояние вопроса, подробности создания LAL-теста, развития метода диагностики и получения собственно лизата амебоцитов (LAL-реактива) на основе зарубежных и отечественных публикаций приведены в обзоре [6], где также в качестве сырья рассматриваются только мечехвосты. Отметим, что и более поздние патенты, касающихся разработки чувствительных к эндотоксину реактивов и отличающиеся как использованными механизмами увеличения чувствительности реактива, так и методов диагностики результатов взаимодействия реактива с исследуемой средой, базируются на переработке гемолимфы именно мечехвоста (см., например, патенты США 6270982, 6391570 и др.).

Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения аналога LAL-реактива из морских беспозвоночных, обитающих в экономической зоне прибрежных морей России.

Эта задача решается путем получения реактива, чувствительного к присутствию бактериального эндотоксина, из гемолимфы краба рода Paralithodes (тип членистоногие, подтип жабродышащие, класс ракообразные), например, из гемолимфы камчатского краба (точнее, крабоида) Paralithodes camtschaticus, в дальнейшем - ПАЛ-реактив (от латинского: PAL-reagent, Paralithodes Amebocyte Lysat Reagent).

ПАЛ-реактив получают из гемолимфы здоровых свежевыловленных промысловых особей камчатского краба массой не менее 3-4 кг, которые непосредственно после отлова поступают на взятие гемолимфы или предварительно помещаются в аквариальный бассейн с проточной морской водой при условии содержания при температурном режиме, соответствующем межлиночному циклу развития животных (для июля-августа в прибрежных водах ряда заливов Баренцева моря на глубинах 10-15 м, например, от +5 до +8°С), насыщения воды кислородом не менее 6 мл/л и обеспечения характерного для вида и ареала промысла рациона питания.

Взятие пробы гемолимфы осуществляется в охлаждаемом боксе путем введения стерильной пункционной иглы в полость сердца животного, с последующим наполнением на весах апирогенных пластмассовых сборников, предварительно частично заполненных стерильным раствором консерванта, охлажденного до 4-6°С. Затем в смесь вводят криопротектор, в качестве которого используют диметилсульфоксид. Смесь тщательно перемешивают, после чего разливают по пластиковым пробиркам, запечатывают, маркируют, производят постадийное криогенное замораживание и помещение проб в криостат, заполненный жидким азотом для хранения и транспортировки. На длительное хранение в ожидании переработки пробы помещаются в морозильную камеру с температурой не выше -70°С.

Возможен и другой способ взятия проб, отработанный в свое время на мечехвостах. Он включает отсечение части когтя одной из ходильных ног и непосредственное заполнение гемолимфой сборника с консервантом. Если после процедуры взятия пробы животное выпускается в море, то отверстие на когте закрывают с помощью пластыря или другим способом.

В качестве консерванта в предлагаемом способе используют композицию следующего состава (из расчета в граммах на 1000 мл):

Лимонная кислота	3,3
Цитрат натрия	26,3
Бифосфат натрия	22,2
Глюкоза	32,0
Трилон Б	не более 11,2
Вода для инъекций (ФС 42-2620-97)	остальное.

Величина рН консервата должна лежать в пределах 4,4-4,6.

При условии использования полученного консервата в течение 60 суток допускается исключение процедуры криозамораживания и хранение проб в холодильнике при температуре 1-5°С.

В процессе переработки гемолимфы из криозамороженных проб для получения лизата амебоцитов пробы размораживаются, полученный консерват из транспортных сборников разливается в апирогенные пластиковые пробирки и центрифугируется при 6000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант удаляется, а затем производится двукратная отмывка амебоцитов и ресуспендирование их очищенной апирогенной водой.

Для разрушения амебоцитов суспензию заливают в апирогенные целлофановые мешки для диализа. Мешки помещают в сосуд с очищенной депирогенизированной водой при рН 8,0. Диализ проводится при температуре +4°С в течение 18-24 часов со сменой воды в сосуде через 9-12 часов. Отделение разрушенных оболочек клеток от лизата осуществляется центрифугированием (режим см. выше), после чего лизат экстрагируют хлороформом.

Активирование лизата проводят добавлением 25%-ного депирогенизированного раствора сульфата магния из расчета 0,1 мл раствора на 1 мл лизата. Стерильный активированный лизат разливают в стеклянные флаконы емкостью, например, 5 мл по 1 мл в каждый и подвергают лиофильной сушке. Объем флакона может подбираться в зависимости от конструкции устройства для лиофильной сушки.

Ниже (см. табл.1) приводится сопоставление различных методов анализа микробиологического состояния сырья с использованием ПАЛ- и LAL-тестов и традиционным методом (определение микробной обсемененности).

Таблица 1.
Сравнение методов анализа микробиологического состояния пищевого сырья
Показатели сравнения	Возможные методы экспресс-анализа	Традиционный метод
Разрабатываемый ПАЛ-тест	Существующий LAL-тест	Определение микробной обсемененности
Время, требуемое для получения результата анализа	1 ч (качественный анализ)	1 ч (качественный анализ)	5-7 суток
Оборудование	Лабораторный стол, вод. баня, центрифуга, набор посуды	Лабораторный стол, вод. баня, центрифуга, набор посуды	Аккредитованная лаборатория
Стоимость анализа	150-300* руб.	600-1200*руб.	600-900 руб.
*) в зависимости от требуемой чувствительности реактива

Данные табл.1 позволяют по простоте реализации и экономическим соображениям отдать предпочтение именно предлагаемому ПАЛ-тесту.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Камчатский краб на линочной стадии 3-3а без обрастаний и изъязвлений массой 3-4 кг в помещении или боксе с температурой воздуха не выше 10-15°С помещается в кювету, где он обмывается чистой водой, подсушивается и закрепляется на штативе или планшете для взятия гемолимфы.

Перед взятием гемолимфы на консервацию у одного из животных берется проба на микроскопирование для определения качества сырья. Забор 1-2 мл гемолимфы производится пункционной иглой из полости сердца. Затем с помощью предметных стекол приготавливается не менее 3-х препаратов "раздавленная капля", которые анализируется с помощью микроскопа типа МБИ-6 при увеличении 15×20. При этом оценивается состояние и количество амебоцитов по всему пространству проб. Пробы считаются положительными, если в поле зрения объектива одновременно находится не менее 20 амебоцитов, среди которых отсутствуют элементы разрушенных и деградировавших клеток.

Взятие гемолимфы для получения консервата осуществляют путем введения в полость сердца животного стерильной пункционной иглы с трокаром, предварительно заполненных консервантом. После появления капли гемолимфы на выходе из иглы трокар вводят в полость сердца, иглу удаляют, а к выходному штуцеру трокара подключают патрубок для подсоединения к пластиковому сборнику гемолимфы, заранее частично заполненному консервантом и установленному на весы в охлаждаемом до температуры не выше 15°С боксе. В полученную порцию консервата стерильным шприцом добавляют криопротектор диметилсульфоксид в количестве не более 10% от общего количества консервата и тщательно перемешивают. Полученный консерват разливают в апирогенные пробирки по 1,5-2,5 мл. Пробирки запечатывают и охлаждают до 0°С в ледяной шуге, затем поэтапно со скоростью в пределах 1-3 град./мин - в смеси спирта с жидким азотом до температуры минус 30-40°С, после чего их помещают в криостат, заполненный жидким азотом. В транспортном криостате пробы доставляют на переработку или длительное хранение.

Для получения лизата амебоцитов пробы гемолимфы размораживают в течение 1 часа при 4-6°С, затем пробирки центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант удаляют декантацией и микроскопируют на отсутствие амебоцитов. Затем концентрат амебоцитов заливают 3-х кратным объемом очищенной депирогенизированной воды и вновь центрифугируют при том же режиме. Операцию повторяют дважды.

Для разрушения амебоцитов промытый осадок амебоцитов заливают равным объемом воды для инъекций и перемешивают стеклянной апирогенной палочной для образования суспензии. Суспензию амебоцитов сливают в апирогенные целлофановые мешки для диализа, которые помещают в сосуд с водой для инъекций при рН 8,0. Диализ проводят в течение 24 часов со сменой воды через 12 часов при температуре 4-6°С. Отделение разрушенных оболочек клеток от лизата осуществляют центрифугированием при указанном выше режиме. Супернатант собирают в апирогенные емкости и отправляют на дальнейшую переработку или лиофилизируют на месте.

В последнем случае в сосуд с неактивным лизатом добавляют 25%-ный депирогенизированный раствор сульфата магния из расчета 0,1 мл раствора на 1 мл лизата. Затем активированный лизат разливают в стеклянные апирогенные флаконы емкостью 5 мл по 1 мл (10-5-2,5 ЕЭ/мл) и проводят лиофильную сушку. В порошке проверяют активность, а в процессе изготовления ведут постадийный контроль качества (см. пример табл.2).

Таблица 2.
Постадийный контроль качества при получении образцов лизата амебоцитов краба (серия 10504)
	Показатели качества
параметр	метод	результат
1	2	3	4
Качество гемолимфы	стерильность	ГФ XI, вып.2, стр.187, изм. №3	стерильно
Целостность клеток	Микроскопия	Отсутствие разрушенных клеток
Качество осаждения амебоцитов	Наличие клеток и их остатков в супернатанте	Микроскопия	Отсутствие клеток и их остатков в супернатанте
Качество диализа	Наличие клеток	Микроскопия	Отсутствие целых клеток
рН	Потенциометрически	6,5
Качество лизата после центрифугирования	Отсутствие остатков клеток	Микроскопия	Отсутствие остатков клеток
Качество лизата после активации и стабилизации	Чувствительность лизата	ОФС 42-0002-00	10 ЕЭ/мл
Качество лиофильной сушки	стерильность	ГФ XI, вып.2, стр.187, изм. №3	Стерильно
	Остаточная влажность	ГФ XI, вып.1, стр.176	7%
Чувствительность лизата	ОФС 42-0002-00	10 ЕЭ во флаконе

Проверку активности проводят методом сравнительного анализа полученного реактива со стандартным LAL-реактивом. В качестве примера сравнения ниже приводятся экспериментальные результаты, полученные на одном и том же эндотоксине с различными степенями разведения, а все калибровки проведены на контрольном стандарте эндотоксина из комплекта LAL-теста.

Для проведения стандартного LAL-теста применяли реактивы фирмы Associates of Cape Cod Inc.: LAL-реактив (Pyrotell®). В работе использовали LAL-реагент с чувствительностью λ=0,25 ЕЭ/мл (lot# 502-07-262), контрольный стандарт эндотоксина (lot# 94, 500 нг во фл.), оттитрованный по RSE (FDA) (lot# EC-6-1), воду для анализа по LAL-тесту (lot# 314-2881).

Для проведения ПАЛ-теста использовались лабораторный образец реактива - ПАЛ-реактив серии 30504 с чувствительность 1.0 ЕЭ/мл, контрольный стандарт эндотоксина и очищенная депирогенизированная вода от описанного выше LAL-теста.

В обоих случаях определение концентрации бактериальных эндотоксинов проводили качественным гель-тромб методом, осредняя результат по трем опытам в каждой серии при калибровке через 0,2 ЕЭ/мл согласно [7].

Результаты измерений приведены в табл.3.

Таблица 3.
Сравнительный анализ измерения содержания эндотоксина с помощью ПАЛ- и ЛАЛ-реактивов
Реактив	Содержание эндотоксина в пробе, ЕЭ/мл	Осредненный результат измерений, ЕЭ/мл	Относительная погрешность
ПАЛ-реактив	12,0	12,6	+0,05
LAL-реактив	-"-	12,4	+0,033
ПАЛ-реактив	6,0	5,6	-0,067
LAL-реактив	-"-	6,2	+0,33
ПАЛ-реактив	3,0	3,2	+0,067
LAL-реактив	-"-	2,8	-0,067

Во всех трех сдвоенных опытах проведения определений калиброванного содержания эндотоксина относительная погрешность среднеарифметического значения содержания эндотоксина не выходила за пределы ±7%.

Пример 2.

Камчатский краб, отвечающий требованиям п.1, в помещении с температурой воздуха не выше 10-15°С обмывают чистой водой и обсушивают. Затем краб закрепляется на штативе или наклонном планшете, установленном рядом с ламинарным боксом или другим видом бокса, обеспечивающим отсутствие загрязнения продукта с таким расчетом, чтобы окончание одной из его ходильных ног оказывалось в чистой зоне, обеспечивающей стерильные условия заполнения гемолимфой апирогенного сборника. Нога в районе сустава между третьим и четвертым члениками обертывается стерильной марлей, препятствующей случайному попаданию посторонних жидкостей в зону взятия гемолимфы. Зона взятия гемолимфы от четвертого членика до конца когтя (коксоподита) обрабатывается антисептиком, например хлоргексидином.

Взятие пробы гемолимфы осуществляется путем вскрытия когтя коксоподита с образованием отверстия диаметром 4-5 мм и введения когтя в пластиковый патрубок с замком, соединенный с пластиковым стерильным контейнером (гемаконом) для сбора проб. Заполненным на 1/3 консервантом гемакон устанавливается на электронные весы в охлаждаемом до температуры не выше 10-15°С боксе, показания весов обнуляются, а заполнение гемолимфой производится до показания равного массе консерванта. Затем гемакон маркируется, охлаждается и хранится при температуре 1-5°С.

Пробы гемолимфы доставляются на переработку, где в чистом помещении разливаются в ламинарном боксе в стерильные пластиковые пробирки с крышками и центрифугируются на лабораторной центрифуге при 6000 об/мин в течение 30 мин. Супернатант удаляют и микроскопируют на отсутствие амебоцитов. Концентрат амебоцитов заливают 3-х кратным объемом апирогенной воды и центрифугируют при том же режиме, повторяя операцию дважды.

Дальнейшую переработку гемолимфы ведут аналогично примеру 1.

Источники информации

1. ГОСТ Р 51705.1-2001. Управление качеством пищевых продуктов на основе принципов ХАССП.

2. Levin J. 1967. Blood coagulation and endotoxin in invertebrates // Federation Proceedings, vol.26, N6, November-December. P.1707-12.

3. Галынкин В.А., Заикина Н.Л., Каграманова К.А., Карцев В.В., Потехина Т.С. Санитарно-микробиологический контроль в пищевой и фармацевтической промышленности. - СПб, 2004. - 248 с.

4. Levin J., Bang F.B. (1964) The Role of Endotoxin in the Extracellular Coagulation of Limulus Blood // Bull. John Horkins Hosp., Vol.115, N3. - P.265-274.

5. Levin J. Quantitative detection of endotoxin in biological fluids. Патент США 3915805 (приоритет от 29.05.1973; выдан 28.10.1978).

6. Ситников А.Г., Глазова Н.В., Травина Л.А и др. ЛАЛ-тест. Современные подходы к определению пирогенности. - СПб.: ТЕХ-БИОМ, 1994. - 98 с.

7. ОФС 42-0002-00. Бактериальные эндотоксины.

1. Способ получения реактива для определения бактериальных эндотоксинов из гемолимфы морских членистоногих, включающий взятие гемолимфы, ее консервацию, выделение амебоцитов из гемолимфы путем центрифугирования, выделение ферментов амебоцитов разрушением их оболочек с последующим центрифугированием и лиофильной сушкой лизата, отличающийся тем, что используют гемолимфу крабов рода Paralithodes, разрушение оболочек амебоцитов проводят диализом против подщелаченной до рН 8,0 очищенной депирогенизированной воды в течение 24 ч при температуре 4-6°С со сменой воды через 12 ч, перед лиофильной сушкой в лизат вводят 25%-ный раствор сульфата магния.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что взятие гемолимфы и ее консервацию ведут при температуре не выше 10-15°С.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве консерванта для гемолимфы используют апирогенный раствор следующего состава из расчета граммов на 1000 мл:

лимонная кислота безводная	3,3
цитрат натрия водный	26,3
бифосфат натрия водный	22,2
глюкоза	32,0
трилон Б	не более 11,2
вода для инъекций	остальное