Способ получения соединения цинка селенита как средства, обладающего нейропротекторным действием
Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к фармацевтической промышленности. Изобретение касается способа получения соединения, обладающего нейропротекторной активностью, представляющего собой селенит цинка. Цинка селенит получают путем смешения водных растворов цинка сульфата и натрия селенита в эквимолярном соотношении. Растворы перемешивают стеклянной палочкой в течение 1 -2 минут до выпадения белого студенистого, а затем и кристаллического осадка. Полученный осадок фильтруют, промывают водой до отрицательной реакции на сульфаты и сушат до постоянной массы при температуре 100°С. Установлено, что цинка селенит оказывает нейропротекторное действие: снижает смертность, улучшает двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность, уменьшает тревожность, обладает антиамнестическим эффектом, улучшает координацию движений. При профилактическом введении селенит цинка существенно снижает проявление гиперперфузии и тормозит развитие фазы невосстановления МК в постишемическом периоде. Преимуществом предлагаемого соединения является постоянное соотношение цинка и селена в индивидуальном соединении, что дает возможность осуществлять гибкий подход к дозированию. В сравнительном аспекте селенит цинка выгодно отличается от селенита натрия тем, что значительно превосходит свой прототип по антигипоксической и ноотропной активности. 9 табл.
Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к фармацевтической промышленности, и касается лекарственных средств, обладающих нейропротекторной активностью и восполняющих дефицит селена и цинка в организме.
Селен - один из биологически важных микроэлементов, присутствующих в организме человека и участвующих в метаболических, биофизических и энергетических реакциях организма, обеспечивающих жизнеспособность и функции клеток, тканей, органов и организма в целом. Высокая эффективность селена связана с его способностью повышать активность глютатионпероксидазы (GPX). Этот фермент способствует накоплению глутатиона, прекращающего или ограничивающего процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), и его распространению. (Микроэлементозы человека / А.П.Авцын, А.А.Жаворонков, М.А.Риш, Л.С.Строчкова. - М.: Медицина. 1991. - С.196-231).
С селеном в организме тесно связано присутствие другого важного микроэлемента - цинка. Селен и цинк - необходимые компоненты для иммунной системы, способствуют усвоению витаминов группы В, защищают химические структуры от окисления, являются кофакторами многих ферментов, улучшают обменные процессы и синтез половых гормонов.
Удержание цинка организмом при введении натрия селенита возрастает в два раза, что позволяет вводить минимальные дозы цинка и достигать высокой эффективности по коррекции. Совместное введение натрия селенита и хлорида цинка мышам приводит к снижению концентрации селена в сердце и печени, в то время как в плазме, легких, мозге, почках, селезенке и яичках уровень микроэлемента не изменяется. Взаимосвязь селена и цинка может иметь особое значение при раке предстательной железы - заболевании, для которого характерны многократное усиление накопления цинка в строме железы и снижение показателей селенового статуса организма (Селен в организме человека: метаболизм, антиоксидантные свойства, роль в канцерогенезе / Тутельян В.А., Княжев В.А., Хотимченко С.А., Голубкина Н.А. - М.: Издательство РАМН. 2002. - 224 с.).
Прототипом предлагаемого нейропротекторного вещества является неоселен (Неоселен: Фармакоп. ст. - 42-3353-96 - М., 1996. - 8 с.). Неоселен обладает антигипоксическим и антиоксидантным действием и применяется для лечения ИБС, инфаркта миокарда, гипертонической болезни, нарушений памяти, состояниях после острого нарушения мозгового кровообращения и для профилактики алиментарной недостаточности селена.
Известно средство, используемое для профилактики и лечения заболеваний, развивающихся на фоне недостаточности селена и цинка, которое увеличивает сопротивляемость организма к различным вредным воздействиям окружающей среды - селцинк плюс. (Федеральный реестр биологически активных добавок к пище / Под ред. Т.Л.Пилат. - М.: Изд-во «Когелет», 2002. - 532 с.). Этот аналог наиболее близок к предлагаемому и поэтому взят в качестве прототипа, представляет собой сбалансированный комплекс, в состав которого входит селен, цинк, аскорбиновая кислота, β-каротин, витамин Е. Дозировки соответствуют суточной норме и подобраны с учетом взаимодействия каждого отдельного компонента. Недостатком фиксированной композиции является невозможность варьировать дозы каждого из входящих компонентов, что затрудняет лечение, особенно при появлении побочных реакций и непереносимости.
Преимуществом предлагаемого соединения является постоянное соотношение цинка и селена в индивидуальном соединении, что дает возможность осуществлять гибкий подход к дозированию.
Технической задачей является создание вещества, содержащего селен и цинк в виде цинка селенита и обеспечивающего в результате синергизма усиление антиоксидантного действия, обуславливающего нейропротекторный эффект.
Соединение получают следующим образом.
Для приготовления цинка селенита используют цинка сульфат и натрия селенит в эквимолярных соотношениях. Цинка сульфат и натрия селенит предварительно высушивают при температуре 100°С в сушильном шкафу до постоянной массы. В колбу вместимостью 1 л помещают равные объемы 25% раствора цинка сульфата и 15% раствора натрия селенита, затем содержимое колбы перемешивают стеклянной палочкой в течение 1-2 минут до выпадения белого студенистого, а затем кристаллического осадка. Полученной смеси дают отстоятся, фильтруют через бумажный фильтр, осадок на фильтре промывают водой порциями по 10 мл до отрицательной реакции на сульфаты (Государственная Фармакопея СССР: Общие методы анализа / МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1987. - Вып.1. - 336 с.), сушат до постоянной массы при температуре 100°С.
Выход составляет 23%.
Полученный цинка селенит представляет собой белый кристаллический порошок, без запаха, очень мало растворим в воде, легко растворим в растворах кислот и щелочей, практически не растворим в спирте, хлороформе, эфире.
Подлинность. 0,1 г цинка селенита растворяют в 2 мл разведенной хлористоводородной кислоты и добавляют 8 мл воды. К полученному раствору прибавляют 0,5 мл раствора ферроцианида калия; образуется белый осадок, не растворимый в разведенной хлористоводородной кислоте.
0,1 г цинка селенита растворяют в 5 мл 0,1 моль/л раствора кислоты хлористоводородной разведенной, прибавляют 1 мл раствора гидроксиламина гидрохлорида, перемешивают и нагревают на водяной бане в течение 10 мин, выпадает красный осадок или образовывается красная взвесь.
Количественное определение.
1. Около 0,2 г цинка селенита (точная навеска) помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 2 мл разведенной хлористоводородной кислоте, добавляют 20 мл воды. Полученный раствор нейтрализуют раствором аммиака в присутствии 1 капли раствора метилового красного, прибавляют 5 мл аммиачного буферного раствора и титруют 0,05 моль/л раствором Трилона Б до синего окрашивания (индикатор - кислотный хром черный специальный).
1 мл 0,05 моль/л раствора Трилона Б соответствует 0,009617 г ZnSeO3, которого в препарате должно быть не менее 98%.
2. Около 0,1 г (точная навеска) цинка селенита помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл с притертой пробкой и растворяют в 5 мл кислоты хлористоводородной. Прибавляют 10 мл раствора калия иодида (3:10) и 50 мл воды, тщательно перемешивают, закрывают стеклянной пробкой и оставляют в темном месте на 10 мин. Прибавляют 10 мл воды и 3 мл крахмала и титруют 0,1 моль/л раствором натрия тиосульфата до обесцвечивания, затем титруют 0,1 моль/л раствором иода до синего окрашивания. Параллельно проводят контрольный опыт.
1 мл 0,1 моль/л раствора натрия тиосульфата соответствует 0,004808 г натрия селенита, которого в препарате должно быть не менее 96%.
Фармакологические исследования проведены на 158 белых крысах обоего пола, массой 200-250 г, а также на 102 мышах массой 20-25 г. В качестве наркоза использовали хлоралгидрат в дозе 300 мкг/кг. Цинка селенит в виде водного раствора вводили внутрибрюшинно в дозах 30, 50, 100 мкг/кг.
Острая токсичность изучалась на белых мышах обоего пола массой 20-25 г при внутрибрюшинном введении исследуемого вещества. Наблюдение за поведением и состоянием подопытных животных проводилось в течение 14 суток, при этом отмечали внешний вид, поведенческие реакции и количество погибших животных (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. В.П.Фисенко [и др.] - М.: ИАА «Ремедиум», 2000. - С.398). Результаты проведенных исследований показали, что согласно требованиям табуляции классов токсичности цинка селенит относится ко второму классу токсичности, LD50 составила 3,75 мг/кг.
Объемную скорость мозгового кровотока регистрировали методом водородного клиренса с помощью платинного электрода, расположенного на поверхности сагиттального синуса в области стока синусов.
Ориентировочно-исследовательское поведение изучали в условиях модели "открытое поле", представляющей один из наиболее часто используемых методических приемов, применяемых для суждения о функциональном состоянии центральной нервной системы (Буреш Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения / Я.Буреш, О.Бурешова, Дж.П.Хьюстон. - М.: Высшая школа, 1991. - 398 с). Вырабатывали условный рефлекс пассивного избегания и регистрировали его воспроизведение. Координацию движений оценивали по времени удержания на вращающемся стержне.
Для создания патологического фона, на котором изучалась эффективность исследуемых соединений, использовались различные модели циркуляторных гипоксий. В одной из них циркуляторную гипоксию воспроизводили двухсторонней перевязкой общих сонных артерий. Критерием эффективности антигипоксического действия была выживаемость животных в течение 72 часов. Вторую модель ишемии мозга создавали критическими гравитационными перегрузками в краниокаудальном положении животных. Нормобарическую гипоксию с гиперкапнией вызывали путем помещения мышей в герметически закрытые банки (т.н. «баночная гипоксия»). Во всех случаях регистрировали время выживания животных.
Для оценки действия исследуемого соединения на динамику развития постишемических цереброваскулярных феноменов воспроизводили ишемию мозга путем двухсторонней окклюзии общих сонных артерий в течение 10-12 мин при снижении САД до 40 мм рт.ст. После ишемии и реинфузии крови в артериальную систему животного осуществляли регистрацию скорости МК методом клиренса водорода. В качестве препарата сравнения использовали натрия селенит в дозе 100 мкг/кг.
Полученные экспериментальные данные обрабатывали статистически по критерию Стьюдента (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. В.П.Фисенко [и др.] - М.: ИАА «Ремедиум», 2000. - С.398).
Как показывают данные в таблице 1-3, натрия селенит обладает выраженной антигипоксической активностью. В условиях нормобарической гипоксии с гиперкапнией наибольший эффект проявлялся в дозе 30 мкг/кг, выживаемость животных увеличивалась в среднем на 43% в сравнении с контролем (табл.1).
Как следует из таблицы 2, цинка селенит повышает устойчивость белых крыс к циркуляторной гипоксии, вызванной билатеральной окклюзией общих сонных артерий, наиболее выраженный эффект наблюдался при его введении в дозе 50 мкг/кг (выживаемость животных к концу наблюдения составила 62,5%, в контроле - 25%).
Известно, что продольные гравитационные перегрузки, создаваемые центрифугой, вызывают нарушения кровоснабжения головного мозга. Животных помещали в отдельные продольные ячейки, объем ячеек соответствовал размеру животных и не давал возможности самопроизвольно отклоняться от заданного вектора ускорения. Цинка селенит вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мкг/кг за 10-15 минут до перегрузок. Центрифугирование животных проводили в 2 этапа. На первом этапе исследования крысы подвергались воздействию перегрузок величиной 16 g в течение 10 минут, после чего центрифугу останавливали на 5 минут. На втором этапе исследований, по истечении 5 минутного перерыва, животные подвергались перегрузкам величиной 21 g в течение 5 минут. Большинство животных погибло на втором этапе исследований. Так, в контрольной группе на первой стадии эксперимента погибли 2 крысы из 12, что составило 16,7%, при повторном центрифугировании погибли 3 крысы, выживаемость составила 58,3%. Цинка селенит проявлял выраженный защитный эффект: на первой стадии эксперимента не погибло ни одного животного. Выживаемость крыс составила 100%. На втором этапе исследований погибла 1 крыса из 12, выживаемость составила 91,7% (таблица 3).
В каждой группе животных проводилось тестирование психоневрологического статуса. Исследование проводили на второй, четвертый и седьмой день после перенесенных перегрузок. В постишемическом периоде в контрольных опытах отмечалось снижение двигательной активности, о чем свидетельствует уменьшение числа пересеченных секторов, снижение познавательной активности (уменьшение числа вертикальных стоек) крыс и их эмоционального состояния (уменьшение актов груминга и числа дефекаций). Эти нарушения наиболее ярко проявлялись в течение первых дней после ишемии, а в последующие сутки несколько ослабевали. Цинка селенит повышал двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность крыс, перенесших ишемию мозга, и снижал уровень эмоционального напряжения. Лучшим выражением уменьшения страха у животных является посещение ими центрального сектора, которое постепенно становилось более интенсивным от опыта к опыту.
При выработке УРПИ после ишемии мозга в контрольной группе отмечалось ухудшение обучаемости крыс, что выражалось в уменьшении латентного периода захода в темный отсек и в увеличении длительности пребывания в нем. Цинка селенит при профилактическом введении оказывает положительное влияние на процессы обучения и воспроизведения памятного следа: значительно увеличивает латентный период захода в темный отсек и уменьшает время пребывания в нем. При этом эффект цинка селенита превосходит по ноотропной активности (сохранность ориентирвочно-исследовательского поведения в открытом поле и условного рефлекса пассивного избегания после гипоксической травмы) препарат сравнения натрия селенит, таблица 4, 5, 6, 7.
В постишемическом периоде в группе контрольных животных отмечалось ухудшение координации движений. Цинка селенит ослаблял вызванное ишемией нарушение координации движений, что проявлялось в увеличении времени удержания крыс на вращающемся стержне. Так, в контрольных опытах количество животных, удержавшихся на вращающемся стержне в течение 3-х минут, составило 42,9%. При предварительном введении цинка селенита повышался процент крыс, удержавшихся на стержне, и к концу недели эти показатели составили 54,6% (Таблица 8). Профилактическое введение цинка селенита до ишемии мозга существенно изменяет динамику развития постишемических цереброваскулярных феноменов, уменьшает степень проявления фазы гиперперфузии и тормозит развитие фазы невосстановления мозгового кровотока, таблица 9.
Таким образом, цинка селенит при профилактическом введении оказывает нейропротекторное действие в условиях острого нарушения мозгового кровообращения, снижает смертность животных, положительно влияет на двигательную и исследовательскую активность, уменьшает тревожность, обладает антиамнестическим эффектом, улучшает координацию движений.
В сравнительном аспекте цинка селенит выгодно отличается от натрия селенита тем, что значительно превосходит свой прототип по антигипоксической и ноотропной активности.
Преимуществом предлагаемого способа является то, что присутствие в предлагаемом соединении двух активных антиоксидантов селена и цинка усиливает нейропротекторный эффект.
| Таблица 1 | ||||
| Влияние натрия селенита и цинка селенита на продолжительность жизни мышей в условиях нормобарической гипоксии (М±m, Δ%) | ||||
| Исследуемые вещества | Дозы, мкг/кг | Кол-во животных | Среднее время жизни | |
| минуты | Δ% от контроля | |||
| Физ. раствор | 10 | 57,0±9,0 | - | |
| Натрия селенит | 30 | 10 | 69,5±22,3* | +21,9%* |
| 50 | 10 | 64,5±8,5** | +13,2%** | |
| 100 | 10 | 58,5±7,5 | +2,6% | |
| Цинка селенит | 30 | 10 | 81,5±24,8* | +43,0%** |
| 50 | 10 | 67,5±17,0* | +18,4%* | |
| 100 | 10 | 59,0±8,8 | +3,5% | |
| Примечание 1 * - достоверно относительно физ. раствора; р≤0,05 2 ** - достоверно относительно физ. раствора; р≤0,01 |
| Таблица 2 | ||||||||
| Влияние натрия селенита и цинка селенита на устойчивость белых крыс к циркуляторной гипоксии (М±m, Δ%) | ||||||||
| Исследуемы е вещества | Дозы, мкг/кг | Кол-во животных | Кол-во выживших животных | |||||
| Через 24 часа | Через 48 часов | Через 72 часа | ||||||
| Абс. | % | Абс. | % | Абс. | % | |||
| Физ. раствор | 8 | 5 | 62,5 | 3 | 37,5 | 2 | 25 | |
| Натрия селенит | 30 | 8 | 5 | 62,5 | 4 | 50 | 4 | 50 |
| 50 | 8 | 6 | 75 | 5 | 62,5* | 5 | 62,5* | |
| 100 | 8 | 5 | 62,5 | 4 | 50 | 4 | 50 | |
| Цинка селенит | 30 | 8 | 5 | 62,5 | 5 | 62,5 | 4 | 50 |
| 50 | 8 | 6 | 75 | 6 | 75 | 5 | 62,5* | |
| 100 | 8 | 6 | 75 | 5 | 62,5* | 5 | 62,5* | |
| Примечание - достоверно относительно физ. раствора; * - р≤0,05 |
| Таблица 3 | ||||
| Влияние натрия селенита и цинка селенита (100 мкг/кг, внутрибрюшинно) на устойчивость белых крыс к гравитационным перегрузкам в краниокаудальном направлении | ||||
| Вещество | 1 стадия | 2 стадия | ||
| Количество выживших животных | % выживших животных | Количество выживших животных | % выживших животных | |
| Контроль | 10 | 83,3% | 7 | 58,3% |
| Натрия селенит | 11 | 91,7% | 9 | 75,0% |
| Цинка селенит | 12 | 100,0% | 11* | 91,7% |
| Примечание - достоверно относительно контроля; * - р≤0,05 |
| Таблица 4 | |||||
| Оценка ЛПЗ у белых крыс, получавших натрия селенит до ишемии мозга | |||||
| Исследуемые вещества | Дозы, мкг/кг | Кол-во животных | Латентный период первого захода крыс в темный отсек в сек. | ||
| 2 день | 4 день | 7 день | |||
| Физ. раствор | 7 | 88,6±30,2 | 122,1±41,0 | 153,6±24,5# | |
| Натрия селенит | 100 | 9 | 120,6±30,7 | 127,8±40,2 | 147,2±34,8 |
| Примечание - достоверно относительно контроля (интактные крысы), # - р≤0,05 |
| Таблица 5 | |||||
| Оценка ЛПЗ у белых крыс, получавших цинка селенит до ишемии мозга | |||||
| Исследуемые вещества | Дозы, мкг/кг | Кол-во животных | Латентный период первого захода крыс в темный отсек в сек. | ||
| 2 день | 4 день | 7 день | |||
| Физ.раствор | 7 | 88,6±30,2 | 122,1±41,0 | 153,6±24,5 | |
| Цинка селенит | 100 | 11 | 155,5±31,2*$ | 145,9±22,6# | 150,0±27,3 |
| Примечание 1 достоверно относительно контроля (крысы, перенесшие ишемию мозга), * - р≤0,05 2 достоверно относительно контроля (интактные крысы), # - р≤0,05 3 достоверно относительно цинка селенита (интактные крысы), $ - р≤0,05 |
| Таблица 6 | |||||
| Оценка времени пребывания белых крыс в темном отсеке у белых крыс, получавших натрия селенит до ишемии мозга | |||||
| Исследуемые вещества | Дозы, мкг/кг | Кол-во животных | Время пребывания крыс в темном отсеке в сек. | ||
| 2 день | 4 день | 7 день | |||
| Физ. раствор | 7 | 20,0±10,0 | 11,4±7,8 | 3,6±4,1# | |
| Натрия селенит | 100 | 9 | 9,4±6,2$ | 5,0±5,0# | 4,2±4,0# |
| Примечание 1 достоверно относительно контроля (крысы, перенесшие ишемию мозга), * - р≤0,05 2 достоверно относительно контроля (интактные крысы), # - p≤0,05 3 достоверно относительно цинка селенита (крысы, перенесшие ишемию мозга), $ - р≤0,05 |
| Таблица 7 | |||||
| Оценка времени пребывания белых крыс в темном отсеке у белых крыс, получавших цинка селенит до ишемии мозга | |||||
| Исследуемые вещества | Дозы, мкг/кг | Кол-во животных | Время пребывания крыс в темном отсеке в сек. | ||
| 2 день | 4 день | 7 день | |||
| Физ. раствор | 7 | 20,0±10,0 | 11,4±7,8 | 3,6±4,1# | |
| Цинка селенит | 100 | 11 | 1,8±2,6*#$ | 6,8±5,3# | 4,1±4,5# |
| Примечание 1 достоверно относительно контроля (крысы, перенесшие ишемию мозга), * - р≤0,05 2 достоверно относительно контроля (интактные крысы), # - p≤0,05 3 достоверно относительно натрия селенита (крысы, перенесшие ишемию мозга), $ - р≤0,05 |
| Таблица 8 | ||||||||
| Влияние профилактического введения цинка селенита на координацию движений белых крыс, перенесших тотальную ишемию мозга | ||||||||
| Исследуемые вещества | Дозы, мкг/кг | Кол-во крыс | Кол-во животных, оставшихся на стержне | |||||
| 2 день | 4 день | 7 день | ||||||
| Абс. | % | Абс. | % | Абс. | % | |||
| Физ. раствор | 7 | 3 | 42,9 | 4 | 57,2 | 3 | 42,9 | |
| Цинка селенит | 100 | 11 | 2 | 18,2#* | 3 | 27,3#$ | 6 | 54,5& |
| Примечание 1 достоверно относительно контроля (интактные крысы), # - p≤0,05 2 достоверно относительно натрия селенита (крысы, перенесшие ишемию мозга), * - р≤0,05 3 достоверно относительно натрия селенита (интактные крысы), $ - р≤0,05 |
| Таблица 9 | |||
| Влияние натрия селенита и цинка селенита (100 мкг/кг) на мозговой кровоток белых крыс в постишемическом периоде. | |||
| Исходные данные МК мл/100г/мин | Контроль 101,4±8,4 | Натрия селенит 81,8±27,8 | Цинка селенит 61,6±19,2 |
| Время после введения цинка селенита | % от исходных данных | ||
| Через 5 мин | +27,8±5,1* | +8,8±29,8* | +2,4±57,1* |
| 15 мин | +3,2±4,6 | -20,7±30,4* | +7,2±54,8* |
| 30 мин | -12,7±2,1* | -26,9±41,3* | -31,8±32,6* |
| 45 мин | -20,0±2,5 | -23,1±30,3* | -22,6±26,4* |
| 60 мин | -37,0±1,9* | -28,3±41,3* | -19,1±24,9* |
| Примечание - достоверно относительно исходных данных, * р≤0,05 |
Способ получения соединения, обладающего нейропротекторной активностью, отличающийся тем, что высушенные до постоянной массы эквимолярные количества цинка сульфат и натрия селенит растворяют в воде, затем содержимое колбы перемешивают стеклянной палочкой в течение 1-2 мин до выпадения белого студенистого, а затем кристаллического осадка, фильтруют через бумажный фильтр, осадок на фильтре промывают водой порциями по 10 мл до отрицательной реакции на сульфаты, сушат до постоянной массы при температуре 100°С.
