Способ определения локального уровня цитокинов у больных хроническими вирусными гепатитами

Изобретение относится к области медицины и касается способа определения локального уровня цитокинов у больных хроническими вирусными гепатитами (ХВГ). Способ заключается в использовании материала тонкоигольных (20-30G) аспирационных биопсий печени для определения локального уровня цитокинов. Значения иммунологических показателей, полученных с помощью реакции твердофазного иммуноферментного анализа, выражают в пересчете на 1 мг белка. Использование способа позволяет с достаточной точностью определять локальный уровень цитокинов у больных ХВГ при значительном снижении травматичности получения биологического материала. Способ может быть использован для скрининга локального уровня цитокинов в динамике. 2 табл.

 

Изобретение относится к медицине, разделу хирургия, хронические гепатиты.

В настоящее время признано, что иммунологические механизмы являются ведущими в формировании хронического вирусного гепатита (ХВГ). Механизмы хронизации вирусной инфекции и причины ее резистентности к терапии интерферонами, наблюдаемой у ряда больных, остаются во многом неопределенными. Противовирусный иммунитет в значительной степени определяется продукцией цитокинов [1, 14]. Цитокины - это класс растворимых полипептидных молекул, продуцируемых клетками организма, выполняющих сигнальную и регуляторную функцию в межклеточных коммуникациях, необходимых для функционирования иммунной системы, а также для взаимодействия ее с другими системами организма. Они вовлечены фактически в каждое звено иммунитета и воспаления, включая дифференцировку предшественников клеток иммунной системы, представление антигена, клеточную активацию и пролиферацию, экспрессию молекул адгезии и острофазового ответа. Эти биорегуляторные молекулы определяют тип и длительность иммунного ответа, контролируют все процессы, связанные с активной защитой организма от биологической агрессии [9, 10, 12]. Воспаление печени является результатом цитокинопосредуемой активации синусоидальных клеток, экспрессии ими адгезионных молекул, дальнейшего локального высвобождения провоспалительных цитокинов и мобилизации циркулирующих лейкоцитов. Купферовские клетки - основные продуценты цитокинов, играют ключевую роль в распространении паренхиматозного воспаления. Гепатоциты самостоятельно экспрессируют адгезионные молекулы и выделяют провоспалительные цитокины. Экзогенные лейкоциты, Т-лимфоциты и циркулирующие макрофаги могут проникать в паренхиматозное пространство, дополнительно высвобождая провоспалительные цитокины и обладающие повреждающим действием химические радикалы. Мишенью «цитокиновой атаки» служат преимущественно гепатоциты. В тяжелых случаях цитокины вызывают апоптоз гепатоцитов, они также обуславливают появление сладжа тромбоцитов в синусоидах и венулах, окклюзию микроваскулярного ложа с последующим ишемическим гепатоцеллюлярным некрозом [6]. Данные исследования продукции и биологических эффектов цитокинов важны для анализа закономерностей развития клинических, лабораторных и морфологических проявлений хронических вирусных гепатитов, оценки противовирусной терапии [8].

Наиболее распространеным способом оценки цитокинового статуса при хронических вирусных гепатитах является определение их концентрации в сыворотке крови с помощью иммунноферментных тест-систем [5, 8, 11]. Однако, поскольку цитокины являются локальными медиаторами, более целесообразно измерять их уровень в соответствующих тканях [4, 8]. Наиболее близким к заявляемому способу определения локального уровня цитокинов в ткани печени является способ определения их концентрации в супернатантах биоптатов печени, получаемых при тонкоигольной пункционной биопсии печени (ТПБ) [13]. Для этого необходимо проведение ТПБ иглой диаметром 14-17 G, с получением столбика биоптата длинной не менее 20 мм, сохраняющего гистологическую структуру органа [2]. Считаясь «золотым стандартом» в диагностике диффузных поражений печени, ТПБ печени является методикой, имеющей определенные противопоказания, такие как гемофилия, тромбоцитопения, гемангиома, психическая неустойчивость с фобиями и другие, а также определенный процент осложнений вплоть до летальных (по данным ряда исследований количество летальных случаев варьирует от 0 до 3,3 на 1000) [15]. Гистологическая оценка состояния печеночной паренхимы проводится до начала лечения и повторно в период от 6 месяцев до 1-6 лет после начала лечения [17, 18, 20]. Четких рекомендаций по периодичности проведения ТПБ печени нет [7]. Все вышеизложенное обосновывает необходимость разработки и внедрения менее травматичных методов оценки локального статуса цитокинов с целью их мониторинга и оценки противовирусной терапии у больных ХВГ.

При уменьшении диаметра иглы, используемой для биопсии печени, уменьшается количество наблюдаемых осложнений, но снижается возможность качественной оценки гистологической структуры органа. Тонкоигольная аспирационная пункционная (ТАБ) биопсия с использованием игл меньшего диаметра (от 20 до 23 G) является диагностической процедурой, при которой минимально травмируются ткани по ходу пункционного канала [2]. Она активно применяется для цитологической диагностики различных очаговых образований в печени [19]. С ее помощью можно получить клеточный материал, но нельзя оценить гистологическую структуру ткани. В практике обследования больных с хроническими вирусными гепатитами ТАБ печени не использовалась.

Задача изобретения - разработка способа определения уровня цитокинов в материале тонкоигольных аспирационных биопсий печени (ТАБ) у больных ХВГ.

Заявляемый способ определения уровня цитокинов в материале тонкоигольных аспирационных биопсий печени, получаемого при ТАБ, имеет следующие общие признаки с его аналогом (прототипом) определения уровня цитокинов в супернатантах биоптатов, получаемых при ТПБ биопсии:

1. Проведение биопсии печени.

2. Получаемый материал - элементы ткани печени.

3. Исследование локального уровня цитокинов в органе-мишене.

Отличительными от прототипа признаками заявляемого способа являются:

1. Использование для биопсии игл меньшего диаметра (20-23 G против 14-17 G), что снижает травматичность манипуляции.

2. Получаемый материал - аспират (взвесь клеток печени, не сохраняющая гистологическую структуру).

3. Определение уровня цитокинов в пересчете на 1 мг белка.

При проведении анализа имеющейся научной и патентной информации не обнаружено сведений, относящихся к использованию способа определения локального уровня цитокинов в материале тонкоигольных аспирационных биопсий печени (ТАБ).

Объектом исследования были 29 пациентов с ХВГ в стадии вирусной репликации (19 - с хроническим вирусным гепатитом С, 8 - с хроническим вирусным гепатитом В, 2 - с хроническим вирусным гепатитом В+С). Учитывая сложность и специфику забора материала, а также небольшие пределы разбросов показателей, контрольную группу составили 7 человек без маркеров вирусного или иного характера повреждения печени, оперированные в плановом порядке по поводу неосложненных форм желчно-каменной болезни (случайно выявленные при ультразвуковом исследовании органов брюшной полости, без приступов печеночной колики). Учитывая, что ФНО-α является одним из ключевых цитокинов с провоспалительной активностью, имеющим важное значение в механизмах тканевого повреждения и активации цитотоксических процессов в печени при ХВГ [3, 16], анализировали его содержание в супернатантах биоптатов печени, полученных при ТПБ и материале тонкоигольной аспирационной биопсии (ТАБ). Для этого черескожная пункционная биопсия печени (ТПБ) выполнялась иглой Менгини 16 G (диаметр 1,6 мм) с получением столбика биоптата не менее 20 мм, от которого 2-3 мм субстрата гомогенизировали, ресуспендировали с добавлением физиологического раствора (5 мл) и центрифугировали при 5000 об/мин при 4°С в течение 10 мин. Полученный супернатант распределяли по 0,5 мл в эпиндорфы, замораживали и хранили до использования при температуре - 76°С.

Для выполнения черескожной аспирационной биопсии печени (ТАБ) использовали иглы калибра 23 G (диаметр 0,6 мм). Полученную клеточную взвесь гомогенизировали, ресуспендировали с добавлением 5 мл физиологического раствора и центрифугировали при 4°С в течение 10 мин. Полученный супернатант распределяли по 0,5 мл в эпиндорфы, замораживали и хранили до использования при температуре - 76°С. Применяли метод твердофазного иммуноферментного анализа с использованием диагностических наборов (R&D Diagnostics Inc., USA) с чувствительностью 1 пг/мл. Расчеты количества цитокинов проводили путем построения калибровочной кривой с помощью компьютерной программы и выражали в пг/мл. Учитывая, что при выполнении тонкоигольной аспирационной биопсии печени (ТАБ) невозможно точно дозировать количество биопсийного материала, а также, что цитокины представляют собой молекулы пептидной природы, для стандартизации уровня показателей производили расчет содержания цитокина в исследуемом материале на 1 миллиграмм белка. Содержание белка в исследуемом материале определяли на автоматическом анализаторе «Cobas Mira Plus» фирмы «Hofftnan-La-Roche» (Швейцария). Для морфологического исследования биоптаты обрабатывали по общепринятой методике и заключали в парафин. В гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону, определяли активность некрозовоспалительных изменений на основе полуколичественной оценки по R.G.Knodell et al. (1981) в модификации В.В.Серова (1996) и индекс фиброза по V.J.Desmet et al. (1994) по алгоритму METAVIR. Для оценки информативности определения локального уровня ФНО-α в ткани печени, полученной при разных видах биопсий (ТПБ и ТАБ), провели корреляционный анализ взаимосвязей между показателями содержания изучаемого цитокина в супернатантах биоптатов печени, получаемых при ТПБ, материале тонкоигольных аспирационных биопсий печени (ТАБ) и морфологическими характеристиками ХВГ. Статистическая обработка полученных материалов произведена с применением прикладных статистических программ «BIOSTAT». Учитывая особенности формирования контрольной группы, оценку результатов проводили с использованием статистических приемов для малых выборок. С целью определения достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента для факторов, имеющих нормальное распределение.

При изучении взаимосвязи между локальным уровнем ФНО-α в материалах различных видов биопсий печени (ТПБ и ТАБ) выявлена прямая корреляционная связь (r=0,4, р<0,05).

При изучении содержания локального ФНО-α у больных ХВГ в материале ТПБ и материале ТАБ в обоих случаях отмечено достоверное увеличение его концентрации по сравнению с контрольной группой. Из таблицы 1 видно, что уровень ФНО-α в супернатантах биоптатов печени больных с ХВГ, полученных при ТПБ, более чем в 3 раза превышает его уровень у здоровых людей (0,077±0,013 пг/мг белка против 0,021±0,004 пг/мг белка). В материале тонкоигольных аспирационных биопсий (ТАБ) уровень ФНО-α у больных с ХВГ в 9 раз превышает его значение по сравнению с контрольной группой (45,492±7,144 пг/мг белка против 5,312±1,084 пг/мг белка).

Обнаружено повышение уровня содержания ФНО-α в материале ТПБ и ТАБ по мере увеличения индекса гистологической активности (А). При этом в группе с высокой гистологической активностью (А₃) уровень ФНО-α превосходил в 5 раз значения в контрольной группе (0,1014±0,0189 пг/мг белка против 0,0212±0,0043 пг/мг белка) по данным ТПБ и в 12 раз (63,91±15,29 пг/мг белка против 5,31±1,08 пг/мг белка) по данным ТАБ. Анализ содержания ФНО-α в группах с различной гистологической активностью по данным ТПБ показал неравномерную статистическую значимость различий. В то время как по результатам ТАБ четко определяется статистическая значимость различий в содержании исследуемого цитокина в группах с различной гистологической активностью (табл.1).

При изучении корреляционных взаимосвязей между уровнем ФНО-α в материале различных видов биопсий (ТПБ и ТАБ) и выраженностью степени гистологической активности в баллах выявлена высокая степень корреляции с показателями, полученными при ТАБ. Так коэффициент корреляции (R) при ТПБ отражает взаимосвязь слабой силы (от 0,24 до 0.31 при р<0,01), в то время как коэффициент корреляции (R) при ТАБ имеет сильно выраженную взаимосвязь (от 0,73 до 0,85 при р<0,01). Тем самым доказана возможность использования определения содержания ФНО-α в материале ТАБ для оценки степени гистологической активности (табл.2).

Таким образом, установленные связи между локальным уровнем ФНО-α, определенным в ткани печени, полученной при различных видах биопсии ТПБ и ТАБ), свидетельствуют о том, что способ определения концентрации цитокинов в материале тонкоигольных аспирационных биопсий печени (ТАБ) является альтернативным методу исследования содержания цитокинов в супернатантах биоптатов печени, полученных при ТПБ, и может применяться для скрининга локального уровня цитокинов в динамике при ХВГ.

Литература

1. Буеверов А.О. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 1998. - №5. - С.18-21.

2. Васильев А.Ю. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 1998. - №6. - С.23-26.

3. Гейвандова Н.И., Ягода А.В., Хубиев Ш.М. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2000. - №5. - С.26-29.

4. Демьянов А.В., Котов А.Ю., Симбирцев А.С.// Цитокины и воспаление. - 2003. - Т.2, №3. - С.20-35.

5. Ешану B.C., Широкова Е.Н., Маевская М.В. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2006. - №1. - С.35-41.

6. Ивашкин В.Т. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 1998. - №5. - С.13-17.

7. Ивашкин В.Т. // Клиническая микробиология, антимикробная химиотерапия. - 2006. - Т.8, №2, - С.102-129.

8. Ивашкин В.Т., Шульпекова Ю.О., Лукина Е.А. // Молекулярная медицина. - 2003. - №3. - С.34-43.

9. Каминский Ю.В., Скляр Л.Ф., Полушин О.Г. Клинико-морфологические и иммунологические аспекты парентеральных гепатитов. - Владивосток: Медицина ДВ, 2005. - 84 с.

10. Кетлинский С.А., Симбирцев С.С., Воробьев А.А. Эндогенные иммуномодуляторы для врача. - СПб.: Гиппократ, 1992. - 256 с.

11. Мамаев С.Н. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2001. - №1. - С.39-43.

12. Симбирцев А.С. // Цитокины и воспаление. - 2004. - Т.3, №2. - С.16-21.

13. Скляр Л.Ф. Система цитокинов и показатели оксидативного стресса при хроническом гепатите «С» с учетом иммунокорригирующей терапии: Автореф. дис... д-ра мед. наук. - Владивосток, 2006.

14. Ярилин А.А. // Иммунология. - 1997. - №5. - С.7-14.

15. Grant A., Neuberger J. Guidelines on the use liver biopsy in clinical practice // Gut. - 1999. - Vol.45 (4). - P.1-11.

16. Kishihara Y., Hayashi J., Yoshimida E. et al. IL-1 P and TNF-α produced by peripheral blood mononuclear cells betore and during interferon therapy in patients with chronic hepatitis С // Dig. Dis. Sci. - 1996. - Vol.41, №2. - P.315-321.

17. Manabe N., Chevallier M., Chossegros P., et al. Interferon (-2b) therapy reduses liver fibrosis in chronic non-A-non-B hepatitis: a quantitative histological evaluation // Hepatology. - 1993. - Vol.18. - P.1344-1349.

18. Marcellin P., Boyer N., Gervais A., et al. Long-term histologic improvement and loss of detectable intrahepatic HCV RNA in patients with chronic hepatitis С and sustained response to interferon-alpha therapy. // Ann. Intern. Med. - 1997. - Vol.127. - P.875-881.

19. Otto R.S., Wellaner J. Ultrasoud - quided biopsy and drainage. - В.: Springer-Verlag, 1986. - P.113-154.

20. Zio M., Nhieu J.T., Roudot-Thoraval F., et al. A histopathological study of the effects of 6-month versus 12-month interferon alpha-2b therapy in chronic hepatitis С. // J. Hepatol. - 1996. - Vol.25 - P.833-841.

Таблица 1
Содержание ФНО-α в супернатантах гепатобиоптатов и материале тонкоигольных аспирационных биопсий (пг/ мг белка) в зависимости от степени гистологической активности
Виды биопсий	Контрольная группа n=7	Больные ХВГ n=29	А1 n=11	А2 n=9	А3 n=9
ТПБ	0,021±0,004	0,077±0,013*	0,055±0,011* р2=0,474 p3 = 0,036	0,08110,035** р1=0,474 р3=0,606	0,101±0,019** p1=0,036 p2=0,606
ТАБ	5,312±1,084	45,492±7,144**	21,263±4,221** р2=0,025 p3=0,000	38,292±5,763*** p1=0,025 p3=0,013	63,913±15,291** p1=0,000 p2=0,013
Примечание. Достоверность различий по сравнению с соответствующими показателями: 1. В контрольной группе: * - р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001; 2. p1 - с группой A1 p2 - с группой А2 р3 - с группой A3

Таблица 2 Коэффициенты корреляции (R) и уровни их значимости (р) между степенью гистологической активности (А) и показателями содержания ФНО-α в материале ТПБ и ТАБ
Виды биопсий Степень гистологической активности	ТПБ	ТАБ
R	р	R	P
А1 (1-3) n=11	0,25	<0,001	0,83	<0,001
А2 (4-8) n=9	0,31	<0,01	0,73	<0,01
А3 (9-12) n=9	0,24	<0,001	0,85	<0,01
Выделенные цифры означают максимальную степень R между изучаемыми показателями

Способ определения локального уровня цитокинов у больных хроническими вирусными гепатитами, включающий проведение биопсии печени с последующим определением в полученных элементах печеночной ткани уровня цитокинов, отличающийся тем, что биопсия печени проводится иглой меньшего диаметра (20-23 G) с получением элементов печеночной ткани в виде аспирата, не сохраняющего гистологическую структуру ткани печени, в котором определяют уровень цитокинов с помощью реакции твердофазного иммуноферментного анализа в пересчете на 1 мг белка.