Полипептид (варианты), действующий в комплексе с рецептором андрогена, нуклеиновая кислота (варианты), вектор (варианты) и клетка-хозяин (варианты)

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Полипептид с последовательностью SEQ ID NO:3 связывается с рецептором андрогенов и увеличивает способность рецептора андрогенов трансактивировать андроген-чувствительный ген. Предложены также нуклеиновая кислота, кодирующая такой полипептид, и вектор, содержащий такую нуклеиновую кислоту. Группа изобретений может быть использована для создания трансгенных животных, экспрессирующих ген белка, действующего в комплексе с рецептором андрогена, служащих моделями для разработки лекарственных средств для лечения рака. 12 н. и 12 з.п. ф-лы.

 

Данная заявка является частичным продолжением заявки США с серийным номером 09/781693, поданной 12 февраля 2001 года, и предварительной заявки США с серийным номером 60/262312, поданной 17 января 2001 года, и испрашивает приоритет на основании указанных заявок, содержание которых включено в данное описание в качестве ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Был идентифицирован ряд генов, экспрессирующихся в опухолевых клетках более интенсивно, чем в здоровых. Полагают, что идентификация таких генов предоставит мишени для лекарственных средств при разработке противораковых лекарственных средств и при диагностике рака. В опухолевых клетках печени количество стероидных рецепторов (например, рецепторов андрогенов) выше, чем в соседних здоровых клетках печени.

Стероидные гормоны обычно оказывают физиологические эффекты путем связывания со своими специфичными ядерными рецепторами с образованием комплексов, которые, в свою очередь, действуют как факторы транскрипции. Данные комплексы связываются со специфичными нуклеотидными последовательностями (элементами, чувствительными к стероидам) в промоторах чувствительных к стероидам генов, способствуя транскрипции указанных генов.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение основано на открытии мышиного гена, кодирующего белок, действующий в комплексе с рецептором андрогена (ARCAP), который на 85% идентичен человеческому ARCAP. Было обнаружено, что человеческий ARCAP экспрессируется в клетках гепатомы на повышенном уровне (по сравнению с соседними нормальными клетками), связывается с рецептором андрогенов и усиливает способность рецептора трансактивировать андроген-чувствительный ген. Как гомолог человеческого гена ARCAP, мышиный ген ARCAP можно использовать для получения трансгенной мыши, которая служит в качестве животной модели для разработки лекарственных средств для лечения рака (например, рака печени).

Полноразмерная кДНК мышиного ARCAP (обозначенная SEQ ID NO:1), с подчеркнутыми старт- и стоп-кодонами, приведена ниже:

Нуклеотидная последовательность, кодирующая мышиный белок ARCAP (т.е. от старт-кодона ATG до кодона, непосредственно предшествующего стоп-кодону в SEQ ID NO:1), обозначена SEQ ID NO:2. Мышиный белок ARCAP (обозначенный SEQ ID NO:3), кодируемый вышеупомянутой кДНК, приведен ниже:

Соответственно, отличительным признаком данного изобретения является по существу чистый полипептид или белок, включающий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 70% (например, по меньшей мере, на 75, 80, 85, 90, 95, 98, или 100%) идентичную SEQ ID NO:3. Если полипептид включает последовательность, на 100% идентичную SEQ ID NO:3, то полипептид может содержать до 30 консервативных аминокислотных замещений. Данное изобретение также включает по существу чистый полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, которая гибридизуется в жестких условиях с зондом, имеющим последовательность SEQ ID NO:2. Полипептид связывается с рецептором андрогенов и увеличивает способность рецептора андрогенов трансактивировать ген, чувствительный к андрогенам. Указанные полипептиды можно использовать для получения антител против ARCAP (либо моноклональных, либо поликлональных). Данные антитела, в свою очередь, могут применяться для детектирования присутствия и распределения ARCAP в тканях и клеточных компартментах. Например, такие антитела можно использовать для диагностирования раковой ткани печени путем определения наличия экспрессии или сверхэкспрессии ARCAP в ткани. Кроме того, их можно использовать для лечения рака (например, рака печени), как описано ниже.

Далее, отличительным признаком данного изобретения является изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид данного изобретения, вектор, включающий нуклеиновую кислоту данного изобретения, и клетка (в животной модели или в культуре), содержащая нуклеиновую кислоту данного изобретения. Пример нуклеиновой кислоты в пределах настоящего изобретения включает изолированную нуклеиновую кислоту, цепь которой гибридизуется в жестких условиях с одноцепочечным зондом, имеющим последовательность SEQ ID NO:2 или последовательность, комплементарную SEQ ID NO:2. Длина такой нуклеиновой кислоты может составлять, по меньшей мере, 15 (например, по меньшей мере, 30, 50, 100, 200, 500 или 1000) нуклеотидов. Указанные нуклеиновые кислоты, векторы и клетки могут использоваться для получения животной модели, диагностики рака (например, рака печени) или для получения полипептидов данного изобретения. Например, нуклеиновые кислоты данного изобретения можно использовать для диагностики рака печени путем определения наличия в ткани или клетке экспрессии или сверхэкспрессии мРНК ARCAP. Нуклеиновые кислоты могут использоваться в качестве праймеров в методах детекции на основе ПЦР или в качестве меченых зондов в нуклеотидных блотах (например, Нозерн-блотах).

Отличительным признаком данного изобретения является трансгенное животное (например, такой грызун, как мышь), чей геном включает трансген, содержащий нуклеиновую кислоту данного изобретения, и проявляет повышенную чувствительность к андрогену по сравнению с животным дикого типа. Трансгенное животное может быть получено путем введения нуклеиновой кислоты данного изобретения в клетку так, что из нуклеиновой кислоты получается транскрипт, и транскрипт транслируется в белок. Указанных трансгенных животных можно использовать в качестве моделей для разработки лекарственных средств для лечения рака (например, рака печени).

Кроме того, отличительным признаком данного изобретения является способ получения полипептида данного изобретения путем культивирования описанной выше клетки, осуществления экспрессии полипептида в клетке и выделения полипептида из культуры.

Далее, отличительным признаком данного изобретения является способ определения содержания в животном образце (например, образец крови) раковых клеток. Данный способ включает получение образца от животного (например, такого грызуна, как мышь) и определение уровня экспрессии гена ARCAP в указанном образце. Если уровень экспрессии гена ARCAP в образце выше, чем в нормальном образце, это указывает на то, что животный образец содержит раковые клетки (например, клетки опухоли печени). Указанный способ можно использовать для диагностики рака или мониторинга лечения рака на животной модели.

Кроме того, в объем настоящего изобретения входит способ лечения рака (например, рака печени) у животного (например, такого грызуна, как мышь). Данный способ включает определение наличия у животного раковой клетки, экспрессирующей ген ARCAP, и лечение животного композицией, которая блокирует связывание ARCAP с рецептором андрогена или уменьшает способность рецептора андрогена трансактивировать андроген-чувствительный ген. Композиция может содержать антитело данного изобретения или антисмысловую нуклеиновую кислоту данного изобретения. Указанный способ можно использовать для скрининга лекарственных средств (включая использующиеся для генной терапии) и тестирования их эффективности на животной модели.

Термин "по существу чистый", использующийся в данном описании по отношению к определенному полипептиду, означает, что полипептид является по существу свободным от других биологических макромолекул. По существу чистый полипептид имеет, по меньшей мере, 75% (например, по меньшей мере, 80, 85, 95 или 99%) чистоты по сухому весу. Чистота может быть определена с помощью любого подходящего стандартного метода, например с помощью колоночной хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле или анализа с помощью ВЭЖХ.

"Консервативное аминокислотное замещение" представляет собой замещение, при котором аминокислотный остаток замещается другим остатком, имеющим химически подобную боковую цепь. В данной области техники определены семейства аминокислотных остатков, имеющих подобные боковые цепи. Данные семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

Гибридизация в "жестких условиях" означает гибридизацию при 65°С, 0,5 Х SSC, с последующей промывкой при 45°С, 0,1 Х SSC.

"Процент идентичности" двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеиновых кислот определяют с помощью алгоритма Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990), модифицированного в Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993). Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990). Нуклеотидные поиски BLAST осуществляют с помощью программы NBLAST, счет=100, длина слова=12. Белковые поиски BLAST осуществляют с помощью программы XBLAST, счет=50, длина слова=3. Если между двумя последовательностями находятся гэпы, используют Gapped BLAST, как описано в Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997). При использовании программ BLAST и Gapped BLAST применяют значения параметров по умолчанию от соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). См. www.ncbi.nlm.nih.gov.

"Изолированная нуклеиновая кислота" представляет собой нуклеиновую кислоту, структура которой не идентична структуре какой-либо встречающейся в природе нуклеиновой кислоты или структуре какого-либо фрагмента встречающейся в природе геномной нуклеиновой кислоты, объединяющей более трех отдельных генов. Следовательно, данный термин охватывает, например, (а) ДНК, которая имеет последовательность части встречающейся в природе молекулы геномной ДНК, но не соседствует с обеими кодирующими последовательностями, которые фланкируют данную часть молекулы в геноме организма, в котором она встречается в природе; (b) нуклеиновую кислоту, включенную в вектор или в геномную ДНК прокариота или эукариота таким образом, что полученная молекула не является идентичной каким-либо встречающимся в природе вектору или геномной ДНК; (с) отдельную молекулу, такую как кДНК, геномный фрагмент, фрагмент, полученный путем полимеразной цепной реакции (ПЦР), или рестриктационный фрагмент; и (d) рекомбинантную нуклеотидную последовательность, которая является частью гибридного гена, т.е. гена, кодирующего гибридный белок. В частности, из данного определения исключаются нуклеиновые кислоты, присутствующие в смесях различных (i) молекул ДНК, (ii) трансфицированных клеток или (iii) клеточных клонов, например, таких которые встречаются в библиотеке ДНК, такой как библиотека кДНК или библиотека геномной ДНК.

Другие особенности или преимущества настоящего изобретения станут ясны из нижеследующего подробного описания, а также из формулы изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Данное изобретение относится к трансгенным животным, отличным от человека, которые экспрессируют ген ARCAP, и к способам использования животных при разработке лекарственных средств для лечения или профилактики рака печени.

В данном описании "трансгенное животное, отличное от человека", включает родоначальных трансгенных животных, отличных от человека, и их потомство, а также клетки и ткани таких животных. Трансгенными животными, отличными от человека, могут быть сельскохозяйственные животные, такие как свиньи, козы, овцы, коровы, лошади и кролики, грызуны, такие как крысы, морские свинки и мыши, а также отличные от человека приматы, такие как бабуины, обезьяны и шимпанзе. Особенно используют трансгенных свиней и мышей.

Отличное от человека трансгенное животное данного изобретения содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ARCAP, интегрированную в геном животного. В данном описании термин "белок ARCAP" относится к белку ARCAP дикого типа или его функционально эквивалентному варианту, например к фрагменту полноразмерного белка.

Считается, что может быть полезным идентифицировать последовательности интронов, если таковые имеют место, в геноме и включить их в нуклеиновую кислоту, кодирующую белок ARCAP.

В трансгенных животных данного изобретения, отличных от человека, нуклеиновая кислота оперативно связана с регуляторным элементом, который может активизировать экспрессию гена ARCAP, например, в печени. В данном описании термин "оперативно связанный" относится к такому расположению регуляторного элемента и нуклеиновой кислоты, которое способствует транскрипции нуклеиновой кислоты. Регуляторный элемент может представлять собой специфичный для печени промотор, такой как РЕРСК и промотор альбумина.

Отличительной чертой данного изобретения являются также экспрессионные векторы, подходящие для получения трансгенных животных данного изобретения, отличных от человека. Экспрессионные векторы могут включать промотор, способный опосредовать экспрессию в печени, оперативно связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей белок ARCAP, как описано выше.

Для введения экспрессионных векторов в отличных от человека животных с получением линий - родоначальников трансгенных животных данного изобретения, отличных от человека, можно использовать различные методы, известные в данной области. Такие методы включают, не ограничиваясь ими, пронуклеарную микроинъекцию (патент США № 4873191), опосредованный ретровирусом перенос гена в зародышевые линии (Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6148, 1985), позиционирование гена в эмбриональных стволовых клетках (Thompson et al., Cell, 56:313, 1989), электропорацию эмбрионов (Lo, Mol. Cell. Biol., 3:1803, 1983) и трансформацию соматических клеток in vitro с последующей трансплантацией ядра (Wilmut et al., Nature, 385(6619):810-813, 1997; и Wakayama et al.. Nature, 394:369-374, 1998). В одном примере экспрессионный вектор вводят методом микроинъекции в яйцеклетку или эмбрион отличного от человека животного, или в эмбриональные стволовые клетки отличного от человека животного.

После получения трансгенных животных, отличных от человека (например, трансгенной мыши, полученной в соответствии с Current Protocol (Wiley, USA) и Manuplate the Mouse Embryo (Hogan Beddington and Costantini Lacy, CSHL Press), экспрессия гена ARCAP может быть оценена с помощью стандартных методов. Для того, чтобы определить, произошла ли интеграция трансгена, можно провести первичный скрининг с помощью методов Саузерн-блоттинга или ПЦР. Описание Саузерн-анализа можно посмотреть, например, в Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", second edition. Cold Spring Harbor Press, Plainview; NY, в разделах 9.37-9.52. Экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей белок ARCAP, в тканях трансгенных животных, отличных от человека, можно оценить с помощью методов, которые включают, не ограничиваясь ими, анализ образцов тканей, полученных от животного, методом Нозерн-блоттинга, анализ методом гибридизации in sutu и методом ПЦР с обратной транскриптазой (RT-ПЦР).

Трансгенных животных данного изобретения, отличных от человека, можно использовать в качестве моделей рака печени. В особенности, данных животных можно использовать для идентификации соединения или композиции, эффективных для лечения или профилактики рака печени. Соединения или композиции могут быть идентифицированы путем введения тестируемых соединения или композиции трансгенному животному данного изобретения, отличному от человека, или путем приведения тестируемых соединения или композиции в контакт с органом, тканью (например, печенью) или клетками (например, клетками печени), полученными от трансгенного животного, отличного от человека. Эффекты, оказываемые тестируемыми соединением или композицией на рак печени трансгенного животного, отличного от человека, органа, ткани или клеток, подвергаются оценке. Например, у трансгенных животных, отличных от человека, можно определить размер рака исходя из клинической патологической идентификации. Тестируемые соединения или композиции, которые уменьшают симптомы рака, могут быть эффективными для лечения или профилактики рака.

Фармацевтические композиции могут быть получены на основе тестируемых соединений путем смешивания данных соединений с фармацевтически приемлемыми нетоксичными эксципиентами или носителями, и они могут быть введены трансгенным животным данного изобретения, отличным от человека, любым способом. Например, можно использовать парентеральные способы, такие как подкожное, внутримышечное, внутрисосудистое, внутрикожное, интраназальное введение, введение путем ингаляции, интратекальное или интраперитонеальное введение, и энтеральные способы, такие как подъязычное, пероральное или ректальное введение

Считается, что специалист в данной области на основе приведенного здесь описания может использовать настоящее изобретение в полной степени без дополнительной разработки. Все цитирующиеся здесь публикации включены в данное описание в качестве ссылки во всей их полноте.

ДРУГИЕ ВОПЛОЩЕНИЯ

Все признаки, раскрытые в данном описании, могут быть объединены в любом сочетании. Каждый признак, раскрытый в данном описании, может быть заменен на альтернативный, который служит для такой же, эквивалентной или подобной цели. Таким образом, если не установлено иначе, каждый раскрытый признак является только примером общего ряда эквивалентных или подобных признаков.

Исходя из вышеприведенного описания специалист в данной области может легко установить существенные характеристики настоящего изобретения и, не отступая от его духа и объема, может осуществить различные изменения и модификации данного изобретения, приспосабливая его к различным применениям и условиям. Таким образом, другие воплощения также входят в объем нижеследующей формулы изобретения.

1. Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична SEQ ID NO:3, где полипептид связывается с рецептором андрогенов и увеличивает способность рецептора андрогенов трансактивировать андроген-чувствительный ген.

2. Полипептид по п.1, где аминокислотная последовательность, по меньшей мере, на 80% идентична SEQ ID NO:3.

3. Полипептид по п.2, где аминокислотная последовательность, по меньшей мере, на 90% идентична SEQ ID NO:3.

4. Полипептид по п.3, где аминокислотная последовательность, по меньшей мере, на 95% идентична SEQ ID NO:3.

5. Полипептид по п.4, где аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO:3.

6. Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, имеющую до 30 консервативных аминокислотных замен, где указанный полипептид связывается с рецептором андрогенов и увеличивает способность рецептора андрогенов трансактивировать андроген-чувствительный ген.

7. Полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой, которая гибридизуется в жестких условиях с зондом, имеющим последовательность SEQ ID NO:2, где полипептид связывается с рецептором андрогенов и увеличивает способность рецептора андрогенов трансактивировать андроген-чувствительный ген.

8. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по п.1.

9. Нуклеиновая кислота по п.8, где аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO:3.

10. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по п.6.

11. Выделенная нуклеиновая кислота, содержащая цепь, которая гибридизуется в жестких условиях с одноцепочечным зондом, имеющим последовательность SEQ ID NO:2, или последовательность, комплементарную SEQ ID NO:2.

12. Нуклеиновая кислота по п.11, где нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который связывается с рецептором андрогенов и увеличивает способность рецептора андрогенов трансактивировать андроген-чувствительный ген.

13. Нуклеиновая кислота по п.12, где аминокислотная последовательность полипептида включает SEQ ID NO:3.

14. Нуклеиновая кислота по п.11, где длина цепи составляет по меньшей мере 15 нуклеотидов.

15. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.8.

16. Вектор по п.15, где кодируемая аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO:3.

17. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.10.

18. Вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту по п.11.

19. Вектор по п.18, где указанная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который связывается с рецептором андрогенов и увеличивает способность рецептора андрогенов трансактивировать андроген-чувствительный ген.

20. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.8.

21. Клетка по п.20, где кодируемая аминокислотная последовательность представляет собой SEQ ID NO:3.

22. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.10.

23. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.11.

24. Клетка по п.23, где указанная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который связывается с рецептором андрогенов и увеличивает способность рецептора андрогенов трансактивировать андроген-чувствительный ген.