Рекомбинантный белок, обладающий противораковым действием, кодирующий его ген и его применение

Рекомбинантный белок, обладающий противораковым действием, по настоящему изобретению является белком, выбранным из группы, включающей: 1) белок с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:2, показанной в списке последовательностей; 2) белок, аминокислотная последовательность которого более чем на 90% гомологична последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, и обладает такой же активностью как и белок 1); 3) белок, полученный путем замены, делеции или добавления одного или нескольких остатков в аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, который обладает такой же активностью, как и белок 1). Изобретение охватывает также ген, кодирующий указанный рекомбинантный белок и его варианты, вектор экспрессии, содержащий указанный ген, а также клеточную линию, содержащую указанный ген, предназначенную для экспрессии рекомбинантного белка. Рекомбинантный белок может быть применен для получения лекарственного средства для лечения рака. Лекарственное средство, содержащее в качестве активного компонента вышеуказанный рекомбинантный белок, обладает значительным селективным ингибирующим действием на опухолевые клетки и не вызывает апоптоз клеток нормальных тканей. 6 н. и 8 з.п. ф-лы, 7 ил., 7 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области генной инженерии и фармакологии. Данное изобретение относится к рекомбинантному белку, кодирующему его гену и генетически сконструированному лекарственному средству, содержащему указанный рекомбинантный белок в качестве активного ингредиента. В частности настоящее изобретение относится к рекомбинантному белку, обладающему противораковым действием, кодирующему его гену и лекарственному средству для лечения рака, содержащему указанный рекомбинантный белок в качестве активного ингредиента.

Уровень техники

В процессе эволюции у млекопитающих постепенно возник ряд механизмов передачи сигналов для апоптоза, которые могут индуцировать запрограммированную смерть отдельных клеток. Основополагающая теория заключается в том, что лиганды летальных клеток взаимодействуют с рецепторами смерти на клеточных поверхностях, что индуцирует апоптоз клеток. Такой полезный апоптоз играет важную физиологическую роль в удалении активированных лимфоцитов в конце иммунной реакции и в уничтожении инфицированных вирусом клеток и онкогенных клеток. Примеры такого взаимодействия включают в себя взаимодействие между TNF и рецептором TNFR и взаимодействие между FasL и рецептором Fas/Apo1/CD95.

Активированные рецепторы смерти непосредственно участвуют в каскадных реакциях апоптоза клеток. Они могут индуцировать апоптоз различных раковых клеток и являются вероятными противораковыми факторами. Хотя TNF и FasL могут индуцировать апоптоз раковых клеток, они вызывают тяжелые токсические и побочные эффекты при применении в противораковой терапии. Инъекция TNF может приводить к летальным воспалительным реакциям, сходным с септическим шоком. Эта реакция в основном опосредована NF-κВ, пре-транскрипционным фактором, который локализован в эндотелиальных клетках сосудов и макрофагах и который активируется посредством TNF. Анти-Fas-антитело может индуцировать Fas-зависимый апоптоз клеток в тканях печени и вызывать летальные поражения печени.

В 1995 году Wiley et al. обнаружили TNF-родственный индуцирующий апоптоз лиганд (TRAIL), на основе идентичности его последовательности с TNF и FasL. TRAIL может индуцировать апоптоз путем взаимодействия с рецептором смерти DR4 или DR5. В отличие от TNF и FasL, мРНК TRAIL конститутивно экспрессируется во многих нормальных тканях человека. Это указывает на физиологический механизм, при помощи которого TRAIL индуцирует апоптоз раковых клеток, не затрагивая нормальные клетки. Эти механизмы включают в себя экспрессию ингибиторных рецепторов, способность конкурировать с DR4 и DR5 за связывание с лигандами, способность TRAIL взаимодействовать с тремя рецепторами DcR1, DcR2 и DPG. Таким образом, токсичность TRAIL меньше, чем токсичность TNF и FasL.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является получение рекомбинантного белка, обладающего противораковым действием, и лекарственного средства для эффективного лечения рака, которое в качестве активного ингредиента содержит этот рекомбинантный белок.

Рекомбинантным белком, обладающим противораковым действием, по настоящему изобретению является белок, выбранный из группы, включающей:

1) белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, показанной в списке последовательностей;

2) белок, основанный на SEQ ID NO:2, последовательность которого гомологична последовательности SEQ ID NO 2 более чем на 90% и который обладает такой же активностью, как и SEQ ID NO:2;

3) белок, основанный на SEQ ID NO:2, который получен добавлением или делецией 15 или менее аминокислотных остатков на N-конце аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 и который обладает такой же активностью, как и SEQ ID NO:2;

4) белок, основанный на SEQ ID NO:2, который получен добавлением или делецией 15 или менее аминокислотных остатков на С-конце аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 и который обладает такой же активностью, как и SEQ ID NO:2;

5) белок, основанный на SEQ ID NO:2, который получен заменой, делецией или добавлением одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 и который обладает такой же активностью, как и SEQ ID NO:2.

Белок SEQ ID NO:2, показанный в списке последовательностей, является циклически пермутированным TRAIL человека (СРТ), который состоит из 166 аминокислотных остатков.

Активным ингредиентом лекарственного средства для лечения рака, полученным в настоящем изобретении (СРТ), является один из вышеупомянутых белков.

Если желательно, в вышеуказанное лекарственное средство могут быть добавлены один или несколько фармацевтически приемлемых носителей. Носитель включает разбавитель, эксципиент, наполнитель, связывающее вещество, увлажняющий агент, дезынтегирующий агент, усилитель абсорбции, поверхностно-активное вещество, носитель-адсорбент, смазывающее вещество, обычно используемые в фармацевтической области. Если необходимо, также могут быть добавлены ароматизатор, подсластитель и тому подобное.

Лекарственное средство по настоящему изобретению может быть приготовлено в различных формах, включая инъекционный раствор, таблетки, порошки, гранулы, капсулы, жидкости для перорального приема, мази и крем и т.д. Любая из вышеупомянутых лекарственных форм может быть получена обычными способами фармацевтической области.

Кодирующей последовательностью активного ингредиента (белка) лекарственного средства для лечения рака (СРТ) по настоящему изобретению является последовательность, выбранная из группы, включающей:

1) SEQ ID NO:1, показанную в списке последовательностей;

2) полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, показанную в списке последовательностей;

3) последовательность ДНК, которая гомологична последовательности ДНК SEQ ID NO:1, показанной в списке последовательностей, более чем на 90%, и которая кодирует белок с такой же активностью, как и белок, кодируемый SEQ ID NO:1;

4) последовательность ДНК, кодирующую белок, основанный на SEQ ID NO:2, где указанный белок, основанный SEQ ID NO:2, получен добавлением или делецией 15 или менее аминокислотных остатков на N-конце аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 и обладает такой же активностью, как и SEQ ID NO:2;

5) последовательность ДНК, кодирующую белок, основанный на SEQ ID NO:2, где указанный белок, основанный на SEQ ID NO:2, получен добавлением или делецией 15 или менее аминокислотных остатков на С-конце аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 и обладает такой же активностью, как и SEQ ID NO:2;

6) последовательность ДНК, кодирующую белок, основанный на SEQ ID NO:2, где указанный белок, основанный SEQ ID NO:2, получен заменой, делецией или добавлением одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 и обладает такой же активностью, как и SEQ ID NO:2.

Последовательность SEQ ID NO:1 в списке последовательностей состоит из 501 пары оснований. Рамка ее считывания находится в области нуклеотидов 1-498 от 5'-конца.

Экспрессирующие векторы и клеточные линии (такие, как системы экспрессии Escherichia coli и дрожжей и т.д.), содержащие ген по изобретению, находятся в рамках настоящего изобретения.

Краткое описание графического материала

На фиг. 1 показаны кривые объемов опухолей глиомы U251 человека при различных условиях лечения.

На фиг. 2 показаны размеры опухолей глиомы U251 человека при различных условиях лечения.

На фиг. 3 показаны кривые объемов опухолей рака легкого NCI-H460 человека при различных условиях лечения.

На фиг. 4-1 - фиг. 4-6 показаны гистопатологические срезы рака легкого NCI-H460 человека при различных условиях лечения (НЕ-окрашивание х 100).

На фиг. 5 показаны размеры опухолей легкого NCI-H460 человека при различных условиях лечения.

На фиг. 6 показаны кривые объемов опухолей рака прямой кишки COLO 205 человека при различных условиях лечения.

На фиг. 7-1 - фиг. 7-5 показаны «голые» мыши Balb/c-nu, которые были инокулированы раком прямой кишки COLO 205 человека, с последующими различными схемами лечения.

Наилучшие способы осуществления изобретения

Пример 1

Конструирование и экспрессия кодирующего гена рекомбинантного циклически пермутированного TRAIL человека

Последовательность гена, кодирующую аминокислотные остатки в положениях 121-281 TRAIL человека, получали из библиотеки кДНК селезенки человека. Ген, кодирующий аминокислотные остатки в положениях 135-281 TRAIL человека, получали обычным ПЦР-способом с использованием гена TRAIL человека в качестве матрицы. Затем последовательность ДНК, кодирующую аминокислотные остатки 122-135 TRAIL, связывали с 3'-концом ДНК-последовательности, кодирующей аминокислотные остатки в положениях 135-281 TRAIL, ПЦР-способом. Последовательность ДНК, кодирующая пять остатков глицина, вставляли между ДНК-последовательностью, кодирующей аминокислотные остатки 135-281 TRAIL, и ДНК-последовательностью, кодирующей аминокислотные остатки 122-135 TRAIL. Подвижность глицина может облегчать правильную укладку белка. Полученный таким образом кодирующий СРТ ген лигировали в векторную плазмиду pet28b (или другую векторную плазмиду), используя NcoI и BamHI, с получением экспрессионной плазмиды. Посредством секвенирования было подтверждено, что последовательность ДНК является правильной.

Экспрессионную плазмиду трансформировали в штамм E.coli BL21 (DE3). Трансформированную E. coli инокулировали в 10 мл жидкой среды LB, содержащей 20 мкг/мл канамицина. Клетки инкубировали на шейкере при 37°С в течение 12 часов. Затем 10 мл культуры инокулировали в 1 л жидкой среды LB, содержащей 20 мкг/мл канамицина, и культивирование продолжали. При достижении OD₆₀₀ 0,6 добавляли 0,2 мл 1 М IPTG в 1 л культуры для индукции экспрессии белка. Клетки собирали центрифугированием через три часа после индукции. Осадок суспендировали в 100 мл буфера, содержащего 100 мМ Трис (рН 7,9) и 150 мМ NaCl.

Клетки лизировали обработкой ультразвуком при 4°С и центрифугировали при 15000 об/мин, используя ротор JA20 Beckman. Поскольку экспрессируемый белок способен связываться с металлохелатными полимерами, он может быть очищен с помощью металлохелатной хроматографии. После центрифугирования супернатант наносили с использованием насоса на хроматографическую колонку с иммобилизованным Ni²⁺-хелатом. Колонку промывали буфером, содержащим 50 мМ Трис (рН 7,9), 0,05 М NaCl и 50 мМ имидазол, для удаления содержащихся в ней загрязняющих белков. Затем связанный белок элюировали буфером, содержащим 50 мМ Трис (рН 7,9), 0,5 М NaCl и 200 мМ имидазол. Элюированный белок диализовали против PBS-буфера.

Наконец, белок очищали, используя ионообменную колонку и гель-фильтрационную колонку Superdex 200 (Pharmacia), помещенную в ВЖХ-системе AKTA (Pharmacia). Анализ белка показал, что полученный таким образом белок имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, которая является противораковым лекарственным средством по изобретению. Конечный продукт представлял собой белый порошок и был водорастворимым.

Пример 2

Определение цитотоксического эффекта лекарственного средства по настоящему изобретению на раковые клетки с использованием способа восстановления тетразолия (МТТ)

Реагенты: RPMI 1640 получена из Gibco; МТТ из Bebco. Фетальная сыворотка теленка приобретена у Hangzhou SiJiQing Bioengineering Material Co. Ltd. (P.R. China).

Клеточные линии: COLO 205 (клетки рака прямой кишки человека), NCI-H460 (клетки рака легкого человека), RPMI 8226 (клетки множественной миеломы человека), U251 (клетки глиомы головного мозга человека) получены из АТСС, USA. HL-60 (клетки промиелоцитарного лейкоза человека), MDA-MB-231, MDA-MB-435 (клетки рака молочной железы человека), SCLC (клетки мелкоклеточного рака легкого человека), Н125 (клетки рака легкого человека) и РС-3 (клетки рака поджелудочной железы человека).

Хорошо растущие опухолевые клетки собирали для приготовления суспензии клеток (1х10⁴/мл) с использованием среды RPMI 1640, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку. Суспензию клеток инокулировали в 96-луночный планшет, 100 мкл (содержащих 1000 опухолевых клеток) на лунку. Планшет культивировали в термостате с 5% СО₂ при 37°С в течение 24 часов с последующим добавлением лекарственного средства.

В этом эксперименте использовали слепой контроль и положительной контроль с 5-фторурацилом или адриамицином. Пробы СРТ были получены в пяти концентрациях, для каждой концентрации использовали три параллельные лунки. Клетки культивировали в термостате с 5% СО₂ при 37°С в течение 4 дней. Затем культуральную среду удаляли и в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора МТТ (0,4 мг/мл в RPMI 1640). Планшет инкубировали при 37°С в течение еще четырех часов.

Супернатант удаляли. В каждую лунку добавляли 150 мкл DMSO для солюбилизации гранулятов Фомазана. После осторожного встряхивания измеряли величины OD, используя ферментный анализатор BIORAD 550 с длиной волны определения 540 нм и эталонной длиной волны 450 нм.

Кривые доза-ответ получали построением графиков с интенсивностями ингибирования клеток и различными концентрациями лекарственного средства и рассчитывали концентрации ингибирования 50% (IC₅₀). Результаты показаны в таблице 1. На графике видно, что СРТ обладает чрезвычайно сильным цитолизным действием на опухолевые клетки человека U251, COLO 205, NCI-H460, MDA-MB-435, где IC₅₀<0,01 мкг/мл. СРТ обладает также очень сильным цитолизным действием на клетки HL-60, MDA-MB-231, PC-3 и HL125, где IC₅₀<0,1 мкг/мл. СРТ обладает хорошим действием на клетки RPMI 8226, где IC₅₀<1 мкг/мл. Также было показано некоторое его ингибиторное действие на рост клеток SCLC. Активность СРТ в отношении индукции апоптоза раковых клеток является в шесть-одиннадцать раз более сильной, чем активность TRAIL дикого типа.

Таблица 1 Цитолизное действие СРТ на линии опухолевых клеток человека (х±SD)
Линия опухолевых клеток	IC50 (мкг/мл)
CPT	FU	Adr
U251	<0,001	0,981±0,077
COLO 205	0,006±0	0,826±0,051
MDA-MB-435	0,008±0,002	0,199±0,138
HL-60	0,014±0,013		0,006±0
NCI-H460	0,002±0,001	0,566±0,016
MDA-MB-231	0,043±0,0131	0,318±0,055
PC-3	0,067±0,002	4,928±0,753
H125	0,085±0,006	0,138±0,031
RPMI 8226	0,824±0,093	<0,1
SCLC	10±0	0,617±0,0257
Примечание. FU обозначает 5-фторурацил (контроль); Adr обозначает адриамицин (контроль).

Пример 3

Ингибирующее действие лекарственного средства по настоящему изобретению на рост ксенотрансплантата рака человека у «голых» мышей

В этом примере используемыми животными были «голые» мыши Balb/c-nu, 6-8-недельного возраста. В каждом эксперименте все животные были одного и того же пола.

Линии опухолевых клеток: клетки глиомы U251 головного мозга человека, линию клеток рака легкого человека NCI-H460, линию клеток рака прямой кишки человека COLO 205 инокулировали из культуры in vitro в «голых» мышей подкожно, опухоли субкультивировали и хранили.

Экспериментальные процедуры: хорошо подросших «голых» мышей с достаточно выросшей опухолью отбирали и умерщвляли смещением шейного позвонка. Опухоли извлекали асептически и резали скальпелем на кусочки диаметром 2-3 мм. Кусочки инокулировали в подмышечную ямку животных подкожно с помощью иглы. Через приблизительно 7-10 дней в подмышечной ямке этих животных можно было обнаружить опухоли. Длину и ширину опухолей измеряли штангенциркулем. Затем этих животных объединяли в группы на основе размеров опухолей. Каждая группа включала в себя семь-восемь животных.

Длину, ширину опухоли и массу тела мышей измеряли два раза в неделю. Рассчитывали объем опухоли (TV) и относительный объем опухоли (RTV). Строили график, показывающий изменения размера опухоли. В конце этого эксперимента опухоли извлекали и взвешивали после умерщвления мышей и рассчитывали интенсивности ингибирования тестируемого лекарственного средства в отношении роста опухоли.

Формула для расчета объема опухоли (TV) была следующей: длина × ширина² - 2.

Формула для расчета относительного объема опухоли (RTV) была следующей: Vt/Vo (где Vo равно величине TV, измеренной в начале введения, Vt равно величине TV, измеренной после этого).

Использовали Т-критерий для определения статистического различия масс опухолей, объемов опухолей и RTV и т.д. между разными группами животных. Индексом, используемым для оценки противоопухолевой активности, является относительная интенсивность роста Т/С (%), формулой для которой является:

Стандарт оценки на эффективность:

Т/С (%) >60 является неэффективным;

Т/С (%) ≤60 и Р<0,05 после статистического анализа является эффективным.

1. Ингибиторное действие на глиому головного мозга человека U251

В качестве положительного контроля использовали кармустин, 40 мг/кг (Renmin Pharmaceuticals, Amino Acid Inc. Tianjin, P.R. China), вводимый внутрибрюшинной инъекцией один раз. СРТ вводили четырем группам в дозах 0,6 мг/кг, 1,7 мг/кг, 5,0 мг/кг, 15,0 мг/кг соответственно внутрибрюшиннной инъекцией. Эта обработка включала в себя десять инъекций.

Экспериментальные результаты показаны в таблицах 1 и 2 и на фигурах 1 и 2. На них видно, что СРТ обладает значительным ингибиторным действием на рост трансплантированных опухолей (глиомы U251 головного мозга человека) у «голых» мышей. Интенсивности ингибирования опухоли, рассчитанные на массу для четырех групп обработки, были 30,5%, 44,5%, 64,8% и 87,5% соответственно. По сравнению с контрольной группой масса опухолей в этих группах обработки обнаруживала значительное или очень значимое статистическое различие. Противоопухолевое действие СРТ значительно зависело от дозы. Величины относительной интенсивности роста опухолей Т/С(%) для групп, получавших 5,0 мг/кг и 15 мг/кг, были <60. Относительный объем опухоли (RTV) для группы, получавшей 15 мг/кг, значительно отличался по статистике по сравнению с этой величиной в контрольной группе.

Таблица 2 Ингибирующее действие СРТ на рост глиомы U251 человека (х±SD)
Группа	Количество животных	Масса тела (г)	Масса опухоли (г)	Скорость ингибирования (%)
Начало	Конец	Начало	Конец
Отрицательный контроль	8	8	21,9±1,1	22,3±2,6	1,28±0,50
Кармустин (контроль)	8	7	22,8±0,7	19,4±2,1	0,09±0,06**	93,0
CPT 0,6 мг/кг	8	8	21,0±0,8	21,0±1,4	0,89±0,49	30,5
СРТ 1,7 мг/кг	8	8	21,6±1,2	21,5±2,0	0,71±0,22*	44,5
CPT 5,0 мг/кг	8	8	22,0±1,1	21,9±3,2	0,45±0,26**	64,8
CPT 15 мг/кг	8	8	21,6±1,1	21,1±1,7	0,16±0,15**	87,5

Таблица 3 Ингибирующее действие СРТ на рост глиомы U251 человека (х±SD)
Группа	Объем опухоли (мм3)	RTV	Т/С (%)
Начало	Конец
Отрицательный контроль	165±72	1238±244	3,34±2,28
Кармустин (контроль)	153±35	109±78**	0,54±0,29**	16,0
СРТ 0,6 мг/кг	141±40	961±582	2,77±1,97	82,9
СРТ 1,7 мг/кг	131±34	588±215**	2,12±1,29	63,5
СРТ 5,0 мг/кг	133±57	510±333**	1,32±1,24*	39,5
СРТ 15 мг/кг	148±58	261±238**	0,71±0,57**	21,3
*Р<0,05 **P<0,01 по сравнению с группой отрицательного контроля

2. Ингибирующее действие на рост клеток NCI-H460 рака легкого человека

В качестве положительного контроля использовали циклофосфамид (Shanghai Hualian Pharma Inc., P. R. China), вводимый внутрибрюшинной инъекцией в дозе 100 мг/кг. Одну дополнительную инъекцию вводили в дозе 80 мг/кг через две недели. СРТ вводили трем группам обработки в дозах 1,7 мг/кг, 5,0 мг/кг, 15 мг/кг соответственно внутрибрюшинной инъекцией один раз в день. В целом эта обработка включала в себя десять инъекций.

Экспериментальные результаты показаны в таблицах 4 и 5 и на фигурах 3 и 5. На них видно, что СРТ обладает значительным ингибирующим действием на рост трансплантированных опухолей (рака легкого человека NCI-H460) у «голых» мышей. Интенсивность ингибирования опухоли, рассчитанная на массу для трех групп обработки, составляла 52,2%, 74,5% и 87,0% соответственно. По сравнению с контрольной группой массы опухолей у этих групп обработки обнаруживали значительное или очень значимое статистическое различие. Величины относительной интенсивности роста опухолей (%) для групп, получавших 5,0 мг/кг и 15 мг/кг, были <60; относительные объемы опухоли (RTV) значительно отличались по статистике по сравнению с этой величиной в контрольной группе.

Таблица 4 Ингибирующее действие СРТ на рост клеток рака легкого NCI-H460 человека
Группа	Количество животных	Масса тела (г)	Масса опухоли (г)	Скорость ингибирования (%)
Начало	Конец	Начало	Конец
Отрицательный контроль	8	7	21,4±0,9	19,3±1,0	1,61±0,65
Циклофосфамид (контроль)	8	7	20,0±1,3	16,1±2,2	0,96±0,35*	40,4
СРТ 1,7 мг/кг	8	7	20,1±1,9	19,8±1,6	0,77±0,19**	52,2
CPT 5,0 мг/кг	8	8	20,4±1,9	18,5±2,5	0,41±0,28**	74,5
CPT 15 мг/кг	8	8	20,9±1,1	21,1±1,7	0,21±0,10**	87,0

Таблица 5 Ингибирующее действие СРТ на рост клеток рака легкого NCI-H460 человека
Группа	Объем опухоли (мм3)	RTV	Т/С (%)
Начало	Конец
Отрицательный контроль	169±58	1874±637	5,98±4,05
Циклофосфамид (контроль)	179±52	1121±434	3,67±2,15	61,4
СРТ 1,7 мг/кг	200±103	706±170*	2,27±1,13*	38,0
СРТ 5,0 мг/кг	187±51	469±359**	1,49±0,76**	24,9
СРТ 15 мг/кг	192±63	189±102**	0,79±0,25**	13,2
*Р<0,05 **P<0,01 по сравнению с группой отрицательного контроля

Результаты гистопатологических испытаний показаны на фиг. 4-1 - фиг. 4-6. Фигуры 4-1, 4-3 и 4-5 были группой отрицательного контроля. На фигуре 4-1 показано, что ткани опухоли диффундировали и были подобны гроздьям. В центре опухоли наблюдался большой разжиженный некроз. Опухоль была окружена тонкой мембраной соединительной ткани и была слабо инфильтрирована лимфоцитами. На фигуре 4-3 показано, что клетки опухоли были расположены в виде гроздеподобных и тяжеподобных структур. Ткань опухоли была обогащена капиллярами и не была инфильтрирована лимфоцитами. На фигуре 4-5 показано, что опухолевые клетки были круглыми или многоугольными, имели большие ядра и имели мало цитоплазмы. Хроматин был рыхлым, ядра были прозрачными с 2-3 ядрышками, которые обнаруживали многочисленные признаки митоза. Фигуры 4-2, 4-4 и 4-6 относятся к группе, которой вводили 15 мг/кг СРТ. На фигуре 4-2 показано, что ткани опухоли были твердыми гроздьями и в центре был виден пластиноподобный некроз. В этой опухоли было большое количество пролиферированной соединительной ткани и тонкая оболочка соединительной ткани была вокруг опухоли. Опухоль была слабо инфильтрирована лимфоцитами. На фигуре 4-4 показано, что клетки опухоли были расположены в виде тяжеподобных структур. Ткань опухоли содержала мало капилляров и имела некроз в центре. Она была окружена оболочкой из соединительной ткани и была инфильтрирована небольшим количеством лимфоцитов. На фиг. 4-6 показано, что опухолевые клетки были круглыми или многоугольными, ядра были большими и в них содержалось мало цитоплазмы. Хроматин был рыхлым, с признаками митоза. Опухоль содержала мало капилляров и имела некроз со множественными небольшими очагами в форме точек.

Ясно, что лекарственное средство по настоящему изобретению оказывало сильное ингибирующее действие на клетки NCI-H460 рака легкого человека.

3. Ингибирующее действие на рост клеток COLO 205 рака прямой кишки человека

В качестве положительного контроля использовали инъецируемый гидроксикамптотецин (товарное название: Xi Su, Wuhan Lishizhen Pharmaceuticals Inc., Huangshi Lishizhen Pharmaceuticals Group, P. R. China), вводимый внутрибрюшинной инъекцией в дозе 1 мг/кг один раз в день. Введение заканчивали через 15 дней последовательных введений. Наблюдали значительный рост опухоли; таким образом гидроксикамптотецин вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг в течение еще недели через 8 дней. Единственное введение 80 мг/кг гидроксикамптотецина дополнительно осуществляли через две недели. СРТ вводили трем группам обработки в дозах 1,7 мг/кг, 5,0 мг/кг, 15 мг/кг соответственно внутрибрюшинной инъекцией один раз в день. В целом эта обработка включала в себя 15 инъекций.

Экспериментальные результаты показаны в таблицах 6 и 7 и на фигурах 6 и 7-1 - 7-5, где фиг. 7-1 относится к группе отрицательного контроля; фиг. 7-2 относится к группе, которой вводили 15,0 мг/кг СРТ; фиг. 7-3 относится к группе, которой вводили 5,0 мг/кг CPT; фиг. 7-4 относится к группе, которой вводили 1,7 мг/кг СРТ; фиг. 7-5 относится к группе положительного контроля с гидроксикамптотецином. Результаты показали, что СРТ проявляет значительное ингибирующее действие на рост трансплантированной опухоли (рака COLO 205 прямой кишки человека) у «голых» мышей. Опухоли значительно уменьшались в размере в группе, которой вводили высокие дозы СРТ после пяти дней введения. Некоторые опухоли даже исчезали при увеличении числа введений. Наблюдения за этими мышами проводили в течение четырех недель после прекращения введения и в 1 из 3 животных не наблюдали опухоли. Макроскопический анатомический анализ мышей обнаружил только некоторые признаки инокуляции под кожей. Интенсивности ингибирования опухолей в расчете на массу для трех обработанных групп были 79,6%, 90,8% и 97,4% соответственно. По сравнению с контрольной группой массы опухолей у этих групп обработки обнаруживали значительное или очень значимое статистическое различие. Величины относительной интенсивности роста опухолей Т/С(%) для обработанных групп были <60; относительные объемы опухоли (RTV) были значимо отличающимися по статистике по сравнению с этой величиной у контрольной группы. В частности, величина Т/С(%) для группы, обработанной высокой дозой СРТ, была <10, что указывало на то, что СРТ проявлял высокую активность в отношении этого типа опухоли.

Таблица 6 Ингибирующее действие СРТ на рост клеток рака прямой кишки COLO 205 человека
Группа	Количество животных	Масса тела (г)	Масса опухоли (г)	Скорость ингибирования (%)
Начало	Конец	Начало	Конец
Отрицательный контроль	8	8	19,5±0,8	21,9±1,9	1,96±0,73
Гидроксикам-птотецин (контроль)	8	8	20,4±0,9	21,0±2,5	0,66±0,26**	66,3
СРТ 1,7 мг/кг	8	8	20,6±1,1	20,6±3,0	0,40±0,33**	79,6
CPT 5,0 мг/кг	8	7	20,2±0,8	21,4±1,2	0,18±0,15**	90,9
CPT 15 мг/кг	8	8	20,0±0,5	21,1±2,4	0,05±0,05**	97,4

Таблица 7 Ингибирующее действие СРТ на рост клеток рака прямой кишки COLO 205 человека
Группа	Объем опухоли (мм3)	RTV	Т/С (%)
Начало	Конец
Отрицательный контроль	151±79	2532±1190	8,30±5,53
Гидроксисам-птотецин (контроль)	150±34	845±66**	3,92±1,91*	47,2
СРТ 1,7 мг/кг	205±47	582±408**	1,62±0,62**	19,5
СРТ 5,0 мг/кг	180±63	314±175**	0,91±0,35**	11,0
СРТ 15 мг/кг	192±81	52±53**	0,33±0,27**	4,0
*Р<0,05 **P<0,01 по сравнению с группой отрицательного контроля

Промышленная применимость

Анализ восстановления тетразолия (МТТ) использовали для определения противоракового действия лекарственного средства. Кривые доза-ответ получали нанесением на график интенсивностей ингибирования клеток и различных концентраций лекарственного средства и рассчитывали концентрации ингибирования 50% клеток (IC₅₀). Наблюдения на многочисленных линиях опухолевых клеток человека показали, что композиция СРТ обладает значительным ингибирующим действием на рост опухолевых клеток. СРТ проявлял очень значительную цитолизную активность in vitro на клетках более чем 10 опухолей, включающих в себя рак легкого человека, рак прямой кишки, рак молочной железы, рак желудка, рак поджелудочной железы, глиому, рак клеток крови, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, колоректальный рак кишки, рак шейки матки и клетки опухоли головного мозга. Концентрации ингибирования 50% клеток (IC₅₀) СРТ для U251 (клетки глиомы головного мозга человека), COLO 205 (клетки рака прямой кишки человека), NCI-H460 (клетки рака легкого человека), MDA-MB-435 (клетки рака молочной железы человека) были <0,01 мкг/мл. Величины IC₅₀ СРТ для HL-60 (клетки промиелоцитарного лейкоза человека), MDA-MB-231 (клетки рака молочной железы человека), РС-3 (клетки рака поджелудочной железы человека) и Н125 (клетки рака легкого человека) равны <0,1 мкг/мл. IC₅₀ СРТ для RPMI 8226 (клетки множественной миеломы человека) равна <1 мкг/мл. СРТ обнаруживает также некоторое ингибирующее действие на рост SCLC (клетки мелкоклеточного рака легкого человека).

Экспериментальные результаты in vivo показывают, что внутрибрюшинное введение СРТ в дозе 15 мг/кг/день в течение 10-15 последовательных дней обнаруживало очень значимое ингибирующее действие на рост опухолевых клеток, в том числе на рост рака прямой кишки человека COLO 205, рака легкого человека NCI-H460, глиомы человека U251 и т.д.

По сравнению с группой отрицательного контроля, которая не получала лекарственного средства, СРТ может значительно замедлять рост опухолей у животных, и высокая доза введения на ранней стадии роста трансплантированной опухоли может приводить к уменьшению опухоли в объеме или даже к ее исчезновению. Действие СРТ явно зависит от дозы. Кроме того, эффективность в некоторой степени связана с курсом лечения. На моделях «голых» мышей, которым трансплантировали клетки опухоли прямой кишки человека COLO 205, наблюдали, что размеры опухоли были меньше, чем размеры перед введением, даже спустя четыре недели после прекращения введения, при котором эти мыши получали 15 последовательных инъекций СРТ в дозе 15 мг/кг/день. Наличие опухолей было невозможно подтвердить в местах инокуляции в 1 из 3 животных, и только признаки, вызываемые инокуляцией, наблюдали во время анатомического анализа.

Все эти данные свидетельствуют о том, что введение СРТ показало значимое ингибирующее действие на рост трансплантированных опухолей человека у «голых» мышей. По сравнению с контрольной группой для U251 интенсивность ингибирования 15 мг/кг СРТ в расчете на массу опухоли составляла 87,5% и 87,7% соответственно; для NCI-H460 интенсивность ингибирования составляла 87,0% и 88,8% соответственно; для COLO 205 интенсивность ингибирования составляла 97,4% и 97,8% соответственно, что свидетельствует об очень значимом статистическом различии. В изобретении использовали три модели для проведения эксперимента. Результаты показали, что относительные объемы опухоли (RTV) на этих трех моделях животных обнаружили статистически значимое различие по сравнению с группой отрицательного контроля, где этим животным непрерывно вводили СРТ в дозе 5,0 мг/кг в течение 10-15 дней. Данные для группы, обработанной 15 мг/кг СРТ, значительно отличались от данных группы отрицательного контроля, причем все величины Т/С (%) являются меньшими, чем 25, иногда даже меньшими, чем 10, что указывает на то, что СРТ имел высокую противоопухолевую активность, и эти эксперименты имели хорошую воспроизводимость.

СРТ не проявлял каких-либо побочных или токсических действий у животных. Не наблюдали существенного различия в параметрах, относящихся к статусу жизни мышей, таких как масса тела и жизнеспособность обработанных групп по сравнению с этими же параметрами группы отрицательного контроля за исключением того, что размеры опухоли у обработанных мышей были меньше. На основании приведенного выше было продемонстрировано, что СРТ обладает значительным селективным ингибирующим действием на опухолевые клетки и СРТ не индуцирует апоптоз клеток нормальных тканей. Таким образом, СРТ может быть использован в качестве эффективного и безопасного лекарственного средства для лечения рака. СРТ является как теоретически, так и в промышленном плане важным и имеет перспективное будущее на рынке.

1. Рекомбинантный белок, обладающий противораковым действием, который выбран из группы, состоящей из:

1) белка с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:2;

2) белка, аминокислотная последовательность которого более чем на 90% гомологична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, и который обладает такой же активностью как белок с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:2;

3) белок, полученный путем замены, делеции или добавления одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, и который обладает такой же активностью, как и белок с последовательностью, представленной bSEQ ID NO:2.

2. Белок по п.1, отличающийся тем, что белок имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2.

3. Ген, кодирующий рекомбинантный белок по п.1, выбранный из группы, состоящей из:

1) ДНК с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:1;

2) ДНК, кодирующей белок с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:2;

3) ДНК с нуклеотидной последовательностью, которая более чем на 90% гомологична последовательности ДНК, представленной в SEQ ID NO:1, и которая кодирует белок с такой же активностью, как и белок, кодируемый ДНК с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:1;

4) ДНК, кодирующей белок, полученный путем замены, делеции или добавления одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, и который обладает такой же активностью как и белок с последовательностью, представленной в SEQ ID NO:2.

4. Ген по п.3, отличающийся тем, что его нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO:1.

5. Лекарственное средство для лечения рака, содержащее в качестве активного ингредиента рекомбинантный белок по п.1 или 2.

6. Вектор экспрессии, содержащий ген по п.3 или 4.

7. Клеточная линия, содержащая ген по п.3 или 4, предназначенная для экспрессии рекомбинантного белка.

8. Применение рекомбинантного белка по п.1 или 2 для получения лекарственного средства для лечения рака.

9. Применение по п.8, где указанный рак выбран из группы, включающей рак прямой кишки, рак легкого, множественную миелому, глиому головного мозга, лейкоз, рак молочной железы, мелкоклеточный рак легкого и рак поджелудочной железы.

10. Применение по п.9, где указанным раком является множественная миелома.

11. Применение по п.9, где указанным раком является лейкоз.

12. Применение по п.9, где указанным раком является глиома головного мозга.

13. Применение по п.9, где указанным раком является рак легкого.

14. Применение по п.9, где указанным раком является рак прямой кишки.