Способ определения относительной площади волокон коллагена в гистологическом препарате

Изобретение относится к медицине, а именно к морфологии. Сущность способа: проводят окрашивание препарата по Ван Гизон, под микроскопом изображение препарата увеличивают в 400 и более раз, оцифровывают, проводят выделение фона препарата при уровнях яркости изображения 240-255, осуществляют его инверсию и по гистограмме регулируют среднее значение уровня яркости изображения до достижения ее 185. Затем изображение переводят в цветовую модель Lab. При этом в канале «а» проводят выделение участков с уровнем 20-50, а в канале «L» (Lightness) вычитают участки с уровнем яркости изображения более 70. При этом выделение фона препарата, участков с уровнями яркости изображения 20-50 и более 70, а также регулирование среднего значения уровня яркости изображения по гистограмме проводят при 256 градациях яркости изображения. По формуле определяют относительную площадь коллагеновых волокон в гистологическом препарате, где: S_отн - относительная площадь коллагена на срезе ткани, S_колл - площадь коллагеновых волокон, S_тк - площадь тканей препарата. Использование способа позволяет повысить точность определения относительной площади коллагеновых волокон в гистологическом препарате. 6 ил.

 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к морфологии (гистологии и патологической анатомии).

При гистологических исследованиях соединительнотканного компонента нередко возникает потребность количественной оценки выраженности соединительной ткани. Однако имеющиеся в настоящее время программы морфометрического анализа не предусматривают проведение таких исследований, а применяемое исследование вручную очень трудоемко (Г.Г.Автандилов. Медицинская морфометрия. - М.: Медицина, 1990. - 384 с.).

Известен «клеточный», или «сеточный», способ планиметрического подсчета морфологических структур, заключающийся в том, что площадь, занимаемую на срезе изучаемым компонентом, определяют наложением на срез квадратной сетки с известным шагом деления, затем подсчитывают число полных и неполных квадратов в пределах контура, занимаемого структурой (Г.Г.Автандилов. Медицинская морфология. - М.: Медицина, 1990. - С.63).

К недостаткам данного способа следует отнести низкую точность определения площади структур линейного характера, например волокон коллагена, и в то же время известный способ имеет чрезвычайно большую трудоемкость.

Также известен способ «линейной интеграции». Он заключается в наложении отрезков с определенным шагом и измерении суммы длин отрезков, которые перекрывают исследуемую структуру.

Однако данный метод не учитывает толщины волокнистых структур и чувствителен к ориентации волокон (Г.Г.Автандилов. Медицинская морфология. - М.: Медицина, 1990. - С.64).

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ морфометрического анализа срезов гистологических препаратов, включающий компьютерный анализ изображения (Исаков В.Л., Пинчук В.Г., Исакова Л.М. Современные методы автоматизации клинических исследований. - Киев: Наукова думка, 1988. - 216 с.).

Для осуществления известного способа проводят гематоксилин-эозиновое окрашивание препарата, затем с использованием специализированного программного обеспечения выделяют клеточные структуры с интенсивным окрашиванием (ядра клеток), площадь которых определяют по отношению к остальной площади исследуемого изображения.

К недостаткам известного технического решения следует отнести невозможность определения площади, занимаемой коллагеновыми волокнами соединительной ткани, вследствие их окрашивания гематоксилин-эозином в розовый цвет, как и большинства компонентов гистологического препарата, вследствие чего программа анализа не распознает фибриллярный объект. Следовательно, известный способ автоматической морфометрии не может быть использован для определения площади коллагеновых волокон в гистологическом препарате.

Задачей заявляемого изобретения является разработка способа определения относительной площади волокнистого компонента соединительной ткани - коллагеновых волокон - с использованием автоматического компьютерного морфометрического анализа.

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности определения относительной площади коллагеновых волокон в гистологическом препарате.

Техническим результатом предлагаемого способа является обеспечение возможности проведения морфометрического анализа волокнистого компонента соединительной ткани с использованием общедоступных программ обработки изображения, а также повышение точности способа.

Технический результат достигается тем, что способ автоматического морфометрического исследования содержания коллагеновых волокон в микропрепарате проводят с использованием обработки изображения исследуемого морфологического объекта в цветовом пространстве Lab.

Отличительные приемы заявляемого способа заключаются в том, что используется вместо гематоксилин-эозинового окрашивания способ окраски по Ван Гизон и анализ оцифрованного изображения осуществляют не в общепринятой модели цветового пространства RGB (каналы R - красный, G - зеленый и В - синий), а в модели Lab (L - lightness, яркость, разностные каналы а (зеленый - малиновый) и b (желтый - голубой)).

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения «новизна».

Авторам заявляемого способа не известно ни одно техническое решение, осуществление которого позволило бы провести автоматический анализ изображения морфологического препарата при окраске на коллагеновые волокна по Ван Гизон.

Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в экспериментальной и клинической медицине и биологии. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами.

Заявляемый способ обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата, а именно - разработку способа определения относительного объема коллагена в гистологическом препарате.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

В качестве объекта анализа выступает микропрепарат участка постинфарктного кардиосклероза, окрашенный по методу Ван Гизон, для выявления волокон соединительной ткани.

Изображение фрагмента микропрепарата при увеличении в 400 раз оцифровывается (Фиг.1).

Для получения сопоставимых результатов в различных сериях исследований с разной толщиной среза и интенсивностью окраски оцифрованное изображение микропрепарата «нормализуется». Для этого проводят выделение фона с яркостью 240-255 (при 256 градациях яркости), инверсию выделения (это позволяет исключить влияние различного соотношения площадей структур и фона на различных образцах) и регулировку уровня до достижения значения среднего уровня яркости по гистограмме около 185 (Фиг.2).

Площадь выделения фона соответствует площади, занимаемой исследуемой тканью на микропрепарате (S_тк, пикселей), которая в в данном случае равна 3205230 пикселей.

Затем изображение конвертируют в цветовую модель Lab. В канале а производится выделение участков с уровнем от 20 до 50 по шкале в 256 градаций (Фиг.3). После этого в канале L (Lightness) из выделения вычитают участки с уровнем более 70 (это ядра клеток и включения) (Фиг.4).

В результате выделение охватывает участки изображения, представленные находящимися в фокусе коллагеновыми волокнами, и площадь этого выделения S_колл составляет 904258 пикселей.

Далее по формуле рассчитывают относительную площадь, занимаемую коллагеновыми волокнами в исследуемой ткани.

Учитывая цифровые значения S_колл и S_тк, относительная площадь, занимаемая коллагеновыми волокнами в соединительной ткани участка постинфарктного кардиосклероза, составляет =28.2%.

Авторами заявляемого способа также было проведено определение относительной площади коллагеновых волокон того же участка микропрепарат постинфарктного кардиосклероза по способу-прототипу. При этом окрашивание микропрепарата проводили гематоксилин-эозином. Выделение волокнистого компонента - коллагеновых волокон - по интенсивному окрашиванию проводили с использованием специализированного программного обеспечения (Фиг.5). Площадь которых определяли по отношению к остальной площади исследуемого изображения, и она составила 48% (Фиг.6).

Авторами предлагаемого способа было установлено, что используемое программное обеспечение также считывало и ядра клеток, которые имели такое же интенсивное окрашивание, как и коллагеновые волокна.

Из приведенного сравнения следует, что относительная площадь коллагеновых волокон в одном и том же участке гистологического препарата, определенная по способу-прототипу, составила 48%, а по заявляемому - 28%.

Таким образом, предложенный способ позволяет более точно определить относительную площадь волокнистого компонента соединительной ткани - коллагеновых волокон - в гистологических препаратах.

Данный способ может быть использован для различных научных исследований в медицине и биологии.

Способ определения относительной площади волокон коллагена в гистологическом препарате, включающий окрашивание препарата и компьютерный анализ изображения с установлением площади волокон коллагена по отношению к общей площади изображения, отличающийся тем, что окрашивание препарата проводят по Ван Гизон, после чего изображение препарата под микроскопом увеличивают в 400 и более раз, оцифровывают, проводят выделение фона препарата при уровнях яркости изображения 240-255, осуществляют его инверсию и по гистограмме регулируют среднее значение уровня яркости изображения до достижения ее 185, затем изображение переводят в цветовую модель Lab, при этом в канале «а» проводят выделение участков с уровнем 20-50, а в канале «L» (Lightness) вычитают участки с уровнем яркости изображения более 70, при этом выделение фона препарата, участков с уровнями яркости изображения 20-50 и более 70, а также регулирование среднего значения уровня яркости изображения по гистограмме проводят при 256 градациях яркости изображения и по формуле определяют относительную площадь коллагеновых волокон в гистологическом препарате, где S_отн - относительная площадь коллагена на срезе ткани; S_колл - площадь коллагеновых волокон; S_тк - площадь тканей препарата.