Способ селективного связывания субстрата с сорбентами посредством, по меньшей мере, двухвалентных связей

Изобретение относится к получению селективных сорбентов. Сорбент, имеющий, по меньшей мере, две различные группы, которые способны к селективному связыванию с субстратом, включает стадии (i)-(ii): (i) определения, по меньшей мере, двух групп, способных к связыванию сорбента, из синтетического или природного первого субстрата, (ii) соответственно, нанесения, по меньшей мере, двух различных групп, способных к связыванию второго синтетического или природного субстрата, на один соответствующий носитель, тем самым формируя, по меньшей мере, один сорбент, при этом группы представляют собой такие же группы, как и на стадии (i), или представляют собой группы, которые являются комплементарными к ним, и второй субстрат на стадии (ii) является таким же, как первый субстрат в соответствии со стадией (i), или отличным от него, и при этом группы определяют так, что вклады энергий Гиббса индивидуальных групп в нековалентную связь со вторым субстратом дают отрицательное значение энергии Гиббса ΔG, так что происходит упрочнение связывания, которое приводит к улучшению селективности разделения по отношению, по меньшей мере, к одному веществу, которое должно отделяться. Способ обеспечивает получение сорбента, способного целенаправленно выделить субстрат. 11 н. и 13 з.п. ф-лы, 2 ил., 13 табл.

 

Настоящее изобретение относится к способу получения, по меньшей мере, одного сорбента для селективного связывания субстрата, по меньшей мере, с двумя различными группами, способными к связыванию, а также к способу селективного связывания указанного субстрата посредством указанных сорбентов. Указанный сорбент определяют из коллекции сорбентов, на поверхности каждого из которых, имеется, по меньшей мере, две различных группы, способных к связыванию, которые получают посредством расщепления синтетических или природных субстратов на компоненты, содержащие указанные группы. В частности, способ селективного связывания является пригодным для выделения синтетических или природных агентов, а также для характеризации и идентификации функции и свойств указанных агентов. Другой объект настоящего изобретения представляет собой также комплекс сорбент/субстрат, который получают при селективном связывании указанного субстрата. Кроме того, настоящее изобретение также относится к комбинаторной библиотеке, содержащей сорбенты и субстраты, каждый из которых предпочтительно имеет, по меньшей мере, два различных аминокислотных остатка, остатка сахара, нуклеотидного остатка, нуклеозидных остатков, пиримидиновых остатков и/или остатков пуриновых оснований, в качестве групп, способных к связыванию. Способ селективного связывания, а также комбинаторная библиотека могут использоваться для детектирования взаимодействий субстрат/рецептор, для скрининга агентов, для селективного разделения изомерных соединений, для селективного разделения, а также для очистки субстратов.

В настоящее время из области биоафинной хроматографии известна химическая иммобилизация веществ, которые имеют особенно высокое сродство к конкретным биологическим молекулам, на поверхности нерастворимого носителя с высокой молекулярной массой. Тогда они способны связывать указанные биологические молекулы.

По большей части, вещества, которые должны иммобилизоваться на носителе, представляют собой биологические полимеры. С другой стороны, возможно также присоединение к поверхности веществ с низкой молекулярной массой, с помощью которых является возможным связывание или удерживание биологических полимеров.

Таким образом, как правило, только достаточно высокое сродство существует только тогда, когда сорбент и субстрат имеют группы, являющиеся комплементарными друг другу и являющиеся способными к формированию связи. Например, комплементарные группы представляют собой гидрофильные группы, которые могут взаимодействовать друг с другом посредством водородных связей, или диполей, или полиполей, при этом имеет место связывание.

В настоящее время известно, что биологические системы могут одновременно взаимодействовать друг с другом посредством нескольких молекулярных контактных сайтов (M. Withesides et al., Angew. Chem. 1998, 110, 2908-2953).

Кроме того, из заявки на Международный патент WO 00/32649 известны полимеры как сорбенты для разделения субстратов, также как и способы для разделения субстратов посредством указанных сорбентов. Здесь разделение становится возможным посредством, по меньшей мере, двух различных типов взаимодействий. Группа сорбентов, способная к связыванию, которая действует как рецептор, может представлять собой один тип групп, однако также могут присутствовать два или более различных типов групп.

Кроме того, Международные заявки WO 00/32648, WO 01/38009, а также Международная заявка WO 00/78825 описывают взаимодействие сорбент/субстрат, обеспечивающее хорошие условия, по меньшей мере, для двухвалентного связывания.

При этих способах для целенаправленного связывания субстрата пригодный для использования биологический полимер также должен быть известен и должен быть технологичным, если он должен использоваться в качестве части сорбента. Если, наоборот, биологические полимеры связываются на сорбенте посредством низкомолекулярных веществ, последние должны также быть известны и должна существовать возможность их иммобилизации на носителе без изменения свойств связывания.

Способ создания синтетических групп на полимерном соединении для связывания биологически или фармакологически активных веществ также является известным. Для этого молекулы шаблонов, являющиеся биологически или фармакологически активными веществами, фиксируются на полимерном соединении. После присоединения реакционно-способных функциональных групп к полимерному соединению для связывания субстратов шаблонные молекулы отщепляются (Международная заявка WO 00/13016).

Кроме того, способ селективного отделения выбранного органического соединения также является известным. Для этого на поверхность носителя наносят группы, которые являются комплементарными к группам соединения, которое должно отделяться. Предпочтительно соединения, которые должны отделяться, представляют собой макромолекулы, имеющие ионизируемые группы. Связывающиеся группы на поверхности носителя являются заряженными противоположно группам макромолекул. Однако имеется только один тип групп на сорбенте, посредством которых имеет место связывание (Международная заявка WO 93/19844).

Кроме того, US 2002/0155509 A1 также описывает способ, который, в конечном счете, может использоваться для селективного отделения субстрата от смеси субстратов. Для этого смесь субстратов приводят в контакт с различными сорбентами и элюентами. Посредством десорбционной спектрометрии можно определить, связываются ли субстраты с сорбентами при выбранных сочетаниях сорбент/элюент и насколько прочно. Сорбент и элюент могут варьироваться до тех пор, пока не будет обнаружено пригодное для использования сочетание сорбент/элюент, которое делает возможным селективное отделение субстрата (при этом термины "сорбент" и "субстрат" используются способом, который отличается от определения, используемого в US 2002/0155509 A1, в определении, на котором основывается настоящая заявка на патент и которое приводится ниже).

В настоящее время также известна иммобилизация полярных групп вместе с алкильными радикалами с длинной цепью на поверхности носителя, при этом производят сорбенты, по меньшей мере, с двумя различными группами, способными к связыванию. Здесь на первой стадии реакции, хлорсиланы, которые предпочтительно являются замещенными алкильными радикалами со средней цепью или длинной цепью, такими как C₈- или C₁₈-радикалы, взаимодействуют с группами OH на поверхности носителя, например гидроксильными группами силикагеля, при этом указанные алкильные радикалы иммобилизуются на поверхности носителя. Затем на второй стадии поверхность носителя взаимодействует с триметоксисиланами или триэтоксисиланами, после чего следует стадия гидролиза при отделении спирта и формирования силановой группы. Кроме того, также является возможным взаимодействие соединений кремния, таких как алкилтриалкоксисиланы, такие как октадецилтриметоксисилан, с группами OH на поверхности носителя, при этом сначала иммобилизуется алкильный радикал, затем непрореагировавшие алкокси остатки могут гидролизоваться при образовании силановых групп, при этом генерируется вторая группа, способная к связыванию. В частности, предполагается, что указанные сорбенты являются пригодными для использования при связывании субстратов из водных растворов (Column Watch, LC*GC Europe, December 2002, page 780-786).

Если субстраты с еще неизвестной структурой и/или свойствами связывания должны выделяться посредством сорбентов, способы, которые описываются в литературе, как правило, не позволяют целенаправленно предсказать, является ли определенный сорбент способным к селективному связыванию субстрата или нет и насколько хорошо. При этом по большей части в сложных экспериментах нужно определить, являются ли известные сорбенты пригодными или непригодными для селективного связывания указанного субстрата. По этой причине обнаружение пригодного для использования субстрата является скорее случайным.

Как следствие, целью настоящего изобретения является создание способа получения сорбента, с помощью которого является возможным целенаправленное выделение субстрата, предпочтительно субстрата с физиологической активностью, из смеси субстратов. Кроме того, целью настоящего изобретения является создание способа, который делает возможным целенаправленное выделение указанного субстрата из смеси субстратов посредством указанного сорбента.

Эти цели могут быть достигнуты посредством, по меньшей мере, одного сорбента, который содержит, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию, которые могут комплементарно двухвалентно взаимодействовать, по меньшей мере, с двумя группами на субстрате. Посредством этого по сравнению с одновалентным взаимодействием, которое находится в диапазоне от слабо селективного до неселективного, имеет место упрочнение связи. Вследствие этого целевое соединение сильнее удерживается благодаря множеству связей с сорбентом, чем его конкуренты с одновалентным связыванием, при этом по сравнению с указанными конкурентами достигается селективное связывание. По сравнению с другими многовалентными конкурирующими субстратами селективное связывание может достигаться посредством оптимизированного сорбента, необходимые свойства которого могут определяться с помощью коллекции сорбентов.

Таким образом, объект настоящего изобретения представляет собой способ получения, по меньшей мере, одного сорбента, имеющего, по меньшей мере, две различные группы, которые способны к связыванию, для селективного связывания субстрата, отличающийся тем, что он включает стадии (i)-(ii):

(i) определения, по меньшей мере, двух групп, способных к связыванию сорбента из синтетического или природного первого субстрата,

(ii) соответственно, нанесения, по меньшей мере, двух различных групп, способных к связыванию второго синтетического или природного субстрата, на один соответствующий носитель, тем самым формируя, по меньшей мере, один сорбент, при этом группы являются такими же, как группы со стадии (i), или представляют собой группы, которые являются комплементарными к ним, и второй субстрат на стадии (ii) является таким же, как первый субстрат в соответствии со стадией (i), или отличным от него.

Другая цель настоящего изобретения также представляет собой способ селективного связывания субстрата, имеющего, по меньшей мере, две различные группы, которые способны к связыванию, по меньшей мере, с одним сорбентом, отличающийся тем, что он включает стадии (i)-(iv):

(i) определения, по меньшей мере, двух групп, способных к связыванию сорбента из синтетического или природного первого субстрата,

(ii) соответственно, нанесения, по меньшей мере, двух различных групп, способных к связыванию второго синтетического или природного субстрата, на соответствующий носитель, тем самым формирования, по меньшей мере, одного сорбента, при этом группы являются такими же, как группы со стадии (i), или представляют собой группы, которые являются комплементарными к ним, и второй субстрат на стадии (ii) является таким же, как первый субстрат со стадии (i), или отличным от него,

(iii) приведения в контакт, по меньшей мере, одного второго субстрата, который является таким же, как первый субстрат в соответствии с (i), или отличным от него, по меньшей мере, с одним сорбентом со стадии (ii),

(iv) исследования прочности связывания, по меньшей мере, одного второго субстрата, по меньшей мере, с одним сорбентом со стадии (iii).

Таким образом, настоящее изобретение дает возможность для целенаправленного упрочнения или также для целенаправленного ослабления связи между сорбентами и субстратами, при этом селективность связывания сорбента с субстратом, который должен выделяться из смеси субстратов, также может целенаправленно улучшаться.

Как следствие, настоящее изобретение основывается на новом принципе выделения субстрата из смеси субстратов, который фундаментально отличается от принципов выделения способами, известными из литературы, поскольку он создает и реализует улучшенную селективность разделения для любой пары субстратов, которая должна разделяться.

Принцип разделения по настоящему изобретению основывается на предсказании, на количественной оценке или на измерении интенсивности нековалентной связи, которая формируется посредством взаимодействия между, по меньшей мере, двумя различными группами, способными к связыванию сорбента и субстрата соответственно. Принципы разделения в способах, известных из литературы, основываются на том факте, что разделение осуществляется посредством эмпирических способов, которые грубо классифицируются на категории полярных/неполярных, соответственно, гидрофильных/гидрофобных и, следовательно, представляют собой случайные способы. Это также подтверждается успехом разделения, который в настоящее время часто является недостаточным.

Предпочтительно группы на стадии (ii) являются такими же группами, как группы со стадии (i), или являются комплементарными к указанным группам.

В терминах настоящего изобретения термин субстрат охватывает все вещества природного или синтетического происхождения, которые могут селективно связываться. Предпочтительно эти вещества представляют собой агенты, а также соединения с физиологической и/или биологической активностью в живых растениях или организмах животных. В принципе, эти вещества представляют собой все природные и синтетические химические и/или биологические соединения, имеющие две или более группы, способные к связыванию. Предпочтительно они представляют собой аминокислоты, олигопептиды, нуклеотиды, нуклеозиды, белки, гликопротеины, антигены, детерминанты антигенов, антитела, углеводы, ферменты, коферменты, биокатализаторы, гормоны, алкалоиды, гликозиды, стероиды, витамины, метаболиты, вирусы, микроорганизмы, вещества, содержащиеся в растительных и животных тканях, клетки, фрагменты клеток, отделения клеток, остатки клеток, лектины, флавилиевые (2-фенилбензопирилиевые) соединения, флавоны и изофлавоны, а также синтетические агенты, подобные фармацевтическим препаратам и агентам для защиты растений.

В случае, когда должны связываться низкомолекулярные агенты, в литературе указанные агенты часто определяют как лиганды. Связывающиеся вещества, подобные белкам, имеющие высокую молекулярную массу, часто определяют как рецепторы.

Термин субстрат охватывает также предшественники, которые в некоторых случаях могут быть пригодными в качестве агента после дополнительной модификации. Такие потенциальные агенты часто определяются как хитыили лидеры, если при их определении их получают с помощью способов скрининга, или они определяются как каркасы, иглы или фармакофоры, если их получают по структурным особенностям.

Кроме того, указанный термин субстрат также охватывает источники, выделение, удаление или извлечение которых из смесей может быть экономически выгодным. Среди указанных источников находятся также с низкой концентрацией и побочные продукты, например, из технологических потоков или уходящих потоков. Такие источники могут быть органическими, такими как пептиды или метаболиты из телесных жидкостей, или неорганическими, такими как ионы радиоактивных металлов или металлические ионы благородных металлов.

Термин носитель охватывает материалы, которые служат в качестве носителя или каркаса для групп, которые должны связываться. При нанесении указанных групп на носитель формируется сорбент. Для хроматографических применений сорбент также определяется как неподвижная фаза.

Термин сорбент охватывает любое сочетание носителя и, по меньшей мере, двух различных групп, способных к связыванию субстрата.

Термин компонент обозначает части или фрагменты субстратов, предпочтительно агентов, каждый из которых имеет, по меньшей мере, одну группу, способную к связыванию. Примеры таких компонентов представляют собой эпитопы. Термин компонент может также быть идентичным термину группа, способная к связыванию. В дальнейшем пространственное расположение компонентов в субстрате часто обозначается как сайт связывания. Например, гистидин представляет собой компонент, несущий в качестве группы, способной к связыванию, имидазольный остаток, который, в свою очередь, содержит амидиновую или иминовую группы в качестве группы, способной к связыванию.

Термин эпитоп обозначает молекулярные области субстратов. Например, термин эпитоп обозначает молекулярную область антигена, которая способна связывать антитело. Такие сайты связывания антитела на антигене также обозначаются как антигенная детерминанта.

Термин (различная) группа, способная к связыванию, охватывает все группы, способные к связыванию сорбента и/или субстрата посредством ковалентных или нековалентных взаимодействий. В литературе на английском языке указанный термин обозначается также остаток сайта связывания. Кстати, все эти группы представляют собой соединения или остатки соединений, которые описываются в литературе как способные к формированию нековалентных связей. Термин нековалентная связь объясняется ниже.

Предпочтительно группы, способные к связыванию, представляют собой гидроксильный, карбоксильный, амидный, амино, изо-бутильный, фенильный, нитрофенильный, нафтильный остаток, однако также и диольный, гидроксифенильный, карбонильный, иминовый, алкиленовый, алкинильный, индолильный и имидазолильный остатки. Таким образом, группа, способная к связыванию, может содержать, по меньшей мере, одну функциональную группу. Однако группы, способные к связыванию, не ограничиваются функциональными группами.

Группа, способная к связыванию, может также осуществлять более одной формы энергетического взаимодействия, то есть на нее может воздействовать более одного типа нековалентной связи. Например, в основном, индольный остаток способен одновременно осуществлять с соответствующими веществами, которые должны связываться, ионные, Ван-дер-ваальсовы, π-π и дисперсионные взаимодействия. Однако инденовый остаток не имеет способности к ионному взаимодействию, и дисперсионное взаимодействие развито слабее.

При этом индивидуальные вклады в связь также зависят от растворителя. Они могут подвергаться целенаправленному воздействию посредством выбора композиции растворителя, pH и температуры. Как правило, Ван-дер-ваальсовы взаимодействия являются менее развитыми в органических растворителях, чем в водных смесях растворителей. По сравнению с этим, как правило, прочность водородной связи в апротонных растворителях сильно понижается при увеличении содержания воды.

Термин различные означает, что группы имеют либо различный элементный состав, либо что для того же элементного состава группы соединены иным образом, либо химические связи с группами являются различными. Различия, относящиеся, по меньшей мере, к двум группам, способным к связыванию, также включают в себя стерическое расположение по сравнению с веществом, которое должно связываться. В этом отношении, например, расположение относится к дифференциации стереоизомеров, в частности диастереомеров и энантиомеров. Например, гидроксильные группы в цис расположении являются отличными от гидроксильных групп в транс расположении, или гидроксильные группы R формы являются отличными от групп S формы. Такие различия могут детектироваться с помощью физических методов, например с помощью спектроскопии ЯМР, поскольку такие группы являются магнитно-неэквивалентными и дают различные резонансные сигналы в спектре ЯМР. Детектирование также может осуществляться посредством рентгеноструктурного анализа. Также такие группы отличаются тем, что они могут иметь различную реакционную способность по отношению к воздействующим на них реагентам.

Таким образом, в частности, различные группы, способные к связыванию, представляют собой такие группы, которые, каждая, вносят различные вклады в энергию взаимодействия с веществом, которое должно связываться (второй субстрат). Указанная энергия взаимодействия также обозначается как энергия Гиббса ΔG взаимодействия. Во всех смыслах такие группы могут быть одинаковыми по отношению к их составу, конфигурации и конформации, однако могут различаться по их вкладу во взаимодействия. Например, в производных глутаминовой кислоты карбоксильные группы могут иметь различные вклады во взаимодействия. Также рамнозные остатки, которые связаны различным образом, могут иметь различные вклады во взаимодействия, что, например, может быть использовано для разделения нарингина и рутина.

В свою очередь, различные вклады в энергию Гиббса ΔG взаимодействия могут иметь различные по величине компоненты энтальпии и энтропии соответственно. Так, считается, что два ионных взаимодействия карбоксильных групп, которые содержатся в веществе, которое должно связываться, на самом деле дают примерно одинаковые вклады по отношению к энтальпии ΔH взаимодействия, однако второй сайт связывания имеет относительно более высокий отрицательный вклад в энтропию ΔS.

Наоборот, случается также, что в первом и/или втором субстрате, по меньшей мере, две группы, способные к связыванию, непосредственно соседствуют, будучи химически одинаковыми или эквивалентными. Их вклады во взаимодействие в каких-то случаях могут только чуть-чуть отличаться друг от друга и не являются больше различимыми в пределах точности измерений. Стехиометрическое отношение таких групп друг к другу или по отношению к дополнительным группам, способным к связыванию, учитывается при получении сорбента посредством степени дериватизации. Для растворов или суспензий сорбента указанная степень дериватизации является также мерой для описанияконцентрации.

Пример аккумуляции одинаковых или приблизительно эквивалентных энергетически групп, способных к связыванию, представляют собой стероидные рецепторы. Для контакта связывания эстрадиола или прогестерона стероидные рецепторы содержат до семи остатков лейцина, которые неполярно связывают лиганд посредством их алкильных групп. В дополнение к этому существует до трех сайтов полярного связывания, состоящих из аргинина, глутамина (глутаминовой кислоты) и гистидина. В соответствии с настоящим изобретением указанные природные рецепторы могут просто моделироваться посредством вставки изо-пентильных радикалов из метилвалериновойкислоты и полярных групп, таких как амид янтарной кислоты, а также основных групп, таких как амин или имидазол, при соответствующем отношении концентраций.

Такие сорбенты способны прочно связывать соответствующим образом не только целевую молекулу эстрадиола, но также и ряд синтетических и природных веществ, которые демонстрируют при физиологических исследованиях и in vivoактивность, сходную с эстрадиолом. Среди таких веществ находятся, например, диэтилстильбэстрол и генистеин.

При этом предпочтительно, сорбент как синтетический полимерный рецептор калибруется такими агентами, но также и агентами, которые являются структурно родственными им, которые, однако, являются неактивными, такие как тамоксифен, тестостерон или катехин. Практическая выгода получается, если вещества, которые хорошо связываются с природным рецептором, также демонстрируют прочное связывание с сорбентом, в противоположность веществам, уже связывающимся до этого с моделью слабо или неспецифично. При оптимизации структуры, наряду с отношением групп, способных к связыванию, устанавливается также степень поперечной сшивки, которая регулирует протяженность и пространственные условия сайтов связывания.

Такие сорбенты связывают из смеси растворенных веществ, преимущественно такие вещества или даже исключительно такие вещества, которые также прочно связываются с биологическим модельным белком. Таким образом, из смеси веществ природного или синтетического происхождения потенциальные агенты могут выделяться в чистой форме быстрым и простым способом.

Важный аспект настоящего изобретения представляет собой по большей части свободный выбор растворителя при соответствующем применении способа в соответствии с настоящим изобретением. Порядок изменения и величина различий энергии связи между прочно и слабо связывающими веществами неожиданно остаются по большей части неизменными, если к водному элюенту добавляют большие количества спирта и дополнительные кислоты или буфер. Предпочтительно добавление метанола значительно ослабляет связывание всех веществ, используемых при калибровке, не оказывая воздействия на распределение в группах прочно и слабо связывающих веществ. Следствием этого является значительно более раннее элюирование при хроматографических условиях. Таким образом, вещества, представляющие интерес, могут исследоваться или выделяться через разумное время, поскольку посредством добавления органических растворителей константы связывания уменьшаются на порядки по сравнению с чистой водой или физиологическим буфером.

Термин нековалентная связь означает, что группы, способные к связыванию, могут связываться друг с другом посредством ионных пар, водородных связей, диполь-дипольных взаимодействий, взаимодействий с переносом заряда, π-πвзаимодействий, катион-π-электронных взаимодействий, Ван-дер-ваальсовых взаимодействий и дисперсионных взаимодействий, гидрофобных (липофильных) взаимодействий, образования комплексов, предпочтительно формирования комплексов катионов переходных металлов, а также посредством сочетаний указанных взаимодействий.

Термин комплементарный означает, что только такие группы, которые являются соответствующими друг другу, способны к формированию связей. При этом взаимодействие, которое вызывает связывание, должно быть энергетически благоприятным. Чем более развитой является нековалентная связь указанных групп друг с другом, тем прочнее субстрат связан, по меньшей мере, с одним сорбентом. При этом является также возможным, что несколько групп могут быть комплементарными к одной группе. Например, карбоксильная группа, амино группа и амидная группа могут быть комплементарными к гидроксильной группе.

Термин комплементарные группы также означает, что такие группы могут заменяться группами, являющимися структурно сходными с комплементарными группами или являющимися структурно родственными указанным группам. Например, возможна замена в нековалентной связи нафтильного остатка, которая основывается на π-πвзаимодействии, антраценовым остатком, при этом вклад ароматического углеводорода в прочность связывания нековалентной связи дополнительно модифицируется, соответственно, увеличивается. Аналогичным способом возможно увеличение вклада индольного остатка в дисперсионную нековалентную связь посредством замены акридиновым остатком.

Прочность взаимодействия между комплементарными группами, которая, например, может измеряться и выражаться как константа связывания, возникает в результате вкладов индивидуальных групп, способных к связыванию. Эти индивидуальные вклады в константу связывания зависят не только от типа нековалентного взаимодействия, но также от расстояний и ориентаций (угла между ними) групп, взаимодействующих друг с другом, а также от композиции растворителя. Индивидуальные типы взаимодействия значительно отличаются друг от друга по энергии, при этом связь, а вместе с ней и энергия Гиббса, по-разному уменьшается с расстоянием между указанными группами.

Группы, являющиеся комплементарными по отношению друг к другу, отличаются также тем, что вклады энергий Гиббса от индивидуальных групп в нековалентную связь приводят к изменению энергии Гиббса ΔG, которая принимает (соответственно, высокое) отрицательное значение. При этом в соответствии с настоящим изобретением группы выбираются таким образом, что изменение энергии Гиббса ΔG приводит к усилению связывания, так что происходит улучшение селективности разделения по отношению к веществам, которые должны выделяться.

Как правило, улучшение селективности разделения происходит, если значение ΔG для связи между выбранными комплементарными группами полученного сорбента и вторым субстратом (целевым веществом) является существенным образом более отрицательным (или становится более отрицательным), чем значение ΔG для связи между указанным сорбентом и веществом, которое должно отделяться. При хроматографии для этого типа вещество, которое должно отделяться, элюируется тем быстрее, чем слабее оно связано. Однако улучшение селективности разделения происходит, если вещество, которое должно отделяться, связывается прочнее, чем второй субстрат (целевое вещество) из-за вставки других комплементарных групп и, таким образом, из-за изменения значения ΔG, связанного с ними.

В соответствии с настоящим изобретением цель разделения, благодаря достаточной селективности разделения, всегда достигается, если комплекс сорбент/субстрат, по меньшей мере, одной комплементарной группы в большей степени или сильнее (например, у стереоизомеров) участвует в связи со вторыми субстратами, чем комплекс между сорбентом и, по меньшей мере, одним веществом, которое должно выделяться.

Примеры типичных значений указанной энергии Гиббса ΔG взаимодействия (кДж/моль), являющиеся зависимыми от растворителя, представляют собой

от -4 до -6 для ионного взаимодействия, при этом сила, соответственно, пределы изменения указанного взаимодействия уменьшаются обратно пропорционально расстоянию. Пример такого взаимодействия представляет собой взаимодействие между карбоновой кислотой и водородом четвертичного амина в воде;

-1 для ион/квадрупольного взаимодействия, при этом сила, соответственно пределы изменения, уменьшаются обратно пропорционально расстоянию в третьей степени. Пример представляет собой взаимодействие между четвертичным азотом в соединениях аммония и ареновой группой в воде;

-1,75 для дисперсионного взаимодействия (индуцированные диполи), при этом пределы изменения, соответственно сила, уменьшается обратно пропорционально шестой степени расстояния. Пример представляет собой взаимодействие между двумя ареновыми группами в хлороформе;

от -4 до -6 для водородных связей. Пример представляет собой взаимодействие между двумя амидными группами в хлороформе. В четыреххлористом углероде энергия взаимодействия между такими группами равна приблизительно -10;

-2,3 для гидрофобного эффекта, в результате взаимодействия между алканом и метиленовым радикалом в воде.

Если в соответствии с настоящим изобретением в хлороформе гидантоины являются двухвалентно связанными с группами аммония, измеряют значения ΔG до -22 кДж/моль. В случае одновалентного связывания сукцинимидного производного, однако, значения ΔG в среднем составляют только -9 кДж/моль. Таким образом, различие для обоих значений ΔG составляет приблизительно 13 кДж/моль, соответствующее значение селективности разделения равно приблизительно 200. Указанные данные говорят о водородных связях и преимущественно энтропийном усилении двухвалентного взаимодействия.

В данной системе растворителей для каждого типа нековалентного взаимодействия и для каждой пары первого и второго субстрата (рецептор/лиганд) зависимость энергий Гиббса от расстояния может по-разному складываться из вкладов энтальпии и энтропии.

В соответствии с настоящим изобретением указанные индивидуальные вклады определяются посредством анализа прочности связывания первого субстрата, содержащего одну, две, три, ... n групп, способных к связыванию, например, с набором вторых субстратов, у которых группы, способные к связыванию, выбираются таким образом, что можно сделать выводы относительно определенного типа взаимодействия. Таким образом, могут использоваться первые субстраты, которые предпочтительно содержат амино, ацетильный, бензильный, нитрофенильный и изопентильный остатки, а также сочетания двух и трех из этих остатков. Затем второй субстрат состоит из производных, предпочтительно, аланиновой, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты. Предпочтительно N-концевые защитные группы указанных производных являются либо алифатическими, либо ароматическими.

Предпочтительно энергии связи могут определяться как значения k' по изократическим экспериментам с ВЭЖХ. Если на первом субстрате концентрация групп, способных к связыванию, и отношение фаза/объем между иммобилизованной (неподвижной) фазой и подвижной фазой являются известными, константа связывания K_A может определяться по значению k', а, в свою очередь, по указанному значению и изменение энергии Гиббса ΔG. Например, изменение энтальпии ΔH и изменение энтропии ΔS могут определяться микрокалориметрически или посредством измерения температурной зависимости константы равновесия, которую также называют графиком Вант-Гоффа. Впоследствии посредством сравнения соответствующих энергий взаимодействий между выбранными вариантами рецептора и лигандами проверяется, до какой степени вклады взаимодействий складываются, усиливают или ослабляют друг друга. Является самоочевидным, что способы определения связывания не ограничиваются способами, рассмотренными выше. Кроме этого, могут использоваться все распространенные способы определения, такие как анализы конкурентного связывания, поверхностный плазмонный резонанс или ЯМР-титрование. Определение энергии взаимодействия может осуществляться в форме миниатюризированных анализов и параллельно.

При стерически благоприятных условиях для групп, способных к связыванию, части энергии Гиббса складываются друг с другом. Как следствие, вклады в константы связывания умножаются друг на друга. Кроме того, возможны кооперативные эффекты, вносящие вклад в дополнительное усиление связывания. Также при условиях, стерически менее благоприятных, по большей части может быть достигнуто, по меньшей мере, усиление двухвалентного связывания. Это очень выгодно для практического применения, поскольку усиление связывания при соответствующем выборе остатков, способных к связыванию, почти всегда приводит к улучшению селективности разделения по отношению к веществам, которые должны выделяться (сопутствующие вещества/побочные продукты).

Термин некомплементарный означает, что группы на самом деле могут взаимодействовать друг с другом, однако указанные группы вносят более слабый вклад в нековалентную связь, чем комплементарные группы. Как следствие, прочность связывания между некомплементарными группами развивается слабее, чем у связи между комплементарными группами. В соответствии с настоящим изобретением группы, не являющиеся комплементарными по отношению друг к другу, ослабляют нековалентную связь, которая формируется между указанными группами, или ослабляет соответствующий сайт связывания в целом, или они являются несвязывающимися. Они предпочтительно отличаются тем, что вклады энергии Гиббса индивидуальных групп для нековалентной связи приводит к такому изменению энергии Гиббса ΔG, что она становится нулевой или принимает положительное значение.

Термин определение означает целенаправленный отбор, например целенаправленный отбор групп, способных к связыванию.

По меньшей мере, один сорбент, который получают в соответствии с новым способом, может использоваться для распознавания взаимодействий сорбент/субстрат. В частности, как способ распознавания новый способ является пригодным для селективного связывания указанного субстрата, по меньшей мере, с одним указанным сорбентом. В качестве меры распознавания может использоваться прочность связывания. В случае достаточно сильной связи между сорбентом и субстратом получают информацию о том, какие группы субстрата и какие группы сорбента могут связываться друг с другом.

Если группы субстрата являются неизвестными, в случае связывания, можно сделать вывод о том, какие группы, способные к связыванию, могут существовать в субстрате на сайте связывания.

Однако возможно также разделение молекулярных областей первого субстрата с неизвестной структурой на соответствующие компоненты, например на эпитопы, и установление указанной структуры или структуры, являющейся комплементарной к ней, посредством соответствующего размещения компонентов на сорбенте.

При этом разделение может осуществляться как в соответствии с химическими, физическими методами, так и с методами химической физики, например, посредством реакций химического расщепления или посредством ультразвука, однако также посредством виртуальных экспериментов. Для указанных виртуальных экспериментов могут использоваться также компьютерные методы, посредством которых может получаться информация о возможностях связывания, которые существуют для компонентов субстратов.

Исходная точка для разделения заключается в том, что множество всех компонентов, способных к взаимодействию, и количество групп, способных к связыванию, является конечным и ограниченным и, кроме того, для конкретной задачи может ограничиваться соответствующим образом. Для каждого произвольно выбираемого подмножества таких групп можно создать произвольные классы сочетаний с m элементами (m = 2, 3, 4, ...), соответственно. Пример может представлять собой класс 3 со всеми возможными сочетаниями из трех групп, способных к связыванию, соответственно, из выбора n = 5, например, с фенильной, алкильной, амино, карбоксильной и амидной группами.

Таким образом, каждый белок может быть разделен на 20 компонентов, таким образом, аминокислоты, из которых, в свою очередь, в первом приближении от n = 6 до n = 9 групп, способных к связыванию, являются релевантными для нековалентного взаимодействия со вторым субстратом. Это сокращение достигается тем, что одна и та же группа или эквивалентная группа, способная к связыванию, содержится в нескольких аминокислотах, например гидроксильная, карбоксильная и амидная группа, а также основная функция, если небольшие различия между лизином, аргинином, триптофаном или гистидином не являются важными.

Сравнимым образом, 8 изомерных кетогексозили 16 стереоизомерных альдогексоз и пиранозидов, и фуранозидов, полученных из них, могут использоваться в качестве компонентов, которые представляют олигосахариды.

Это означает, что каждый произвольный неизвестный субстрат состоит из счетного количества компонентов, которые, в свою очередь, содержат определенное количество групп, способных к связыванию, соответственно. Компоненты и группы, способные к связыванию, происходят от химических знаний и являются, как правило, известными в соответствии с типом и свойствами. Это в основном верно, если они предназначаются для органической химии или для химии комплексных соединений.

Поскольку можно синтезировать заранее для каждого сочетания известных компонентов и групп, способных к связыванию, библиотеки с произвольным набором сорбентов, являющихся комплементарными и идентичными им, фундаментально, каждый компонент из молекулярной области или из сайта связывания первого субстрата неизвестной структуры может быть включен или может содержаться в такой библиотеке сорбентов. Это верно и для сочетаний групп, способных к связыванию.

В способе в соответствии с настоящим изобретением могут получаться также несколько сорбентов, то есть коллекция сорбентов. Теперь можно осуществить контакт известного или неизвестного второго субстрата, являющегося отличным от первого субстрата и у которого эти группы, способные к связыванию, являются известными, с указанной коллекцией сорбентов и можно определить прочность связывания. Посредством этого, получают информацию о том, как компоненты расположены на сайте связывания второго субстрата и как расположена пространственная структура сайта связывания. Таким образом, новый способ может также использоваться для определения структур.

Кроме того, новый способ селективного связывания указанного субстрата является исключительно ценным также для разработки агентов, предпочтительно для разработки лекарственных средств. Является повсеместно известным, что эффективность лекарственного средства основывается на том, что он связывается при физиологических условиях с природным рецептором, который, например, может представлять собой гормон или фермент. В настоящее время является возможным выделение сайта связывания природного рецептора способом, описанным выше, и генерирование коллекции сорбентов. Затем каждый сорбент из коллекции указанных сорбентов содержит определенные компоненты (детали или части) указанных сайтов связывания. Предпочтительно при этом имитируется также пространственное расположение компонентов, а также предпочтительное пространственное расположение компонентов сайта связывания в целом. Если теперь определяется прочность связывания произвольного субстрата, например лекарственного средства, по отношению к каждой из указанных частей синтетического рецептора, из которых теперь каждый представляет собой другую структурную часть природного рецептора, из данных связывания получают информацию о том, может ли вообще указанный субстрат как следует взаимодействовать с природным рецептором, и если да, то с какой из пространственно расположенных групп рецептора. Затем посредством соответствующей химической модификации субстрат, а таким образом, и лекарственное средство, которое должно разрабатываться, может оптимизироваться до тех пор, пока не будет получено максимальное связывание с рецептором.

Предпочтительно способ является пригодным для выделения биологических полимеров, которые являются неизвестными или для которых до настоящего времени только постулируется определенная функция, предпочтительно белков или гликопротеинов, и для проверки указанных белков или гликопротеинов в соответствии с их свойствами.

Сравнимым способом предполагается синтезировать для пептидов по фаговому отображению структуру сорбента, который является комплементарным к олигонуклеотидам или к другим матрицам, которые могут использоваться для непосредственного выделения молекул агентов из смесей.

Наоборот, посредством конструирования структурных деталей, являющихся типичными для агентов на поверхности сорбента, предполагается связывать из смеси субстратов, соответственно, соответствующий субстрат и характеризовать его. Например, такой субстрат представляет собой рецептор.

На стадии (i) выбор, по меньшей мере, двух различных групп, способных к связыванию первого синтетического или природного субстрата с сорбентом, осуществляется посредством определения указанных групп из синтетического первого или природного первого субстрата. Определения, по меньшей мере, двух различных групп, способных к связыванию первого синтетического или природного субстрата с сорбентом, может осуществляться любым вообразимым способом, то есть эти произвольные группы могут выбираться посредством произвольных способов постольку, поскольку эти группы способны к связыванию. В предпочтительном варианте осуществления выбор осуществляется в соответствии с нековалентными взаимодействиями, которые следует ожидать от субстрата.

В указанном варианте осуществления настоящего изобретения предпочтительно определение в соответствии со стадией (i) включает разделение синтетического или природного первого субстрата, по меньшей мере, на два компонента, имеющих, по меньшей мере, две группы, способные к связыванию сорбента.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает, что, по меньшей мере, один первый субстрат является таким же субстратом, как и, по меньшей мере, второй субстрат, и, соответственно, по меньшей мере, две различных группы, способных к связыванию второго субстрата, выбирают среди таких групп, которые являются комплементарными к группам, которые определяются на стадии (i).

Другой вариант осуществления настоящего изобретения отличается тем, что, по меньшей мере, один первый субстрат является отличным, по меньшей мере, от одного второго субстрата и что соответствующие, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию второго субстрата, выбирают среди таких групп, которые являются комплементарными к группам, которые выбираются на стадии (i).

Другой вариант осуществления настоящего изобретения также отличается тем, что, по меньшей мере, две группы, способные к связыванию, по меньшей мере, одного второго субстрата, выбирают среди групп, которые определяются в соответствии со стадией (i), то есть группы второго субстрата, способные к связыванию, являются комплементарными к соответствующим группам первого субстрата.

В рамках настоящего изобретения в одном из вариантов осуществления является возможным разделение на стадии (i) синтетического или природного субстрата только на два компонента, имеющие, каждый, одну группу, способную к связыванию, при этом на стадии (ii) получается только один сорбент.

Однако является также возможным разделение синтетического или природного субстрата на три компонента, попарное объединение которых приводит к получению трех сорбентов на стадии (ii).

При разделении на четыре компонента шесть сорбентов получают посредством попарного объединения на стадии (ii).

Однако также является возможным, что в случае трех различных компонентов, кроме попарного объединения на стадии (ii), указанные три компонента могут наноситься вместе на сорбент, как триплет. Наряду с рассмотренными выше тремя сорбентами, в дополнение к этому, получают четвертый сорбент.

Аналогичным образом также является возможным, что в случае четырех различных компонентов, наряду с попарным объединением на стадии (ii), которое приводит к получению шести сорбентов, в дополнение к этому могут быть получены четыре сорбента, которые содержат по три различных компонента, соответственно, и еще один сорбент, который содержит все четыре компонента, как квартет.

Как следствие, настоящее изобретение также отличается тем, что определение, по меньшей мере, двух групп, способных к связыванию сорбента, из синтетического или природного первого субстрата со стадии (i) дает два компонента, имеющих, каждый, по меньшей мере, одну группу, способную к связыванию сорбента, и на стадии (ii) получают один сорбент; или же определение, по меньшей мере, двух групп, способных к связыванию сорбента, из синтетического или природного первого субстрата со стадии (i) дает три компонента, имеющих, каждый, по меньшей мере, одну группу, способную к связыванию сорбента, и на стадии (ii) получают, по меньшей мере, три сорбента; или определение, по меньшей мере, двух групп, способных к связыванию сорбента, из синтетического или природного первого субстрата со стадии (i) дает четыре компонента, имеющих, каждый, по меньшей мере, одну группу, способную к связыванию сорбента, и на стадии (ii) получают, по меньшей мере, шесть сорбентов.

Подобным же образом предполагается также выбор n компонентов из большого количества i компонентов и объединение их в мультиплеты из m групп, способных к связыванию, соответственно. Например, можно выбрать из множества природных аминокислот компоненты фенилаланин, тирозин, изолейцин, аспарагиновую кислоту, аспарагин, серин, лизин, триптофан и гистидин (n = 9), с помощью которых могут быть перекрыты наиболее важные типы нековалентного взаимодействия. Сочетание из каждых m = 4 различных групп, способных к связыванию, от указанного выбора дает 126 различных вариантов сорбентов, которые также могут использоваться комбинаторным образом или в качестве анализа для целей связывания и изучения связывания.

Каждый из указанных m вкладов в нековалентное взаимодействие создает для каждого индивидуального сорбента характерную величину для общего взаимодействия с веществом, которое должно связываться. Указанные индивидуальные вклады каждой группы, способной к связыванию (m=1), могут определяться экспериментально, в зависимости от растворителя, для любого вещества, которое должно связываться, в пределах, которыми можно пренебречь при применении. Подобным же образом можно получить данные измерений для дублетных взаимодействий с m = 2, для триплетных взаимодействий с m = 3 и тому подобное.

При этом получают полный набор изменений энергии для различных форм и сочетаний нековалентных взаимодействий, дающий затем возможность для предсказания прочности связывания между двумя произвольными субстратами или компонентами. При этом также используется тот факт, что различные нековалентные взаимодействия зависят от растворителя и pH. Так, взаимодействия водородной связи имеют сильное влияние в апротонных неполярных органических растворителях, но малое влияние в протонных полярных растворителях или в воде. Для основных остатков карбоксильные группы дают сильные ионные связи в органических растворителях, однако, как правило, в воде детектируются только сравнительно более слабые энтропийные взаимодействия.

В качестве примера указанные корреляции иллюстрируются посредством связывания аминокислотных производных с различными сорбентами. При этом, как уже отмечалось, из значений k' при хроматографическом измерении можно сделать выводы относительно константы связывания K_A, при условии, что концентрации компонентов, которые присоединены к сорбенту, или групп, способных к связыванию, известны. С помощью этого создается быстрый способ, который может использоваться параллельно для получения констант связывания от субстратов, конкурирующих за сайт связывания, также, если они присутствуют в сложной смеси.

Из значений константы связывания и из энергий связи, которые могут быть получены для сочетаний многовалентных взаимодействий, описанным способом можно сделать выводы относительно типа и количества групп, способных к связыванию, для структурно неизвестного вещества, которое должно связываться, или постулировать отсутствие других групп. Таким образом, можно сделать выводы относительно количества карбоксильных групп, основных групп или алифатических или ароматических остатков в связанном аминокислотном производном или пептиде.

Подобным же образом можно сделать выводы относительно структурно-зависимого оцененного или возможного поведения при связывании между двумя субстратами, имеющими неизвестную структуру, коль скоро их группы, способные к связыванию, известны. Это можно применить к пептидам или фрагментам белков, если известна только композиция аминокислот.

Подобным же образом предполагается предсказывать или описывать поведение при связывании между двумя субстратами неизвестной структуры, если указанные субстраты имеют стабильную пространственную структуру в выбранной системе растворителей. Два белка или гликопротеина с определенной третичной структурой, взаимодействующие друг с другом, по меньшей мере, на одном сайте связывания, будут подвергаться взаимодействиям с силой или пределами изменения, подобными элементам библиотеки сорбентов, которые являются комплементарными друг к другу, соответственно.

Другое важное применение описывает получение сорбентов, которые представляют собой полный набор всех сочетаний групп, способных к связыванию, являющихся комплементарными к сайту связывания на белке или гликопротеине. Затем указанная библиотека сорбентов анализируется полным набором лигандов, которые, например, представляют собой все сочетания из двух, трех и четырех групп, которые точно являются способными к связыванию на сайте связывания белка. Затем эти группы, способные к связыванию, размещаются на сорбентах, которые, каждый, имеют самую прочную связь, которая предпочтительно должна содержаться в агенте, который должен разрабатываться. Является самоочевидным, что белки также могут связываться с указанными сорбентами, служа в качестве модели для комплементарных групп.

Аналогичным образом из картины связывания циклического пептида, который получают посредством фагового анализа, можно сделать вывод относительно сайта связывания в соответственной белковой мишени. Кроме того, предполагается создавать, посредством комплементарного картирования такого пептида, матрицу сорбента на носителе для обнаружения новых агентов, имеющих соответствующую конфигурацию и конформацию, соответствующую указанному пептиду.

Для этого указанный способ может использоваться для связывания, характеризации и проверки неизвестных белковых мишеней и сайтов связывания для неконкурентно или модуляторно действующих агентов. Кроме того, можно реализовать гибкие и нестабильные агенты, такие как пептиды, внутри жестких структур с удовлетворительной возможностью введения.

Во всех указанных случаях прогноз структуры делается возможным тем, что субстраты приводятся в контакт с соответствующим выбором сорбентов и измеряются данные по связыванию. При этом для получения структуры комплементарного субстрата отсутствующие или слабые взаимодействия являются так же важными, как и прочная связь. Если, например, субстрат содержит аминокислоту, связь с сорбентом, содержащим карбоксильные группы, будет больше на характерную величину, чем связь того же субстрата с сорбентом, содержащим гидроксильные группы или даже амино группы.

Главное практическое значение указанного подхода заключается в исключении главной части предполагаемых возможностей связывания, при этом имеет место, по меньшей мере, ограничение работы исследуемым дополнительно количеством возможных сочетаний связывания. Такой же принцип используется при скрининге, при исследовании смесивеществ на вещества, имеющие заранее заданные структурные особенности, которые содержатся в ней. При этом очень практичная выгода представляет собой достигнутое исключение большой главной части бесполезных веществ без дополнительной работы.

Предпочтительно расщепление компонентов осуществляется таким способом, что получают компоненты, которые находятся в непосредственной пространственной близости, в сайте связывания природного или синтетического субстрата. Пространственное расположение сайта связывания может характеризоваться посредством расщепления на два компонента при линейном расположении указанных компонентов, на три компонента при треугольнике и на четыре компонента при (неправильном) тетраэдре.

Если указанный сайт связывания формируется таким образом, что в указанном сайте связывания предпочтительно существуют три или четыре компонента, по меньшей мере, с одной группой, способной к связыванию, соответственно, стереоизомерные субстраты, когда они существуют, например, в рацемических смесях, как правило, связываются с различной прочностью.

Как следствие, стереоизомерные субстраты также могут связываться с различной прочностью в соответствии со способом в соответствии с настоящим изобретением посредством, по меньшей мере, одного сорбента в соответствии с настоящим изобретением. Это свойство может использоваться для разработки агентов, поскольку известно, что стереоизомерные соединения могут иметь различную физиологическую активность.

Таким образом, новый способ представляет собой ценный способ для селективного выделения одного или нескольких стереоизомерных соединений из смеси стереоизомерных соединений. Например, он может использоваться для разделения рацемических смесей.

В качестве дополнительных стереоизомерных соединений, которые могут селективно связываться, могут быть рассмотрены диастереомеры, конформеры, геометрические изомеры, такие как цис и транс изомерные соединения, эпимеры, а также аномеры, такие как α- и β-гликозидные сахара.

Однако не только стереоизомерное соединение может селективно связываться посредством нового способа, но также и конституционные изомеры, то есть соединения, имеющие одинаковый элементный состав, в которых, однако, элементы расположены по-разному по отношению друг к другу.

Например, предполагается разделять конденсированные ароматические системы, имеющие одинаковую эмпирическую формулу, но различающиеся по типу связей углеродных колец.

При нанесении, по меньшей мере, двух различных групп, способных к связыванию, на носитель на каждой из стадий (ii), соответственно, в соответствии со способами, как описывается впоследствии, как правило, нельзя предотвратить того, что, по меньшей мере, на одном из полученных сорбентов генерируются не только области связывания, в которых сосуществуют при статистическом распределении желаемые, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию, однако, что также генерируются области, в которых в основном присутствуют только такие же группы или области, которые обогащены указанными группами. Однако такие области не нарушают селективное выделение указанного субстрата, поскольку такая область, как правило, связывается слабее, чем область, которая содержит, по меньшей мере, две различных группы. По большей части такая область, содержащая в основном только один тип групп, способных к связыванию, даже отталкивает указанный субстрат. В частности, такая область является отталкивающей, если некомплементарные группы стоят друг напротив друга.

Как правило, всегда и везде некомплементарные группы, стоящие друг напротив друга, будут ослаблять связывание на первом и втором субстрате. Указанный эффект осуществляется уже для двухвалентных связей. Если, например, в качестве групп, способных к связыванию, выбираются, с одной стороны, карбоксильный остаток, а с другой стороны, аминовый остаток, а также, с одной стороны, фенильный остаток, а с другой стороны, флуоренильный остаток, каждое пространственное расположение, в котором, по меньшей мере, один из полярных остатков стоит напротив неполярного остатка, является энергетически относительно менее благоприятным. Из-за подвижного расположения полимерных цепей второй субстрат, который должен связываться на сорбенте, будет спонтанно присоединяться таким способом, когда выигрывается максимально возможная энергия Гиббса.

В целом, можно выразить указанные факты таким способом, что в сорбенте пара комплементарных групп должна стоять напротив пары групп, способных к связыванию. Связь между сорбентом и лигандом достигает своей максимальной прочности, если все вовлеченные в нее группы способны комплементарно располагаться друг с другом в парах или в мультиплетах, соответственно.

Уже при двухвалентном согласовании двух субстратов становится заметной зависимость от направления. Указанное стерическое показание будет значительно усиливаться при переходе к трехвалентным и четырехвалентным взаимодействиям. Для высокого выхода энергетически оптимальных сайтов связывания необходимы полимерные производные с особенно высокой конформационной подвижностью. При этом рассматриваются сополимеры, в которых между связанными группами, способными к взаимодействию, встроены подобласти с очень высокой конформационной подвижностью, например алкильные цепи.

Молярное отношение, соответственно, локальное отношение концентраций, по меньшей мере, двух различных групп, способных к связыванию, которые наносятся, по меньшей мере, на один сорбент, является исключительно важным для селективного связывания субстрата. Предпочтительно каждая группа на субстрате, которая должна связываться, должна также найти группу, способную к связыванию, на сорбенте.

Таким образом, предпочтительно, по меньшей мере, две различных группы, способных к связыванию, наносятся при молярном отношении, оптимально соответствующем структурным требованиям субстрата, который должен связываться.

Предпочтительно, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию, которые предпочтительно являются одинаковыми или являются комплементарными к группам первого или второго субстрата, наносятся на сорбент при таком молярном отношении, как оно существует также и в субстрате, который должен связываться, или как оно существует в копируемом первом субстрате. Предпочтительные для этого используемые способы получения описаны ниже.

Синтетический или природный субстрат со стадии (i) может иметь низкую молекулярную массу, предпочтительно молекулярную массу ниже 1000 Да. При этом, однако, указанные субстраты могут также представлять собой олигомеры или полимеры, предпочтительно биологические полимеры.

Предпочтительно один субстрат имеет низкую молекулярную массу, а другой субстрат представляет собой биологический полимер.

Предпочтительно, по меньшей мере, один сорбент, способный к связыванию, предпочтительно биологический субстрат, имеет одну группу, способную к связыванию, которая является также ответственной за связывание структур, которые существуют в природе, или за связывание решающих частей таких структур, и которая может взаимодействовать с субстратом, который предпочтительно представляет собой биологический субстрат. В дальнейшем группы также определяются как рецепторы или рецепторные группы.

Предпочтительно, по меньшей мере, две группы, способные к связыванию, представляют собой части компонентов или части или фрагменты субстратов, имеющих функциональные группы. При этом здесь, в частности, должны рассматриваться группы ферментов, группы аминокислот, группы пептидов, группы сахаров, группы аминосахаров, группы сахарных кислот, а также олигосахаридные группы, соответственно, их производные, а также нуклеозиды и нуклеотиды. Другие пригодные для использования субстраты представляют собой пиримидиновые основания и пуриновые основания, такие как цитозин, урацил, тимин, пурин, аденин, гуанин, уреиновая кислота, гипоксантин, 6-тиопурин, 6-тиогуанин, ксантин.

Фрагменты молекул представляют собой, например, фенильный, фенольный или индольный остатки из фенилаланина, тирозина или триптофана, а также гидроксильные, карбоксильные, амино и амидные группы. Единственное, что является главным для указанных выше групп, это то, чтобы принцип связывания рецептора с субстратом, который должен быть найден в природе, сохранялся или сохранялся приблизительно так, чтобы посредством нового способа, например, могли наноситься синтетические ферменты, домены связывания антител или другие физиологические эпитопы, то есть молекулярные области, полные хозяева, пептиды, гликопептиды, эпитопы белков, гликопротеины, а также олигонуклеотиды.

Предпочтительно в качестве аминокислоты могут быть рассмотрены следующие кислоты:

аминокислоты, имеющие алифатические остатки, такие как глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин;

аминокислоты, имеющие алифатическую боковую цепь, которая содержит одну или несколько гидроксильных групп, таких как серин, треонин;

аминокислоты, имеющие ароматическую боковую цепь, такие как фенилаланин, тирозин, триптофан;

аминокислоты, которые содержат основные боковые цепи, такие как лизин, аргинин, гистидин;

аминокислоты, которые имеют кислотные боковые цепи, такие как аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота;

аминокислоты, которые имеют амидные боковые цепи, такие как аспарагин, глутамин;

аминокислоты, которые имеют боковые цепи, содержащие серу, такие как цистеин, метионин;

модифицированные аминокислоты, такие как гидроксипролин, γ-карбоксил глутамат, O-фосфосерин;

производные аминокислот, рассмотренных выше, или необязательно дополнительных аминокислот, например аминокислот, этерифицированных по карбоксильной группе, или необязательно по карбоксильным группам, например алкильными или арильными радикалами, которые могут необязательно замещаться соответствующим образом.

Вместо аминокислоты рассматривается также использование одного или нескольких дипептидов или олигопептидов, где, в частности, могут использоваться бета, гамма или другие структурно изомерные аминокислоты и пептиды, полученные из них, такие как депсипептиды.

При этом возможно также, что с одним компонентом одновременно вставляются, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию.

Как следствие, способ в соответствии с настоящим изобретением также отличается тем, что один компонент несет, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию.

Если к одному и тому же сорбенту должны присоединяться более чем четыре группы, способные к связыванию, тогда предпочтительный вариант осуществления состоит в объединенной вставке, по меньшей мере, двух из указанных групп, способных к связыванию, посредством уже завершенного компонента в определенном пространственном расположении, соответственно. При этом предпочтительно такие группы, способные к связыванию, присоединяются в компоненте, который уже находится вблизи, в первом субстрате.

Является самоочевидным, что предполагается последовательная или одновременная вставка в сорбент нескольких таких, по меньшей мере, двухвалентных компонентов, а кроме того, объединение указанных компонентов с одновалентными компонентами.

Простой пример двухвалентного компонента представляет собой флуоренилметоксикарбонил глутамин, также определяемый как Fmoc глутамин. Здесь карбоксильная группа используется для связывания с сорбентом, при этом амидный радикал способен полярно связывать лиганд, а флуоренильная группа ответственна за π-π взаимодействие. Подобным же образом могут использоваться олигопептиды, а также, однако, гребенчатые производные олигомеров.

Предпочтительно связывание указанных субстратов, по меньшей мере, с одним сорбентом имеет место посредством радикалов или групп аминосахаров, сахаров, нуклеотидов и нуклеозидов, а также пиримидиновых оснований и пуриновых оснований, которые присутствуют на сорбенте.

В результате настоящее изобретение также отличается тем, что, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию, по меньшей мере, одного сорбента, выбираются среди групп, которые являются частью аминокислот, сахаров, нуклеотидов, нуклеозидов, пиримидиновых оснований или пуриновых оснований.

В другом варианте осуществления, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию, по меньшей мере, одного второго субстрата, выбираются среди групп, которые являются частью аминокислот, сахаров, нуклеотидов, нуклеозидов, пиримидиновых оснований или пуриновых оснований.

Посредством вставки дополнительных групп, имеющих природное или синтетическое происхождение, в особенности имеющих синтетическое происхождение, способность нековалентного связывания сорбента может целенаправленно варьироваться, в частности может усиливаться.

Например, для нового способа могут применяться аминокислоты, которые снабжены синтетическими защитными группами. Например, могут применяться аминокислоты, являющиеся защищенными флуоренильным остатком. Наряду с флуоренильным остатком могут также применяться такие остатки, как антраценильная или нафтильная группа. Посредством этого путем формирования дополнительных нековалентных связей между ароматическими кольцами защитных групп и связывающимися группами субстратов может достигаться усиление свойств связывания. В качестве дополнительных примеров рассматриваются нитрофенильные остатки и олигофторфенильные остатки и другие богатые электронами и являющиеся плохими донорами электронов ароматические системы, которые способны к формированию π-π взаимодействий.

Предпочтительно сорбент со стадии (ii) содержит носитель, который может создаваться из неорганических или органических материалов или неорганических и органических материалов. В качестве материалов носителей пригодными являются все материалы, на которые могут наноситься с помощью соответствующих способов, по меньшей мере, две различные группы со стадии (i).

В случае, когда материал носителя является твердым, его поверхность может представлять собой плоскую поверхность, такую как стеклянные или металлические пластинки, или также искривленные поверхности, или поверхности, являющиеся погруженными в пористый материал, такие как трубчатые или губчатые поверхности, такие как цеолиты, шарики силикагеля или целлюлозы. Кроме того, материалы носителей могут иметь природное или синтетическое происхождение. Среди прочего рассматриваются,например, желатин, коллаген или агароза. Также могут использоваться пористые или непористые смолы, а также пластиковые или керамические поверхности.

Однако также можно использовать в качестве носителя одну или несколько жидкостей, предпочтительно такие жидкости, которые имеют высокую вязкость. Предпочтительно пригодными для использования соединениями являются силиконовые масла, имеющие высокую вязкость.

Предпочтительно соответствующие, по меньшей мере, две различные группы со стадии (i) присутствуют на носителе в форме групп, ковалентно связанных с полимером.

При этом термин "полимер" охватывает также соединения, имеющие более высокую молекулярную массу, которые характеризуются в химии полимеров как "олигомеры". При этом также могут использоваться полимеры, а также смеси полимеров.

Не желая ограничиваться определенными полимерами, в качестве возможных полимеров, среди прочего,могут быть рассмотрены следующие полимеры:

полисахариды, например целлюлоза, амилоза и декстраны;

олигосахариды, например циклодекстрин;

хитозан;

поливиниловый спирт, политреонин, полисерин;

полиэтиленимин, полиаллиламин, поливиниламин, поливинилимидазол, полианилин, полипирролы, полилизин;

(сложные эфиры) поли(мет)акриловой кислоты, полиитаконовая кислота; полиаспарагин;

полицистеин.

Подобным же образом не только гомополимеры, но также сополимеры и, в частности, блок-сополимеры и вырожденные сополимеры являются принципиально пригодными для использования в настоящем способе. Здесь могут рассматриваться сополимеры, имеющие нефункционализированные компоненты, такие как со-стирол или со-этилен, а также такие сополимеры, как со-пирролидон.

Указанные полимеры имеют, по меньшей мере, две группы, которые являются одинаковыми или являются различными, которые могут ковалентно связываться с полимером посредством, по меньшей мере, двух различных групп, способных к связыванию, со стадии (i).

По этой причине один из вариантов осуществления настоящего изобретения отличается тем, что соответствующие, по меньшей мере, две различные группы со стадии (ii) ковалентно связываются с полимером.

Предпочтительно функциональные группы полимера, имеющего, по меньшей мере, две идентичных или различных функциональных группы, которые могут быть рассмотрены, представляют собой, среди прочего, группы OH, необязательно замещенные амино группы, группы SH, группы OSO₃H, группы SO₃H, группы OPO₃H₂, группы OPO₃HR, группы PO₃H₂, группы PO₃HR, группы COOH и смеси двух или более из них, где R предпочтительно представляет собой алкильный радикал. Подобным же образом полимеры, имеющие, по меньшей мере, две идентичных или различных функциональных группы, могут также содержать дополнительные полярные группы, например, -CN.

При этом в одном из вариантов осуществления на стадии (ii) возможно сначала включить в указанный полимер, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию посредством, по меньшей мере, двух идентичных или различных функциональных групп, при этом образуется полимер, который является дериватизованным указанными группами. Затем указанный дериватизованный полимер может наноситься на носитель.

Дериватизация функционализированного полимера, по меньшей мере, двумя группами может осуществляться в соответствии с известными способами, как в гомогенной, так и в гетерогенной фазе.

Дериватизация в гетерогенной фазе может осуществляться посредством твердофазной реакции.

Если полимеры, имеющие, по меньшей мере, две идентичных или различных функциональных группы, дериватизуются в гомогенной жидкой фазе указанными, по меньшей мере, двумя различными группами, способными к связыванию, тогда для достижения оптимальной растворимости предпочтительно применяют смешанные функциональные или, альтернативно, предварительно дериватизованные полимеры. Их примеры, которые могут быть рассмотрены, представляют собой, например:

- частично или полностью силилированную, алкилированную или ацилированную целлюлозу;

- поливинилацетат/поливиниловый спирт;

- простой поливиниловый эфир/поливиниловый спирт;

- N-бутилполивиниламин/поливиниламин.

Подобным же образом могут также использоваться смеси полимеров/сополимеров. Здесь могут использоваться все пригодные для использования смеси полимеров/сополимеров, например смеси полимеров и сополимеров, уже рассмотренные выше, где, средипрочего,здесь должны быть рассмотрены следующие сочетания, такие как:

- поли(акриловая кислота-со-винилацетат);

- поли(виниловый спирт-со-этилен);

- поли(оксиметилен-со-этилен);

- модифицированные полистиролы, например сополимеры стирола с (сложными эфирами) (мет)акриловых кислот;

- поливинилпирролидон и его сополимеры с поли(мет)акрилатами.

Предпочтительно полимер, имеющий, по меньшей мере, две идентичных или различных функциональных группы, взаимодействует до дериватизации, по меньшей мере, с двумя различными группами, с активирующим реагентом. Такие реагенты и способы их применения, например, описаны в Международной заявке WO 00/32649.

Например, в качестве активирующих реагентов могут использоваться соединения, которые получают из структурного элемента сукцинимида, при этом атом водорода, связанный с N, заменяется группой -OCO-Cl. Таким примером является следующее соединение:

При этом R₃-R₁₀ предпочтительно представляют собой водород, алкильный, арильный, циклоалкильный и гетероциклический остатки. Если остатки R₃-R₁₀ представляют собой водород, тогда в последующем соединение также определяется как ONB-Cl.

Если полимер, имеющий, по меньшей мере, две функциональных группы, которые являются одинаковыми или являются различными, взаимодействует с активирующим реагентом, тогда продукт указанной реакции может взаимодействовать с соответствующими соединениями, имеющими группы, которые требуются для связывания с указанным субстратом.

Предполагается также взаимодействие полимера, имеющего две функциональных группы, которые являются одинаковыми или являются различными, со смесью двух или более соответствующих активирующих реагентов. Указанные реагенты могут взаимодействовать с полимером одновременно. Подобным же образом два или более активирующих реагента могут впоследствии взаимодействовать с полимером.

Здесь, в принципе, могут использоваться любые соединения, которые могут взаимодействовать с активированным полимером и которые непосредственно или опосредованно приводят к получению желаемого полимера, который затем дериватизируется. Для дериватизации, среди прочего,могут использоваться соединения, имеющие, по меньшей мере, одну нуклеофильную группу.

Дополнительная возможность представляет собой взаимодействие активированного полимера с содержащим амино группы одноатомным или многоатомным спиртом, соответственно меркаптаном. Если полимер, содержащий, по меньшей мере, две функциональных группы, активирован, например, ONB-Cl, одноатомный или многоатомный спирт, содержащий амино группу, или одноатомный или многоатомный меркаптан, содержащий амино группу, будет селективно взаимодействовать с амино группой. Группы OH или SH, включенные таким образом в полимер, могут, в свою очередь, активироваться на следующей стадии, например, с помощью одного из активирующих реагентов, описанных выше, при этом облегчаются удлинения и разветвления цепи, в зависимости от функциональности спиртов или меркаптанов, используемых изначально.

В другом варианте осуществления возможно также сначала взаимодействие соединений, каждое из которых имеет, по меньшей мере, одну отличную группу, способную к связыванию с активирующим реагентом, а затем взаимодействие продукта, полученного по указанной реакции, с указанным полимером.

Предпочтительно активированные производные сахаров, аминокислот, нуклеотидов, нуклеозидов, пиримидиновых оснований и пуриновых оснований взаимодействует с полимером, имеющим, по меньшей мере, две функциональные группы, которые являются одинаковыми или являются различными. При этом в предпочтительном варианте осуществления, в свою очередь, соединения активируются ONB-Cl или соединением указанного структурного типа.

Указанные реакции могут использоваться для поперечной сшивки полимера, для стабилизации полимера и для разветвления полимера.

Кроме того, указанные реакции делают возможным получение производных полимеров, которые имеют большое разнообразие пространственных расположений и которые, соответственно, могут использоваться для множества применений, при которых указанное пространственное расположение является критически важным.

Таким образом, например, возможна реализация расположений, которые построены как волосистые стержни, гребенчатые полимеры, сетки, корзинки, чашки, трубки, воронки или клетки.

При этом реакции могут осуществляться в апротонном диполярном и/или полярном протонном растворителе или смесях растворителей, таких как водные смеси растворителей. В зависимости от типа полимера, который должен взаимодействовать, и используемого активирующего реагента и/или соединений, имеющих, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию, наряду с водой в указанных смесях растворителей могут присутствовать и различные другие растворители. Здесь, среди прочего,могут использоваться такие растворители, как апротонные-диполярные растворители, такие как ДМСО, ДМФ, диметилацетамид, N-метилпирролидон, тетрагидрофуран или простой метил-трет-бутиловый эфир.

pH, который выбирается для указанных реакций, как правило, находится в пределах от 4 до 14, предпочтительно в пределах от 8 до 12 и, в частности, в пределах от 8 до 10. Для установления определенного pH могут использоваться соответствующие буферные растворы.

Посредством растворителя и pH могут целенаправленно устанавливаться свойства набухания и усадки сетки, при этом посредством сетки может оказываться влияние на доступ субстрата к сорбенту.

Степень дериватизации полимера, то есть степень, до которой функциализованный полимер может дериватизироваться, по меньшей мере, двумя группами, способными к связыванию, может изменяться таким способом, чтобы достигалось наилучшее возможное взаимодействие с субстратом.

Предпочтительной является степень дериватизации в пределах от 1 до 70%, более предпочтительно в пределах от 3 до 60% и особенно предпочтительно в пределах от 5 до 50%.

При этом является также возможным, что, по меньшей мере, две из функциональных групп, которые являются одинаковыми или являются различными, дериватизуются таким образом, что они могут взаимодействовать в качестве рецепторных групп с субстратом, и, по меньшей мере, одна функциональная группа, являющаяся неспецифичной к субстрату, и/или мономерная единица без функциональной группы располагаются между двумя указанными дериватизованными группами, и при этом функциональные группы являются одинаковыми или являются отличными друг от друга и выбираются из указанных выше групп.

Предполагается также, что группы, которые по-прежнему существуют в полимере в недериватизованной форме, вносят вклад во взаимодействие с субстратом.

Также возможно использование производного полимера, имеющего, по меньшей мере, две функциональные группы, которые являются одинаковыми или являются различными, у которого другая функциональная группа, являющаяся неспецифичной к субстрату, дериватизируется с помощью концевой блокирующей группы.

Посредством соответствующего выбора концевой блокирующей группы возможно также влиять на растворимость производного полимера, имеющего конечную блокирующую группу или концевые блокирующие группы, и адаптирование указанных производных к требованиям возможных последующих реакций.

В принципе, в качестве концевой блокирующей группы может выбираться каждая группа, которая делает функциональную группу инертной или настолько инертной, насколько это возможно, по отношению к взаимодействиям с субстратом. В этом контексте термин "инертный" имеет то значение, что взаимодействия, которым подвергается субстрат, с рецепторными группами дериватизованного полимера, являются по сравнению со взаимодействиями, которым подвергается субстрат с одной или несколькими функциональными группами, которые дериватизованы концевой блокирующей группой, настолько сильными, что субстрат по существу связывается только посредством рецепторных групп.

Если желательным является разделение двух или более различных субстратов посредством взаимодействия между субстратом и рецепторной группой, например, в хроматографическом методе, нет необходимости в том, чтобы концевая блокирующая группа делала функциональную группу полностью инертной по отношению к возможным взаимодействиям, как описано выше. В этом случае, например, достаточно, если концевая блокирующая группа подвергается достаточно слабым или неспецифичным взаимодействиям с двумя или более субстратами, которые должны разделяться, которые не являются важными для метода разделения.

В качестве концевой блокирующей группы может, в принципе, использоваться любая группа в соответствии с литературными данными. В зависимости от субстрата предполагается, например, что в качестве концевой блокирующей группы выбирается группа, которая не является донором H. Предпочтительно здесь используется

особенно предпочтительной является

У полимера, имеющего, по меньшей мере, две функциональные группы, которые являются одинаковыми или которые являются различными, в качестве рецептора может быть вставлен каждый из описанных выше остатков, который получают посредством взаимодействия полимера, по меньшей мере, с двумя активированными дериватизующими реагентами, каждый из них содержит, по меньшей мере, одну нуклеофильную группу, или посредством взаимодействия активированного полимера, по меньшей мере, с двумя такими дериватизующими реагентами.

Предпочтительным является производное полимера, имеющее, по меньшей мере, две функциональные группы, которые являются одинаковыми или которые являются различными, как описано выше, в котором, по меньшей мере, два рецептора содержат остатки соединений или групп, являющихся ответственными за связывание в соединениях, при этом соединения выбираются из группы, включающей в себя аминокислоты, сахара, нуклеотиды, нуклеозиды, пиримидиновые основания и пуриновые основания.

Для дериватизации полимера, имеющего функциональные группы, с помощью рассмотренных соединений, производных указанных соединений или групп, содержащих указанные соединения, или их смесей можно действовать в соответствии со способами, описанными выше. Так, предполагается сначала осуществлять реакцию, например, аминокислотного соединения с соответствующим активирующим реагентом, а затем взаимодействие продукта реакции с полимером. Подобным же образом предполагается сначала взаимодействие полимера с соответствующим активирующим реагентом, а затем с аминокислотой. Разумеется, предполагается также непосредственное смешивание полимера, аминокислоты и активирующего реагента.

Вставка остатков сахаров, нуклеотидов, нуклеозидов, пиримидиновых оснований и пуриновых оснований или связывающих групп, содержащихся в указанных соединениях или их смесях, является возможным аналогичным способом.

В зависимости от выбора аминокислот, сахаров, нуклеотидов, нуклеозидов, пиримидиновых оснований и пуриновых оснований, или соответствующих остатков или производных, или связывающих групп, которые содержатся в указанных соединениях, может быть необходимой возможная защита содержащихся здесь функциональных групп во время дериватизации и/или активации с помощью защитных групп. Для этого подходят все пригодные для использования защитные группы, которые известны из литературы. В зависимости от последующего использования полимеров после дериватизации указанные защитные группы могут оставаться на аминокислотном остатке, остатке сахара, нуклеотидном остатке, нуклеозидном остатке, остатке пиримидинового основания или остатке пуринового основания, или они могут опять отщепляться.

Вместо аминокислоты, предполагается также использование одного или нескольких олигопептидов.

Для оптимизации взаимодействия с субстратом жидкое производное полимера или производное полимера, которое растворено в растворителе или смеси растворителей, может деформироваться в присутствии субстрата, который здесь действует в качестве шаблона.

При этом, например, деформация осуществляется таким образом, что в соответствующем растворителе или смеси растворителей смешивают дериватизованный полимер, как описано выше, с субстратом и дают возможность полимеру принять одну или несколько конформаций, благоприятных энергетически.

При этом также предполагается смешивание и деформация дериватизованного полимера с помощью различных субстратов. Кроме того, предполагается также, если требуется, смешивание и деформация различных дериватизованных полимеров с помощью одного или нескольких различных субстратов.

Предполагается также, что производное полимера, имеющее, по меньшей мере, две функциональных группы, которые являются одинаковыми или которые являются различными, деформируется без шаблона.

После деформации конформация производного полимера, которая формируется посредством деформации в присутствии шаблона, может фиксироваться.

Здесь является также возможным нанесение деформированного полимера перед фиксацией на носителе.

В принципе, для фиксации пригодными для использования являются все предполагаемые способы. В частности, здесь должны быть рассмотрены изменения температуры, растворителя, осаждение и поперечная сшивка. Предпочтительно конформация фиксируется посредством поперечной сшивки.

При этом материал носителя и форма носителя выбираются, в основном, произвольно, однако при этом материал носителя должен кондиционироваться таким образом, чтобы полимер мог непрерывно наноситься на носитель. Предпочтительно материал носителя после нанесения дериватизованного полимера имеет только одно или несколько неспецифичных взаимодействий с веществами, которые должны разделяться, или не имеет их.

В зависимости от последующей области применения, может быть необходимым, чтобы материал носителя был стойким к давлению. В настоящем контексте термин "стойкий к давлению" имеет то значение, что материал носителя имеет стабильные размеры при давлении до 100 бар.

Указанные выше материалы могут использоваться в качестве материалов носителей. При этом форма материала носителя может адаптироваться к требованиям способа и не является ограниченной. Например, возможны носители в форме таблеток, в форме шариков или в форме нитей.

Нанесение на материал носителя выбирается по большей части произвольно. Например, возможно нанесение посредством пропитки, посредством окунания носителя в соответствующий раствор полимера, посредством напыления полимера на носитель или посредством концентрирования полимера с помощью испарения.

Возможно также нанесение дериватизованного полимера на различные пригодные для использования носители. Подобным же образом возможно нанесение двух или более дериватизованных полимеров, являющихся отличными друг от друга, на один или несколько пригодных для использования носителей. В другом варианте осуществления способа в соответствии с настоящим изобретением, дериватизованный, деформированный и фиксированный полимер переходит в пористый материал. Затем он одновременно с этим образует носитель, так что дополнительного материала носителя не требуется. При этом могут быть получены, например, шарики, нерегулярные частицы, губки, диски, нити или мембраны.

При этом может фиксироваться одна конформация, которая формируется из одного типа дериватизованного полимера. Однако подобным же образом предполагается, что конформация формируется посредством двух или более типов дериватизованных полимеров, которые являются отличными друг от друга. Здесь термин "различные типы дериватизованных полимеров" имеет то значение, что, например, полимеры отличаются друг от друга по отношению к основному полимеру, или к типу активирующего реагента, или к типу рецепторных групп, которые вставляются посредством дериватизации, или к степени активирования, или к степени дериватизации, или к сочетанию двух или более из этих особенностей.

Здесь поперечная сшивка может достигаться, например, посредством того, что две или более нитей дериватизованных полимеров непосредственно взаимодействуют друг с другом.

Это может достигаться посредством того, что группы, которые включаются посредством дериватизации, имеют такую природу, что между указанными группами могут образовываться ковалентные и/или нековалентные связи. В очень общих чертах предполагается, что указанные ковалентные и/или нековалентные связи формируются между группами, которые присоединены к одной нити полимера, и/или формируются между группами, которые присоединены к двум или более нитям полимеров, так что посредством поперечной сшивки две или более полимерных нитей могут связываться друг с другом посредством одного или нескольких сайтов.

Подобным же образом предполагается также применение для поперечной сшивки одного или нескольких соответствующих реагентов для поперечной сшивки, посредством которых, как описано выше, группы могут быть поперечно сшиты ковалентным и/или нековалентным образом внутри полимерной нити, и/или группы, которые присоединены к нескольким нитям полимеров, необязательно дериватизованных различным образом.

В принципе, в качестве реагентов для поперечной сшивки могут использоваться все пригодные для использования соединения, известные из литературы. Так, например, поперечная сшивка может осуществляться ковалентно-обратимым образом, ковалентно-необратимым образом или нековалентным образом, при этом в случае поперечной сшивки нековалентным образом должны рассматриваться, например, поперечные сшивки посредством ионных взаимодействий или посредством взаимодействий с переносом заряда.

В качестве реагентов для поперечной сшивки, которые могут приводить к ковалентно-необратимой поперечной сшивке, должны рассматриваться, среди прочего,ди- или мультифункциональные соединения, как, например, диолы, диамины или дикарбоновые кислоты. При этом, например, двухвалентные агенты для поперечной сшивки взаимодействуют с активированным производным полимера, или, по меньшей мере, двухвалентный активированный реагент для поперечной сшивки взаимодействует с неактивированным производным полимера.

Ковалентно-обратимая поперечная сшивка может реализовываться, например, посредством связывания связи сера-сера в виде дисульфидного мостика между двумя группами, которые прикреплены к одной или двум полимерным нитям.

Поперечная сшивка посредством ионного взаимодействия может иметь место, например, посредством двух радикалов, из которых один имеет в качестве структурной единицы ион четвертичного аммония, а другой имеет в качестве структурной единицы, например,

Поперечная сшивка посредством водородных связей может формироваться, например, между двумя комплементарными парами оснований, например, посредством следующей структуры

В очень общих чертах, полимеры, которые должны нековалентно поперечно сшиваться, могут выстраиваться по отношению к сайтам поперечной сшивки комплементарным образом, при этом структурные единицы, являющиеся комплементарными друг к другу, представляют собой, например, кислоту/триамин или урацил/меламин. Подобным же образом при нековалентной поперечной сшивке реагент для поперечной сшивки может быть комплементарным к сайтам поперечной сшивки на нити полимера. Пример представляет собой амино группу на полимерной нити и дикарбоновую кислоту в качестве реагента для поперечной сшивки.

Амидная связь по отношению к амино группам полимера может быть получена из карбоксилата посредством реагентов для связывания, которые известны из химии пептидов. Таким же способом карбоксильная группа, которая ковалентно связана на полимере, является поперечно сшитой с амино группами поливиниламина, или, наоборот,связанная амино группа поперечно сшивается с карбоксильной группой, например, из полиакрилата.

В основном, степень поперечной сшивки может выбираться произвольно и может, например, подбираться в соответствии с описанными в дальнейшем областями применения.

На стадии (ii) взаимодействие, по меньшей мере, двух различных групп, способных к связыванию с полимером, имеющим, по меньшей мере, две группы, также может осуществляться в гетерогенной фазе, то есть на твердой поверхности полимера. Преимущественно указанный полимер суспендируется в растворителе, имеющем только низкую растворяющую способность для наносимого полимера.

Для дериватизации полимера, а также для нанесения полученного полимера на носитель могут применяться описанные выше стадии активирования и дериватизации, а также способы поперечной сшивки и способы нанесения покрытий.

С другой стороны, возможно также использование в качестве носителя полимера, который предпочтительно дериватизуется в гетерогенной фазе, без дополнительного материала носителя.

В другом варианте осуществления описанные выше дериватизованные полимеры, которые синтезируются в гомогенной или гетерогенной фазе, предпочтительно могут наноситься на носитель постадийно. Для этого, по меньшей мере, на одной стадии, по меньшей мере, один слой, по меньшей мере, одного полимера связывается с материалом носителя и, по меньшей мере, на одной дополнительной стадии, по меньшей мере, один дополнительный слой, по меньшей мере, одного полимера наносится, по меньшей мере, на один слой полимера, который связан с материалом носителя. Соответствующие способы описываются в Международной заявке WO 01/38009.

Здесь постадийное нанесение, по меньшей мере, одного полимера может реализовываться в соответствии со всеми соответствующими способами, которые обеспечивают, чтобы за одну стадию, по меньшей мере, один слой полимера наносился таким образом, чтобы на материал носителя наносилась слоистая полимерная структура.

В первом варианте осуществления указанного способа, по меньшей мере, на одной стадии, на которой, по меньшей мере, один слой, по меньшей мере, одного полимера связывается с носителем, раствор, по меньшей мере, одного полимера приводится в контакт с материалом носителя при условиях реакции, при которых, по меньшей мере, один полимер не связывается на материале носителя, а затем условия реакции изменяются таким образом, что, по меньшей мере, один полимер связывается с материалом носителя, или во втором варианте осуществления раствор, по меньшей мере, одного полимера приводится в контакт с материалом носителя при условиях реакции, в которых раствор, по меньшей мере, одного полимера присутствует при тэта-условиях.

Здесь раствор, который приводится в контакт с материалом носителя, в соответствии с первым вариантом осуществления может иметь один или несколько растворителей, при этом, по меньшей мере, один полимер растворяется в растворителе или смеси растворителей или также может коллоидно растворяться или также суспендироваться, например, в форме суспензии наночастиц.

Затем условия реакции выбираются таким образом, чтобы посредством приведения в контакт раствора с материалом носителя сначала не имело места связывание, по меньшей мере, одного полимера с материалом носителя. Например, указанные условия реакции адаптируются посредством одного или нескольких соответствующих растворителей. Для этого предпочтительно применяются растворители, в которых, по меньшей мере, один полимер растворяется настолько хорошо, что связывание с материалом носителя прекращается.

В значении настоящего изобретения термин "полимер не связывается с материалом носителя" имеет то значение, что связывание по существу не может детектироваться посредством измерения коэффициента распределения.

Подобным же образом указанные условия реакции могут достигаться посредством соответствующего выбора температуры, при этом, например, раствор приводится в контакт с материалом носителя при температурах, настолько высоких, что связывание, по меньшей мере, одного полимера с материалом носителя прекращается.

Кроме того, указанные условия реакции могут достигаться посредством соответствующего установления pH раствора полимера в случае, когда связывание, по меньшей мере, одного полимера с материалом носителя является pH-зависимым.

Подобным же образом предполагается также сначала предотвращение связывания, по меньшей мере, одного полимера с материалом носителя посредством соответствующего сочетания двух или более из этих способов.

Посредством этого конкретного типа осуществления реакций, среди прочего, достигается то, что могут устраняться условия реакции, при которых осаждается, по меньшей мере, один полимер, содержащийся в растворе.

Относительно контакта раствора, по меньшей мере, одного полимера, по меньшей мере, с одним материалом носителя, в принципе, предполагаются все условия, соответствующие процессу.

Так, например, возможно приведение в контакт раствора, содержащего, по меньшей мере, один полимер, с материалом носителя. Подобным же образом предполагается сначала приведение в контакт материала носителя, по меньшей мере, с одним растворителем, а затем ведение, по меньшей мере, в один растворитель, по меньшей мере, одного полимера. Подобным же образом возможно сначала приведение в контакт материала носителя, по меньшей мере, с одним растворителем, а затем добавление растворителя, содержащего, по меньшей мере, один полимер. Если наносятся два или более полимеров, предполагается отдельное растворение каждого полимера или растворение вместе с одним или несколькими другими полимерами в одном растворителе или в смеси растворителей соответственно и объединенное или раздельное приведение в контакт индивидуальных растворов, каждый из которых содержит, по меньшей мере, один полимер, с материалом носителя, который уже растворен, или коллоидно растворен, или суспендирован, по меньшей мере, в одном растворителе.

В принципе, пригодными для использования являются уже описанные выше материалы носителей, на которые может быть нанесен посредством связывания, по меньшей мере, один полимер. Если наносят два или более полимеров, которые являются отличными друг от друга, является достаточным, если на материал носителя может быть нанесен один из полимеров. Предполагается также, что посредством связывания два или более различных полимеров могут быть нанесены на материал носителя.

Если применяются два или более полимеров, являющихся отличными друг от друга, и два или более материалов носителей, являющихся отличными друг от друга, тогда, среди прочего, предполагается, что все полимеры наносятся на все материалы носителей. Подобным же образом предполагается, что один или несколько полимеров могут быть нанесены на один или несколько материалов носителей и что один или несколько полимеров, являющихся отличными от них, могут быть нанесены на один или несколько материалов носителей, являющихся отличными от них.

Кроме того, могут наноситься дополнительные полимеры и соединения, такие как известные в целом добавки, при этом связывание полимера с материалом носителя может также осуществляться посредством других взаимодействий и/или способов. Кроме того, полимеры или/и соединения, присутствующие в растворе, не могут наноситься на носитель, а, например, могут оставаться в растворе. Среди прочего, предполагается, что на следующей стадии, по меньшей мере, один из указанных полимеров, например, наносится на материал носителя, который приводится в контакт с раствором, содержащим указанный полимер, до указанной дополнительной стадии.

В соответствии с первым вариантом осуществления после приведения в контакт условия реакции изменяются таким образом, что теперь имеет место связывание, по меньшей мере, одного полимера с носителем. Как описано выше, предполагается, что в случае, когда применяется два или более различных полимеров или/и два или более различных материалов носителя, полимер связывается с одним материалом носителя.

Относительно изменения условий реакции все изменения предполагаются пригодными для использования, чтобы сделать возможным связывание, по меньшей мере, одного полимера с материалом носителя.

В случае, когда связывание является температурно-зависимым, предполагается, например, либо увеличение, либо уменьшение температуры, которое может изменять благоприятность для связывания. В подобном предпочтительном варианте осуществления изменяется композиция раствора, содержащего, по меньшей мере, один полимер, или же указанный раствор медленно концентрируется.

Относительно изменения композиции раствора, содержащего, по меньшей мере, один полимер, в принципе, все способы предполагаются пригодными для использования, чтобы сделать возможным связывание посредством указанного изменения.

В предпочтительном варианте осуществления другой растворитель добавляют к раствору, в котором содержится, по меньшей мере, один полимер, который имеет худшую растворимость по отношению, по меньшей мере, к одному полимеру.

В другом варианте осуществления, композиция раствора изменяется таким образом, что добавляют, по меньшей мере, одно кислотное или, по меньшей мере, одно основное соединение, или смесь двух или более из них, посредством чего pH раствора изменяется таким образом, что становится возможным связывание, по меньшей мере, одного полимера. Является самоочевидным добавление одного или нескольких буферных растворов, посредством которых pH раствора изменяется таким образом, что делается возможным связывание, по меньшей мере, одного полимера.

В дополнение к этому, могут добавляться соответствующие соединения, такие как соли, содержащие, например, катионы металлов или соответствующие органические соединения, посредством которых имеет место связывание одного из полимеров.

Раствор, содержащий, по меньшей мере, один полимер, может также концентрироваться, так что концентрация, по меньшей мере, одного полимера, который должен связываться с материалом носителя, в растворе остается по большей части постоянной. Указанная концентрация раствора поддерживается посредством соответствующего медленного управления процессом, посредством которого концентрация полимера по большей части остается постоянной.

В дополнение к этому, два или более из рассмотренных выше способов могут объединяться соответствующим образом, при включении в них изменения температуры. Так, например, предполагается изменение композиции раствора, как описано выше, и вспомогательное медленное концентрирование раствора или/и соответствующее изменение температуры.

В зависимости от выбранных условий реакции предполагается, что на материал носителя наносится один полимер или несколько полимеров, которые являются отличными друг от друга. Средипрочего, предполагается выбирать условия реакции таким образом, что два или более полимера, которые являются отличными друг от друга, наносятся на материал носителя одновременно, при этом на материале носителя генерируется один слой, который содержит два или более полимеров, которые являются отличными друг от друга. Если используются два или более материалов носителей, которые являются отличными друг от друга, предполагается нанесение на каждый материал носителя одного слоя полимера, который может содержать один полимер или два или более полимеров, которые являются отличными друг от друга.

Кроме того, также возможно, что два или более слоев, по меньшей мере, одного полимера наносятся на материал носителя на одной стадии, при этом первый слой полимера связывается с материалом носителя, второй слой полимера связывается с первым слоем, и необязательно каждый следующий слой полимера связывается с соответствующим предыдущим слоем. При этом, в принципе, каждый слой может содержать один тип полимера или два или более полимера, являющихся отличными друг от друга.

Кроме того, в соответствии со вторым вариантом осуществления раствор, по меньшей мере, одного полимера может приводиться в контакт с материалом носителя при условиях реакции, при которых раствор, по меньшей мере, одного полимера присутствует при тэта-условиях. По отношению к указанному варианту осуществления нанесение, по меньшей мере, одного полимера на материал носителя, в частности, имеет место во время приведения в контакт раствора с материалом носителя.

В соответствии со способом, описанным ранее, предпочтительно на первой стадии слой, по меньшей мере, одного полимера наносится на материал носителя, а на второй стадии на указанный первый слой - второй слой, а на третьей стадии на второй слой - необязательно третий слой и так далее. По отношению к соответствующим способам нанесения сошлемся на обсуждение выше.

Термин "связывание полимера с носителем" охватывает все ковалентно-обратимые, ковалентно-необратимые и нековалентные взаимодействия, посредством которых, по меньшей мере, один полимер может взаимодействовать с материалом носителя или/и со слоем полимера, необязательно уже нанесенным на материал носителя, или со слоем полимера, необязательно уже нанесенным на слой полимера.

Соответственно, могут наноситься по существу все полимеры, которые, например, способны к образованию таких нековалентных взаимодействий. Здесь, среди прочего, предполагается, что, по меньшей мере, одна функциональная группа, посредством которой полимер образует, по меньшей мере, одно из указанных взаимодействий, находится в основной цепи полимера или/и, по меньшей мере, на одной боковой цепи нити полимера.

Однако, например, взаимодействие может поддерживаться посредством углеводородных цепей и дополнительных структурных единиц, посредством которых могут строиться Ван-дер-ваальсовы взаимодействия.

По отношению к ковалентно-обратимому взаимодействию, средипрочего, например, рассматривается связывание посредством дисульфидных мостиков или посредством нестабильных сложных эфиров или иминов, таких как основания Шиффа или енамины.

В другом варианте осуществления все полимеры или/и сополимеры, описанные выше, или их смеси могут также наноситься на носитель в недериватизованной форме постольку, поскольку обеспечивается то, что, как описано выше, они могут образовывать ковалентные или/и нековалентные взаимодействия, по меньшей мере, с одним материалом носителя.

Для дериватизации полимера, который наносится на носитель, могут использоваться стадии активирования и дериватизации, описанные ранее, возможно, с последующими стадиями поперечной сшивки, как описано в Международных заявках WO 00/32649 и WO 00/78825.

В указанном варианте осуществления, способ в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что перед ковалентным связыванием, по меньшей мере, двух различных групп с полимером, имеющим, по меньшей мере, две функциональные группы, которые являются одинаковыми или которые являются различными, указанный полимер наносится на носитель.

В другом конкретном варианте осуществления способа полимер, имеющий, по меньшей мере, две функциональные группы, которые являются одинаковыми или которые являются различными, также может получаться непосредственно путем полимеризации или поликонденсации, по меньшей мере, двух идентично или различно функционализированных мономеров.

При этом предпочтительно олефиновые ненасыщенные мономеры, которые предпочтительно содержат группы OH, необязательно замещенные амино группы, группы SH, группы OSO₃H, группы SO₃H, группы OPO₃H₂, группы PO₃H₂, группы PO₃HR, группы COOH и смеси двух или более из них, где R предпочтительно имеет значение алкильного радикала, могут полимеризоваться друг с другом в присутствии материала носителя, в соответствии с известными способами. Также мономеры могут содержать дополнительные полярные группы, например, -CN. Дополнительные пригодные для использования мономеры представляют собой, например, этиленимин, аллиламин или винилпирролидон.

Предпочтительно в качестве технологий полимеризации рассматриваются эмульсионная полимеризация, суспензионная полимеризация, дисперсионная полимеризация и преципитационная полимеризация, при этом полимеризация осуществляется в присутствии носителя или материала носителя. Полимеризация может инициироваться посредством обычных способов, например радикальных инициаторов, таких как азо-соединения или пероксиды, посредством катионных или анионных инициаторов или посредством излучения высокой энергии.

В одном из вариантов осуществления возможно осуществление полимеризации таким образом, что не имеет места реакция между создаваемыми полимерными цепями и поверхностью носителя. Предпочтительно указанный вариант осуществления используется, если в качестве, по меньшей мере, одного из двух мономеров применяется гидрофильный мономер, такой как этиленимин, аллиламин или винилпирролидон. В присутствии гидрофильного носителя, такого как силикагель, как правило, получаемый полимер прочно адсорбируется на поверхности носителя.

Для повышения стабильности носителя с нанесенным покрытием полимер также может поперечно сшиваться с носителем. Предпочтительно это достигается посредством нагрева, при этом функциональные группы полимера, адсорбированного сначала, взаимодействуют с носителем, соответственно, функциональные группы носителя взаимодействуют с полимером, при этом имеет место связывание.

Однако возможно также осуществление (со)полимеризации таким образом, что полимер непосредственно химически связывается на поверхности носителя. Указанный вариант осуществления является предпочтительным, если должны получаться особенно стабильные носители с нанесенными покрытиями. Для этого носитель может быть снабжен группами, которые взаимодействуют при условиях полимеризации с полимерными цепями, формируемыми на поверхности носителя. Однако возможно также, что функциональные группы полимера взаимодействуют с поверхностью носителя. Если в качестве материала носителя используется силикагель, например, силановые группы, которые присутствуют на поверхности силикагеля, могут принимать участие в полимеризации, по меньшей мере, двух функционализированных мономеров, при этом носитель и полимер связываются друг с другом. Возможно также, например, присоединение винилсиланов к поверхности носителей, винильные группы которого принимают участие в сополимеризации, по меньшей мере, двух идентично или различно функционализированных мономеров.

Для дополнительного увеличения стабильности сформированной неподвижной фазы полимеризация двух идентично или различно функционализированных мономеров также может осуществляться в присутствии одного или нескольких реагентов для поперечной сшивки. Реагенты для поперечной сшивки представляют собой, например, бифункциональные соединения, такие как дивинилбензол или этиленгликоль диакрилат.

Также, по меньшей мере, два идентично или различно функционализированных мономерных компонента, которые предпочтительно имеют группы, рассмотренные ранее, могут поликонденсироваться друг с другом в присутствии материала носителя в соответствии с известными способами.

При этом могут также применяться способы и реагенты на основе ONB-Cl, как описано в Международных заявках WO 00/32649 и WO 00/78825.

Предпочтительно полученные функционализированные поликонденсаты могут представлять собой тип полифенилена, сложного полиэфира, полиамида, простого полиэфира, полиэфир кетона, полиэфирсульфона, полиуретана или полисилоксилсилана. При этом типе реакций также могут получаться смешанные поликонденсаты. При этом поликонденсация может осуществляться в растворе, а также в расплаве.

Предпочтительно используются поликонденсаты типа сложного полиэфира. Для увеличения стабильности они могут дополнительно поперечно сшиваться посредством добавления дополнительных полифункциональных соединений, таких как многовалентные спирты, такие как триметилолпропан, пентаэритрол или сахар. Также возможна поперечная сшивка посредством полифункциональных изоцианатов, при условии, что указанные сложные полиэфиры имеют группы, которые взаимодействуют с изоцианатными группами. Например, сложные полиэфиры, содержащие гидроксильные группы, могут взаимодействовать с полиизоцианатами, при этом в них включаются сложный полиэфир/уретановые единицы.

Например, полученный материал носителя с нанесенным покрытием может выделяться посредством фильтрования реакционной смеси, которую получают при полимеризации или поликонденсации, и может очищаться посредством промывки соответствующим растворителем от частиц полимера или частиц от поликонденсации, которые не связаны на поверхности материала носителя.

Соответственно, способ в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что полимер, имеющий, по меньшей мере, две функциональных группы, которые являются одинаковыми или которые являются различными, непосредственно получается на носителе посредством полимеризации или поликонденсации, по меньшей мере, двух идентично или различно функционализированных мономеров.

Возможно также осуществление описанной ранее полимеризации, которая приводит к нанесению покрытия на носитель, аналогичной известной "технологии импринтинга", в присутствии субстрата, который должен распознаваться впоследствии. При разговорном использовании указанной методики для термина субстрат часто используется также термин шаблон.

Требования к указанной полимеризации заключаются в том, что мономеры, имеющие, по меньшей мере, два идентично или различно функционализированных мономера, уже имеют группы, способные к связыванию. При этом предпочтительно каждый из указанных мономеров имеет одну из указанных групп, при этом группы являются различными.

Однако также возможно нанесение мономеров, уже имеющих, по меньшей мере, две различных группы, способных к связыванию.

Предпочтительно полимеризация осуществляется в присутствии веществ, которые образуют поры.

Для осуществления полимеризации могут использоваться описанные выше методики полимеризации.

После отделения или отмывки субстрата с помощью соответствующих растворителей на стадии (ii) получается, по меньшей мере, один сорбент с предварительно сформированным пространством взаимодействия для субстрата.

Предпочтительно для указанного варианта осуществления мономеры, которые должны использоваться для полимеризации, выбираются таким образом, что полимер, который формируется на носителе, имеет каркас, настолько жесткий и настолько сильно поперечно сшитый, насколько это возможно, так что пространство взаимодействия является настолько стабильным, насколько это возможно. Так, предпочтительно в качестве, по меньшей мере, одного из функционализированных мономеров используются акриловая кислота, или метакриловая кислота, или их производные, или смеси, которые, как в целом известно, делают возможным получение полимеров или сополимеров с высокими температурами стеклования. Особенно пригодные для использования мономеры представляют собой, например, метакриловую кислоту и этиленгликоль диметакрилат.

Другой пример представляет собой полимеризацию метакриловой кислоты с гидроксиэтилакрилатом, при этом получают полимер, имеющий карбоксильные и гидроксильные группы, способные к связыванию.

Однако также возможно осуществление описанной выше поликонденсации, которое приводит к нанесению покрытия на носитель в присутствии субстрата, который должен распознаваться впоследствии, при этом в качестве мономеров используются такие соединения, которые уже имеют различные группы, способные к связыванию. Предпочтительно каждый мономер имеет одну из указанных групп, при этом группы являются различными.

Однако также возможно использование мономеров, которые уже имеют, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию.

После отделения или отмывки субстрата с помощью соответствующих растворителей на стадии (ii) получают, по меньшей мере, один сорбент с предварительно сформированным пространством взаимодействия для субстрата.

Соответственно, указанный вариант осуществления также отличается тем, что полимер получают непосредственно на носителе посредством полимеризации или поликонденсации, по меньшей мере, одного мономера, имеющего, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию, или, по меньшей мере, двух мономеров, имеющих, каждый, по меньшей мере, одну группу, способную к связыванию, при этом указанные группы являются различными, и полимеризация или поликонденсация имеет место в присутствии субстрата, который должен связываться впоследствии.

Предпочтительно в вариантах осуществления, в которых полимеризация или поликонденсация указанных мономеров непосредственно осуществляется в присутствии носителя, поликонденсация или полимеризация осуществляется в присутствии, по меньшей мере, второго или третьего мономера, не имеющего группы, способной к связыванию. При этом, по меньшей мере, один второй или третий мономер имеет функцию спейсера.

Не требуется обязательно, чтобы, по меньшей мере, две различные группы, необходимые для связывания, по меньшей мере, двухвалентного субстрата, по меньшей мере, с одним сорбентом, связывались с полимером. Возможна также непосредственная иммобилизация на стадии (ii) групп на поверхности носителя без использования полимера.

Предпочтительно иммобилизация осуществляется непосредственно на носителе, если указанный носитель создается из неорганического материала. Предпочтительно неорганические материалы представляют собой силикагель или окись алюминия.

Предпочтительно иммобилизация осуществляется посредством активирующих и/или силанизирующих реагентов. Связывание с поверхностью носителя может также осуществляться посредством использования спейсера.

Предпочтительно в качестве активирующих реагентов могут применяться реагенты, описанные в Международной заявке WO 00/32648.

Предпочтительно силанизирующие реагенты также включают в себя такие соединения кремния, которые могут осуществлять реакцию гидросилилирования.

Предпочтительно в качестве силанизирующих реагентов применяются галогенсиланы, предпочтительно хлорсиланы, алкоксисиланы и силазаны.

Здесь в одном из вариантов осуществления соединение, имеющее группу, необходимую для связывания субстрата, может сначала взаимодействовать с соответствующим соединением кремния. Впоследствии продукт может иммобилизовываться посредством гидроксильных групп, находящихся на поверхности, на носителе, при формировании ковалентной связи кислород/кремний. Например, алкильные радикалы, которые необязательно могут быть замещенными, например, амино, мочевинными, эфирными, амидными и карбаматными группами, могут как таковые иммобилизовываться на поверхности посредством использования алкилированных силанов.

Например, таким образом можно иммобилизовать на поверхности носителя 3-аминопропильный радикал посредством атома кремния. Затем амино группы могут дополнительно взаимодействовать, например, с хлорангидридами до амидов. Однако могут использоваться алифатические, а предпочтительно ароматические хлорангидриды, а также активированные компоненты, в частности ONB-активированные компоненты, как описано в Международных заявках WO 00/32649 и WO 00/78825.

Примеры соединений кремния, посредством которых алкильные радикалы могут наноситься на носитель, представляют собой метилтрихлорсилан и октилтрихлорсилан, посредством которых могут включаться алкильные радикалы с относительно короткой цепью, соответственно, со средней цепью, а также октадецилтрихлорсилан, докозилтрихлорсилан и триконтилтрихлорсилан, посредством которых могут включаться относительно длинные цепи. Например, вставка алкильного радикала, содержащего амино группу, является возможной с помощью 3-аминопропилтриэтоксисилана.

В дополнение к этому, возможно использование простых силилглицидиловых эфиров, которые после гидролиза образуют диолы, которые определяются также как диольные фазы.

С другой стороны, возможно также сначала взаимодействие поверхности носителя с соединением кремния, имеющим другую функциональную группу или несколько функциональных групп. Впоследствии группы, которые выбираются или определяются для связывания, которые должны иммобилизовываться на носителе, могут включаться посредством соответствующих соединений, посредством одной или нескольких функциональных групп.

Например, для нанесения на поверхность носителя могут использоваться соединения кремния, имеющие двойную связь. Группы, которые предназначаются для связывания, могут включаться посредством указанной двойной связи. Примеры соответствующих соединений кремния представляют собой винилсилан или (мет)акрилоксипропилтриметоксисилан.

Описанные способы могут также использоваться в сочетании.

Необязательно связывание групп, являющихся предназначенными для связывания, может также иметь место посредством спейсера, при этом предпочтительно между группой, которая должна иммобилизовываться, и носителем включается короткая углеродная цепь. Предпочтительно связывание носителя и группы, которая должна иммобилизовываться, может иметь место посредством соответствующих карбодиимидов, таких как дициклокарбодиимид, диизопропилкарбодиимид, N-циклогексил-N'-2-(N-метилморфолино)-этилкарбодиимид-п-толуол сульфонат, N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид, хлорформиаты, карбонил диимидазолы или диизоцианаты, такие как гексаметилендиизоцианат. Также могут использоваться гомотеломерные или гетеротеломерные полиэтиленгликоли.

При использовании спейсера предпочтительно создается фаза в форме гребня, в которой, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию, предпочтительно связываются либо на конце спейсера, и/либо латерально связываются на спейсере.

Соответственно, указанный вариант осуществления также отличается тем, что на стадии (ii), по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию со вторым субстратом, наносятся на носитель посредством реагента, который выбирается из группы, содержащей активирующие реагенты, силанизирующие реагенты и спейсер или смеси двух или более указанных реагентов.

Показано, что неблагоприятным для субстрат-специфичного связывания является нанесение сорбентов, имеющих, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию групп, которые описаны в литературе, то есть, так сказать, гидроксильные группы из каркаса силикагеля, соответственно, силановые группы и алкильные группы, которые включаются посредством силанизирующего реагента. Таким образом, сочетание групп гидроксила, силана и алкила, или гидроксила и алкила, или силикола и алкила исключается из настоящего изобретения, при том что эти группы иммобилизуются на силикагеле, соответственно.

Особенно пригодные для использования группы, в смысле настоящего изобретения, представляют собой, с другой стороны, такие группы, как фенильный, гидроксифенильный, карбоксильный, аминовый и амидный остаток, а также гидроксильный, индольный, имидазольный и гуанидиновый остаток. Предпочтительно указанные остатки связываются на поверхности носителя посредством спейсера, при формировании фазы в форме гребня.

Соответственно, особенно предпочтительный вариант осуществления отличается тем, что на стадии (ii), по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию со вторым субстратом, выбираются из группы, состоящей из фенильного, гидроксифенильного, карбоксильного, аминового, амидного, гидроксильного, индольного, имидазольного и гуанидинового остатков.

Предпочтительно, по меньшей мере, один сорбент, полученный с помощью предыдущих способов, может перерабатываться в соответствии с распространенными способами в фольгу, пленки, микротитровальные планшеты или наносферы. Предпочтительно, по меньшей мере, один сорбент со стадии (ii) получается и используется в наноформате.

Субстрат, который должен связываться, соответственно, субстрат, который должен селективно связываться из смеси субстратов, теперь приводится в контакт на стадии (iii), по меньшей мере, с одним сорбентом. При этом субстрат или смесь субстратов должна присутствовать в твердой фазе, жидкой фазе, или газообразной фазе, или также в смесях двух или более указанных фаз.

Предпочтительно субстрат, соответственно, смесь субстратов находится в жидкой фазе. При этом могут использоваться растворы, а также суспензии или дисперсии субстрата, соответственно, смеси субстратов. В качестве жидкостей могут использоваться как вода, так и органические растворители, смеси органических растворителей и смеси, содержащие воду и органические растворители. Во всех случаях буферы, соли, кислоты, основания или модификаторы, такие как ионпарные реагенты, могут присутствовать в жидкости при произвольной концентрации. Предпочтительно концентрация составляет от 10 ммоль до 2 моль на один литр жидкости. Предпочтительно субстрат, который должен связываться, присутствует в водной форме, например, как телесная жидкость.

Для исследования связывания, соответственно, поведения при связывании субстрата с сорбентом могут использоваться известные способы и методы. Предпочтительно связь между сорбентом и субстратом представляет собой нековалентную связь.

Предпочтительно взаимодействия, которые описаны выше, представляют собой нековалентные связи.

Однако возможно также, что, по меньшей мере, один субстрат является ковалентно-обратимо или ковалентно-необратимо связанным, по меньшей мере, с одним сорбентом.

Предпочтительно на стадии (iv) для исследования прочности связывания, по меньшей мере, одного второго субстрата, по меньшей мере, с одним сорбентом со стадии (iii) пригодными являются хроматографические методы и методы интерпретации. В частности, указанные методы представляют собой методы колоночной хроматографии, например известный метод ВЭЖХ. Для этого, по меньшей мере, один сорбент используется как неподвижная фаза колонки. Из последовательности элюируемых субстратов может непосредственно быть сделан вывод относительно прочности их связывания с соответствующим используемым сорбентом. Наиболее прочно связываемый субстрат элюируется как последний субстрат.

Возможно осуществление фронтального анализа, при котором разбавленные растворы смеси субстратов, которые должны разделяться, непрерывно наносятся на неподвижную фазу. Наиболее прочно связывающийся субстрат может быть отличен от субстратов, которые связываются менее прочно таким путем, поскольку последние выходят в элюате первыми.

Однако также могут осуществляться известные методики элюирования, в которых относительно концентрированные растворы смеси субстратов наносятся в головной части колонки, а затем элюируются с помощью элюента. Слабо связанные субстраты выходят в элюате первыми. Наиболее прочно связывающийся субстрат может в некоторых случаях также десорбироваться с сорбента посредством использования элюента, который элюирует сильнее.

Предпочтительно также может использоваться микрокалориметрия. Здесь измеряется теплота адсорбции, которая высвобождается во время связывания субстрата с сорбентом.

Другой метод, который может применяться преимущественно, представляет собой метод поверхностного плазмонного резонанса, в котором определяется резонансная частота возбуждаемых электронов, которая зависит от физических свойств барьерного слоя субстрата и сорбента и, таким образом, зависит также от прочности связывания.

Предпочтительно также может использоваться исследовательский метод флюоресцентного мечения, при этом субстраты, которые метятся флюоресцентным красителем, флюоресцируют только тогда, когда они взаимодействуют с комплементарным рецептором.

Другой способ представляет собой метод иммуноферментного анализа со связанными ферментами (Elisa), при котором, например, антигены, которые связываются с сорбентом, могут детектироваться посредством обработки иммунореагентами. Также пригодными для использования являются конкурентные и неконкурентные анализы, среди них анализы с использованием радиоактивности.

Соответственно, указанный вариант осуществления настоящего изобретения отличается тем, что на стадии (iv) для исследования прочности связывания субстрата с сорбентом используется способ, выбранный из группы, включающей в себя хроматографию, микрокалориметрию, поверхностный плазмонный резонанс, флюоресцентное мечение, конкурентные и неконкурентные анализы, включая анализ с использованием радиоактивности, и Elisa.

Из прочности связывания может быть получена информация о том, который из сорбентов, соответственно, какие из групп, являющихся нанесенными на него, являются ответственными за связывание субстрата. Таким образом, указанный метод делает возможным выделение, идентификацию и характеризацию указанного субстрата. Таким образом, является возможной проверка функции и свойств субстрата.

Соответственно, способ селективного связывания указанного субстрата также отличается тем, что он дополнительно включает в себя стадию (v):

(v) выделения, по меньшей мере, одного второго субстрата.

Кроме того, способ селективного связывания указанного субстрата также при этом отличается тем, что он дополнительно включает в себя стадию (vi):

(vi) характеризации и идентификации, по меньшей мере, одного второго субстрата.

В частности, сорбенты, полученные в соответствии с новым способом, являются пригодными для селективного связывания природных субстратов или природных агентов, а также синтетических агентов. Общим для указанных субстратов и агентов является то, что они имеют фармакофор, то есть пространственное расположение групп, образующих основу для биологического воздействия в живых организмах. Фармакофор присоединяет агент к карману связывания природного рецептора. Фармакофор присоединен к рамке, которая в литературе на английском языке также определяется как каркас.

Предпочтительно природные субстраты и агенты включают в себя аминокислоты, олигопептиды, нуклеотиды, нуклеозиды, белки, гликопротеины, антигены, антигенные детерминанты, антитела, углеводы, ферменты, коферменты, биокатализаторы, гормоны, алкалоиды, гликозиды, стероиды, витамины, метаболиты, вирусы, микроорганизмы, вещества, содержащиеся в растительных и животных тканях, клетки, фрагменты клеток, отделы клеток, остатки клеток, лектины, флавилиевые соединения, флавоны и изофлавоны.

В контексте настоящего изобретения особенный интерес представляет расщепление природных рецепторов и ферментов или других белков с фармакологической активностью для генерирования с их помощью коллекции сорбентов в соответствии с настоящим изобретением и использования указанных сорбентов в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительно указанные рецепторы представляют собой внутриклеточные или расположенные в мембране белки, которые могут связывать синтетические или природные агенты.

Внутриклеточные рецепторы могут быть получены из цитоплазмы и из ядра клетки. Такие рецепторы, соответственно, сорбенты, имеющие, по меньшей мере, две связывающие группы указанных рецепторов, могут использоваться для селективного связывания стероидных гормонов, таких как глюкокортикоиды, минералокортикоиды, андрогены, эстрогены, гестагены, гормоны витамина D, а также ретиноидов или тироидныхгормонов.

Рецепторы, расположенные в мембранах, группы которых могут наноситься на сорбенты в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой гуанин/нуклеотид/белок-связанные рецепторы, рецепторы ионных каналов и рецепторы, ассоциированные с ферментами.

В частности, для лекарственной терапии, в группе гуанин/нуклеотид/белок-связанных рецепторов находятся важные нейротрансмиттерные рецепторы, такие как адениновые рецепторы и адрэнергические рецепторы, рецепторы АТФ-(P2Y), допаминовые рецепторы, рецепторы GABA_B, (метаботропные) глутаматные рецепторы, гистаминовые рецепторы, мускариновые рецепторы, опиоидные рецепторы и серотониновые рецепторы. Также рецепторы гормонов и рецепторы медиаторов, например адиуретина, гликогена, соматостатина и простагландинов, находятся в указанной группе.

Рецепторы ионных каналов включают в себя рецепторы АТФ-(P2X), рецепторы GABA_B, (ионотропные) глутаматные рецепторы, глициновые рецепторы, рецепторы 5-HT₃ и никотиновые рецепторы.

Среди рецепторов, ассоциированных с ферментами, находятся рецепторы с активностью тирозинкиназы, рецепторы с ассоциированными тирозинкиназами, с активностью гуанилатциклазы и рецептор/серин/треонинкиназы.

Предпочтительно синтетические агенты включают в себя фармацевтические препараты и агенты для защиты растений.

Например, фармацевтические препараты представляют собой вещества, оказывающие воздействие на нервную систему (психотропные вещества, барбитураты, аналептики, анальгетики, местные и общие анестетики, мышечные релаксанты, антиконвульсанты, агенты против болезни Паркинсона, антиметики, ганглиально действующие агенты, симпатически действующие агенты, парасимпатически действующие агенты); оказывающие воздействие на гормональную систему (гормоны гипоталамуса, гипофиза, тироидные, паратироидные и почечные гормоны, тимические гормоны, агенты, воздействующие на эндокринную часть поджелудочной железы, надпочечников, гонад); оказывающие воздействие на медиаторы (гистамин, серотонин, эйкозаноиды, факторы, активирующие образование бляшек, кинины); имеющие воздействие на сердечно-сосудистую систему; оказывающие воздействие на дыхательные пути (антиастматики, средства против кашля, отхаркивающие, поверхностно-активные вещества); оказывающие воздействие на желудочно-кишечный тракт (переваривающие ферменты, ферменты, действующие на печень); оказывающие воздействие на почки и мочевыводящий тракт (диуретики); оказывающие воздействие на глаза (офтальмологические агенты); оказывающие воздействие на кожу (дерматотерапевтические агенты); вещества для профилактики и терапии инфекционных заболеваний (фармацевтические препараты с противобактериальным воздействием, антимикотические агенты, химиотерапевтические агенты для вирусных и протозойных заболеваний, агенты против гельминтов); оказывающие воздействие на злокачественные опухоли (антиметаболиты, цитостатики, ингибиторы топоизомеразы, ингибиторы митоза, антибиотики, имеющие цитостатическое воздействие, гормоны и антагонисты гормонов); оказывающие воздействие на иммунную систему, и вещества, оказывающие иммунологическое воздействие (сыворотки, иммуномодуляторы, иммуносуппрессанты).

Агенты для защиты растений представляют собой, например, инсектициды, гербициды, пестициды и фунгициды.

Примеры соединений и классов соединений синтетических агентов представляют собой фенотиазины и их аналоги, бутирофеноны и дифенилбутилпиперидины, бензамиды, бензодиазепины, гидрокситриптофаны, кофеины, амфетамины, опиоиды и морфины, фетидины и метадоны, производные салициловой кислоты и ацетилсалициловой кислоты, производные арилпропановой кислоты, производные антраниловой кислоты, производные анилина, производные пиразолов, сульфапиридины, гидроксихлорохин и хлоророхин, пеницилламин, N-метилированные барбитураты и тиобарбитураты, дипропилуксусные кислоты, гидантоины, допамины, норадреналин и адреналин, алкалоиды спорыньи, производные карбаминовой кислоты, сложные эфиры фосфорной кислоты, алкалоиды белладонны, гормоны гипоталамуса, гормоны HVL, гормоны гипофиза, тиоурацилы и меркаптоимидазолы, сульфонилмочевины, гистамины, триптаны, простагландины, дипирадимолы, гирудины и производные гирудина, тиазиды, псоралены, бензилпероксиды и азелаиновуюкислоту, витамин A, витамин K, витамин B₁, B₂, B₆, амид никотиновой кислоты, биотин, витамин B₁₂, витамин C, галогеновые соединения, альдегиды, спирты, фенолы, N-содержащие гетероциклы, пиретрины и пиретроиды, сложные эфиры фосфорной кислоты, сложные эфиры тиофосфорной кислоты, сложные эфиры карбаминовой кислоты, β-лактамы, аминогликозиды, тетрациклины, фторхинолоны, оксазолидиноны, диаминобензилпиримидины, пиразинамиды, гризеофульвин, азиридины, актиномицины, антрациклины, цитокины, моноклональные и поликлональные антитела. В дополнение к этому могут быть рассмотрены антигенные детерминанты, лектины, флавилиевые соединения, флавоны и изофлавоны, а также моносахариды и олигосахариды.

Синтетические агенты также могут быть получены посредством использования природных агентов. Кроме того, указанный термин включает в себя также потенциальные агенты, а также вещества, имеющие фармакофоры, а также рамку (каркас), к которому присоединены указанные фармакофоры.

Как уже рассматривалось в начале, в частности, новый способ селективного выделения указанного субстрата является пригодным для получения информации о том, может ли вообще произвольный субстрат взаимодействовать с природным рецептором. Наоборот, также возможно посредством использования, например, всех групп, важных для распознавания субстрата, создать библиотеки синтетических молекулярных областей, то есть эпитопов, части которых, каждая, содержат два, три или также более различных сайтов взаимодействия. Если, например, осуществляется контакт известного агента с указанными библиотеками синтетических рецепторов, получается вероятностная информация о типе сайта связывания на природном рецепторе.

Таким образом, в настоящем изобретении используется новый комплементарный принцип, включающий на стороне рецептора, соответственно, сорбент, а на стороне субстрата, по меньшей мере, два различных остатка от соединений или групп, соответственно, являющихся в соединениях ответственными за связывание. Предпочтительно при этом соединения выбираются из группы, включающей аминокислоты, сахара, нуклеотиды, нуклеозиды, пиримидиновые основания и пуриновые основания.

Однако из всех возможных сочетаний указанных двухвалентных молекулярных областей друг с другом только малый выбор является совместимо комплементарным, то есть благоприятным по энергии при их взаимодействии. Множество сочетаний является энергетически-неблагоприятным, например, все пары гидрофобных остатков, с одной стороны, и гидрофильные остатки, с другой стороны, или все остатки, которые отталкиваются друг от друга.

Например, совместимыми являются попарные сочетания групп, способных связывать OH/фенил с амино/алкильным остатком, но не OH/фенил с алкил/амино остатком, поскольку только гидрофильные OH и амино остатки, а также гидрофобные фенильный и алкильный остатки связываются друг с другом. Дополнительные совместимые сочетания представляют собой, например, карбоксил/амино с амино/карбоксильным остатком, а также имидазол/гидроксил с амид/амидным остатком. Несовместимым в смысле указанного рассмотрения является сочетание гидроксил/фенил с алкил/амино остатком, поскольку гидрофильный остаток не может связывать гидрофобный остаток.

Относительно двадцати природных аминокислот для дублетов компонентов, имеющих, каждый, по меньшей мере, одну группу, способную к связыванию, все они будут приводить, в целом, к 380 вариантам. Для библиотеки, содержащей исключительно значимые структурные варианты, однако, необходимо существенно меньше указанных синтетических дублетов компонентов, которые могут также определяться как дублетные рецепторы, поскольку в ряду аминокислот функциональность является одинаковой, например, для треонина и серина, для глутамина и аспарагина, для валина, изолейцина и лейцина, и тому подобное. По этой причине, как правило, предпочтительно является достаточным использование только не более семи из указанных двадцати аминокислот.

Поскольку подвижные присоединенные рецепторные группы в синтетическом рецепторе способны изменять их пространственные координаты в соответствии с требованиями субстрата, для цели желаемого связывания часто требуются не сами аминокислоты с их цепями различной длины, но только принцип, который является необходимым для взаимодействия. В этом смысле часто функции, например, аргинина, бетаина, триптофана и гистидина просто представляются амино группами, при условии, что необходима только функция основания.

Если, например, в смысле настоящего изобретения из семи аминокислот используются только четыре аминокислоты или принцип указанных аминокислот, просто 35 различных сочетаний дублетных рецепторов будет получено после пермутации.

Таким образом, другой целью настоящего изобретения является также комбинаторная библиотека, содержащая коллекцию сорбентов, имеющих, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию, по меньшей мере, одного субстрата, имеющего, каждый, по меньшей мере, две различные группы, при этом, по меньшей мере, две различные группы сорбентов, соответственно, и группы, по меньшей мере, одного субстрата являются комплементарными по отношению друг к другу.

Предпочтительно указанная комбинаторная библиотека отличается тем, что, по меньшей мере, две различные группы сорбентов и, по меньшей мере, две различные группы, по меньшей мере, одного субстрата выбираются среди групп, которые представляют собой части различных аминокислот, сахаров, нуклеотидов, нуклеозидов, пиримидиновых оснований или пуриновых оснований.

В другом варианте осуществления комбинаторная библиотека отличается тем, что получение сорбентов включает в себя стадии (i) и (ii):

(i) определения, по меньшей мере, двух различных групп, способных к связыванию первого синтетического или природного субстрата с сорбентом,

(ii) нанесения, по меньшей мере, двух различных групп, способных к связыванию второго синтетического или природного субстрата на носителе, при этом формируется, по меньшей мере, один сорбент, соответственно, при этом группы представляют собой группы, которые являются такими же, как группы со стадии (i), или являются комплементарными к группам со стадии (i), и второй субстрат на стадии (ii) является таким же субстратом, как субстрат в соответствии со стадией (ii), или является отличным от первого субстрата в соответствии со стадией (i).

Другой целью настоящего изобретения является также комплекс сорбент/субстрат, полученный при селективном выделении субстрата. Указанный комплекс сорбент/субстрат содержит, по меньшей мере, один сорбент, по меньшей мере, с двумя различными группами, способными к связыванию, и, по меньшей мере, один субстрат, имеющий, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию, при этом группы, способные к связыванию, по меньшей мере, одного сорбента, и группы, по меньшей мере, одного субстрата являются комплементарными по отношению друг к другу.

Предпочтительно, по меньшей мере, две различные группы, по меньшей мере, одного сорбента и, по меньшей мере, две различные группы, по меньшей мере, одного субстрата содержат различные группы, которые представляют собой части аминокислот, сахаров, нуклеотидов, нуклеозидов, пиримидиновых оснований или пуриновых оснований.

В комплексе сорбент/субстрат связывание между, по меньшей мере, одним сорбентом и субстратом существует в виде нековалентной, ковалентно-обратимой или ковалентно-необратимой связи. Предпочтительно связь является нековалентно обратимой.

Другой целью настоящего изобретения также является применение нового способа селективного связывания субстрата с сорбентами посредством, по меньшей мере, двухвалентных связей и применение комбинаторной библиотеки.

Возможность применения представляет собой детектирование взаимодействий рецептор/агент, а также скрининг агентов.

Предпочтительно для детектирования взаимодействий рецептор/агент, а также для скрининга агентов используются перечисленные выше агенты, соответственно, классы агентов.

Также для разработки новых кандидатов в агенты (веществ-лидеров), настоящее изобретение может использоваться преимущественно. Указанные вещества-лидеры могут оптимизироваться по отношению к их активности, селективности, биологической доступности, фармакокинетики и токсичности посредством использования нового способа, соответственно, комбинаторной библиотеки.

При этом предполагается также, что кандидаты в агенты взаимодействуют только с одной секцией биологического сайта связывания. Посредством сочетания и объединения, по меньшей мере, двух таких кандидатов в агенты, которые связывают, по меньшей мере, две секции биологического сайта связывания, можно просто находить новые агенты. Указанный поиск агентов также работает при использовании многократной параллельной реализации способа.

Другая возможность применения представляет собой разделение стереоизомерных соединений и соединений с изомерными структурами.

Кроме того, является возможной очистка и/или выделение субстратов и смесей субстратов.

Предпочтительно очистка и/или выделение осуществляется посредством хроматографических методов. Электрофорез, электрофокусирование, гель-электрофорез, гель-электрофорез в плоском слое, параллельная хроматография, параллельная флэш-хроматография и капиллярные методики могут рассматриваться как дополнительные способы, пригодные для использования. В случае достаточно высокой селективности субстрат также может непосредственно адсорбироваться из растворенной смеси посредством добавления сорбента, может перемешиваться и выделяться посредством фильтрования в форме комплекса сорбент/субстрат.

Дополнительные возможности применения представляют собой удаление вредных веществ и продуктов деградации из смесей веществ, при этом вещества также могут присутствовать при очень низких концентрациях.

Предпочтительно вредные вещества и продукты деградации могут выделяться из телесных жидкостей, таких как кровь. Например, указанные вредные вещества и продукты деградации существуют при интоксикациях, как продукты метаболизма или метаболиты. Они могут иметь биогенную природу или могут формироваться в самом организме, однако они могут и вводиться в указанный организм извне, например через кожу, через слизистую оболочку ротовой полости или посредством инъекции, например, в поток крови. Среди вредных веществ и продуктов деградации находятся также змеиные яды и интоксиканты.

Предпочтительно новые сорбенты могут применяться в устройствах для диализа.

Кроме того, возможно удаление вредных веществ из растворителей, из технологической воды и из процессов производства пищевых продуктов.

Посредством настоящего изобретения также могут осуществляться фармакокинетические исследования, в частности, метаболизации и биологической доступности.

Новый способ селективного связывания может также преимущественно использоваться для ограничения динамически комбинаторных библиотек. Для этого преимущественно из смеси, которая содержит, наряду со множеством извлекаемых продуктов, также желаемый субстрат, предпочтительно агент, последний выделяется в соответствии с настоящим изобретением. При этом в смеси повторно устанавливается равновесие при образовании дополнительного субстрата. Способ выделения повторяется до тех пор, пока дополнительный субстрат не перестанет формироваться.

Как обсуждается выше, новые способы используются для целенаправленного и селективного выделения субстрата из смеси, по меньшей мере, с одним дополнительным субстратом.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением термин селективное связывание имеет то значение, что субстрат отделяется от смеси, по меньшей мере, с одним дополнительным сопутствующим субстратом и что при этом субстрат, имеющий, по меньшей мере, две различные группы, образует более прочную связь, по меньшей мере, с двумя различными группами сорбента, чем сопутствующий субстрат.

С помощью настоящего изобретения впервые, среди прочего,сайт взаимодействия и тип взаимодействия являются точно определяемыми посредством следующих далее способов, как становится ясным с помощью примеров:

посредством целенаправленного включения сайтов связывания на рецепторе при желаемой концентрации и сочетании,

посредством исключения, добавления, изменения или блокирования индивидуальных сайтов связывания, как на рецепторе, так и также на исследуемых субстратах, при этом эффект на прочность связывания точно (= энергетически) определяется, соответственно,

посредством спектроскопических исследований и посредством определения изотерм адсорбции.

Например, посредством сравнения известных из литературы индивидуальных вкладов соответствующих нековалентных типов связывания может неожиданно хорошо предсказываться общее взаимодействие многовалентной связи. Если соответствующая энергия связи определяется в ожидаемом количестве, наоборот, являются возможными выводы относительно групп, которые участвуют в связи.

Таким образом, впервые селективность может создаваться целенаправленно, по отношению к произвольно выбранной проблеме разделения.

По отношению к целевому соединению (субстрату), который должен выделяться, новая концепция включает в себя конструирование проблемно-ориентированного нековалентного многовалентного взаимодействия, которое существенно отличается от нековалентных взаимодействий с конкурирующими субстратами (сопутствующими веществами).

Способы по настоящему изобретению демонстрируют высокие значения селективности разделения, которая также определяется просто как селективность. При этом селективность разделения α определяется как отношение соответствующих констант связывания, соответственно, коэффициентов емкости, для связи субстрата, который должен селективно выделяться, с сорбентом, и константы связи для связи сопутствующего субстрата с сорбентом.

Например, при отсутствии одной карбоксильной группы в субстрате селективность разделения достигает значения более чем 35. При замене ароматической системы с одним кольцом на систему с тремя кольцами получается значение 10.

С помощью нового способа при разделении в промышленных масштабах могут достигаться селективности, которые по сравнению с существующим уровнем техники являются неожиданно высокими и которые часто делают возможными разделения, которые до сих пор были хроматографически невозможными.

Предпочтительно селективность разделения α, посредством которой субстрат, который должен селективно связываться, имеющий, по меньшей мере, две группы, способные к связыванию, по меньшей мере, с одним сорбентом, выделяется из смеси субстратов посредством использования, по меньшей мере, одного сорбента, составляет более чем 1,4.

Предпочтительно селективность разделения α является большей чем 2, более предпочтительно большей чем 4, еще более предпочтительно большей чем 8.

Более предпочтительными являются селективности разделения, большие чем 10, еще более предпочтительными большие чем 35.

Кроме того, поскольку константа связи непосредственно коррелирует с определением энергии Гиббса, которая известна специалисту в данной области, получают также корреляцию между энергией Гиббса и селективностью разделения. Чем более отрицательным является изменение энергии Гиббса ΔG для нековалентной связи, тем сильнее развивается комплементарный характер связывания групп друг с другом, а также тем выше селективность разделения по отношению к сопутствующим веществам, которые посредством вставки групп, способных к связыванию (с целевыми веществами), не испытывают изменения энергии Гиббса (для указанных групп, соответственно, для сорбента).

Кроме того, для создания селективности по отношению к произвольной паре субстратов является достаточным дополнительное присоединение одной группы, способной к связыванию, к сорбенту, постольку, поскольку указанная группа не имеет комплементарного партнера для одного из обоих субстратов, которые должны выделяться.

Описанным способом детектируется также, существуют ли одновременно многие типы связей (то есть многовалентность) и какие именно. Указанная многовалентность, в частности получение заданных значений для констант связи и для энергии Гиббса, является, однако, возможным только тогда, если субстрат может, по меньшей мере, частично погружаться посредством индуцированного совпадения в рецептор или сам конформационно адаптироваться к нему.

Указанная адаптация предпочтительно возможна с помощью полимерной сетки, при этом степень поперечной сшивки полимерной нанопленки выбирается таким образом, чтобы по-прежнему получалась достаточная конформационная подвижность, а вместе с ней и способность к адаптации к структуре субстрата. Предпочтительно малые субстраты с молярными массами ниже 1000 Дальтон полностью погружаются в полимерную сетку. Предпочтительно субстраты больших размеров, такие как пептиды или белки, связываются с ограниченным участком контакта, при углублении в полимерную сетку, которое делает возможным многовалентное взаимодействие, однако предотвращает слишком прочное связывание посредством включения.

Для реализации концепции конструирования селективных многовалентных сайтов связывания часто необходимо сделать требуемые сайты связывания конформационно подвижными в пространстве. Кроме того, необходимо создать тенденцию к достаточно прочному связыванию посредством субстрата для достижения конформационной адаптации (индуцированного совпадения). Последние, но не по важности, по меньшей мере, два необходимых сайта взаимодействия должны предварительно организовываться в пространстве при высокой концентрации для реализации желаемого события связывания на основе изменения конформации в большом количестве.

Настоящее изобретение иллюстрируется с помощью следующих далее примеров.

Пример 1: Селективное связывание N-блокированных аминокислот в качестве субстратов с сорбентами на основе поливиниламина/силикагеля посредством, по меньшей мере, двухвалентных связей

Свойства удерживания восьми различных производных аминокислот (субстратов в таблице 1) исследуют на четырех различных сорбентах на основе поливиниламина/силикагеля (сорбенты в таблице 2), при этом в качестве способа исследования выбирают хроматографию. В последующем сорбенты также определяются как неподвижные фазы, синтетические рецепторы также определяются как рецепторы, также в других примерах.

Производные аминокислот представляют собой производные глутамина (1-4) и глутамата (5-8), у которых амино группы блокированы четырьмя различными защитными группами, ацетилом (Ac), трет-бутилоксикарбонилом (Boc), бензилоксикарбонилом (Z) и флуоренил-метоксикарбонилом (Fmoc), соответственно.

Таблица 1 Используемые субстраты
производные глутамина	производные глутамата	N-защитная группа
Ac-Gln	1	Ac-Glu	5	Ac
Boc-Gln	2	Boc-Glu	6	Boc
Z-Gln	3	Z-Glu	7	Z
Fmoc-Gln	4	Fmoc-Glu	8	Fmoc

Используемые фазы рецепторов представляют собой сферический силикагель с покрытием из поливиниламина с размером частиц 20 мкм и диаметром пор 1000 Е. В ходе способа нанесения покрытия сначала получают амино фазу A. Дериватизованные фазы рецепторов B-D синтезируют из амино фазы A посредством твердофазного синтеза в соответствии с известными способами.

Таблица 2 Структура используемых фаз рецепторов
Наименование фазы	Состав фазы	Структура фазы
A BV 02043	K1000-PVA-FA-2-5-Dod амино фаза
B ND 03001#2	K1000-PVA-FA-2-5-Dod-Ac-100 ацетиловая фаза
C ND 02031	K1000-PVA-FA-2-10-Dod-MVS-100 4-метилвалериловая фаза
D ND 03017	K1000-PVA-FA-2-5-Dod-BzlO-100 бензилоксикарбонильная фаза

Все фазы рецепторов имеют измеряемое содержание свободных амино групп, которые могут подвергаться ионным взаимодействиям в протонированном состоянии с соответствующими анионными группами субстрата, например с карбоксилатными группами. В дополнение к этому, рецепторы C и D содержат остаток, пригодный для липофильных взаимодействий.

Содержание амино групп рецепторов определяют по хроматографическим кривым прохождения с помощью 10 мМ 4-толуолсульфоновой кислоты в ДМФ. Определенные количества амино групп на грамм фазы рецептора приведены в таблице 3.

Таблица 3 Содержание амино групп в фазах рецепторов
синтетический рецептор	амино группы, в ммоль/г
A	BV 02043	0,60
B	ND 03001#2	0,03
C	ND 02031	0,13
D	ND 03017	0,16

Для хроматографических исследований на субстратах 1-8 водный трис-HCl-буфер, имеющий pH 7,5, используют в качестве подвижной фазы. Элюирование осуществляют при изократических условиях, при концентрациях буфера от 10 до 500 мМ.

В качестве меры силы взаимодействия между субстратом и рецептором в соответствующих буферных растворах, используют приборно-независимый коэффициент элюирования k' (коэффициент емкости). Он может быть вычислен по разности объема элюирования на максимуме пика и мертвого объема колонки, деленной на мертвый объем колонки, как иллюстрирует следующее уравнение:

Значения k' субстратов в 10 ммоль, соответственно, 50 ммоль трис-HCl-буфере, приведены в таблицах 4 и 5.

Таблица 4 Значения k' субстратов в 10 ммоль трис-HCl-буфере (pH 7,5)
рецептор	значение k' относительного элюирования субстратов
	Ac	Boc	Z	Fmoc
1	5	2	6	3	7	4	8
A	9,5	433	8,8	411	15	>715	85	>715
B	0,1	0,2	0,1	0,3	0,3	0,3	0,2	1,6
C	1,3	25,7	3,6	127	12,5	575	419	>715
D	1,4	26,1	2,1	41,9	9,7	263	297	>715

Таблица 5 Значения k' субстратов в 50 ммоль трис-HCl-буфере (pH 7,5)
рецептор	значение k' относительного элюирования субстратов
	Ac	Boc	Z	Fmoc
1	5	2	6	3	7	4	8
A	2,3	33,2	2,2	34,4	3,6	62,9	20,3	478
B	0	0	0	0	0	0,1	0,2	0,2
C	0,2	2,3	0,9	9,9	3,4	37,6	111	562
D	0,3	2,6	0,5	5,0	2,5	20	78,4	>715

Сравнение значений k' в таблицах 4 и 5 и между ними дает следующие наблюдения и интерпретации наблюдений:

1.Наблюдение: Фаза ацетилированного рецептора B (ND 03001#2) не связывает в заметном количестве, даже при самой низкой концентрации буфера, ни один из субстратов (k' ≤ 1,6).

Интерпретация наблюдения: Указанный рецептор содержит только очень немного амино групп для возможных ионных взаимодействий с карбоксилатными группами субстратов. Ни ацетильные группы, ни поливиниламиновые цепи фазы рецептора не способны подвергаться значимым липофильным взаимодействиям.

2.Наблюдение: В 10 ммоль буфере субстраты с двумя карбоксилатными группами (5-8) связываются с коэффициентом, приблизительно в 20-40 раз большим, чем соответствующие субстраты только с одной карбоксилатной группой (1-4). В 50 ммоль буфере связывание дикарбоксилатов по-прежнему является более прочным, в 10-25 раз, чем связывание монокарбоксилатов.

Интерпретация наблюдения: Очевидно, имеются ионные взаимодействия между карбоксилатными группами субстратов и амино группами рецепторов. Основываясь на двухвалентности взаимодействия, для дикарбоксилатов указанные взаимодействия приводят к гораздо более прочной связи, чем для субстратов только с одной карбоксильной группой. В водной среде амидная группа не вносит заметного вклада в связь.

3.Наблюдение: При увеличении концентрации буфера от 10 до 50 ммоль прочность связывания уменьшается для монокарбоксилатов приблизительно в четыре раза, для дикарбоксилатов приблизительно в десть раз.

Интерпретация наблюдения: Этот результат также может объясняться ионными взаимодействиями, которые ослабляются при более высокой концентрации буфера. Разумеется, ослабление возникает из-за конкуренции буферных солей с карбоксилатными группами субстратов за аммониевые группы рецептора. В случае прочного связывания субстратов 5-8 конкуренция буферных солей имеет более сильное воздействие, поскольку ей подвергаются две карбоксилатные группы.

4.Наблюдение: Для идентичных в остальном субстратов значения k' резко увеличиваются с размером органического остатка N-защитной группы. Величина указанного увеличения связывания не зависит от концентрации буфера.

Интерпретация наблюдения: При этом показано, что наряду с ионными взаимодействиями между карбоксилатными группами субстратов и аммониевыми группами рецепторов присутствуют дополнительные липофильные взаимодействия между субстратом и рецептором. Таким образом, при переходе от малых к большим органическим остаткам в N-защитной группе, в частности, усиление связывания оказывает воздействие на фазы рецептора C и D, у которых рецепторные группы являются особенно пригодными для липофильных взаимодействий.

Вывод: С помощью экспериментов, описанных выше, может быть четко показано, что синтетические рецепторы одновременно могут подвергаться двум или трем взаимодействиям связывания с соответствующими субстратами, при условии, что рецептор и субстрат являются комплементарными по отношению к их функциональным группам.

Следовательно, можно сделать вывод, что посредством конструирования рецептора, который является соответствующим образом комплементарным к целевому веществу, сопутствующие вещества или побочные продукты могут легко отделяться. Мерой реализации разделения является отношение значений k', селективность альфа, которая определяется по следующей формуле:

Селективность: альфа = k₂'/k₁'

Например, альфа составляетприблизительно 25 (263/9,7), с бензил/амино рецепторной фазой D, для хроматографического разделения Z-Gln (3) и Z-Glu (7), с 10 ммоль трис-HCl-буфером (pH 7,5) в качестве подвижной фазы.

Тем самым можно показать, что существует количественная корреляция между соответствующими целенаправленно вставленными остатками молекул и прочностями связывания.

Пример 2: Связывание флаванона нарингенина в качестве субстрата с фазами рецепторов компании instrAction посредством, по меньшей мере, двухвалентных связей

Взаимодействие между нарингенином (фигура 1) и семью различными фазами рецепторов компании instrAction (таблицы 6 и 7) измеряют в ацетонитриле в качестве растворителя. Для указанных измерений используют непосредственный способ определения равновесия в так называемом "эксперименте в перемешиваемом химическом стакане".

Фигура 1 Нарингенин

Таблица 6 Используемые неподвижные фазы
фаза рецептора	состав фазы	амино группы в ммоль/г
A BV 02051	K1000-PVA-FA-2-5-Dod	0,54
C ND 02048#2	K1000-PVA-FA-2-5-Dod-MVS-100	0,16
D ND 03017#3	Kl000-PVA-FA-2-5-Dod-BzlO-100	0,10
E ND 03033#2	K1000-PVA-FA-2-5-Dod-ImAc-100	0,53
F ND 03049	K1000-PVA-FA-2-5-Dod-Acrid9Car-100	0,29
G ND 03050	K1000-PVA-FA-2-5-Dod-NaphCar-100	0,23
H ND 03062	K1000-PVA-FA-2-5-Dod-iNic-100	0,35

Для экспериментов в перемешиваемом химическом стакане точно взвешенные количества фазы рецептора (каждая приблизительно 100-300 мг) суспендируют в точно отмеренных объемах растворителя (15 мл). К этим суспензиям частями добавляют точно отмеренные количества нарингенина (например 1,0 мл 10 ммоль раствора в ацетонитриле). Нарингенин распределяется между фазой рецептора и растворителем при установлении динамического равновесия.

Состояние равновесия может точно определяться посредством определения концентрации нарингенина в растворителе посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Из нее непосредственно получают количество вещества нарингенина в жидкой фазе (ацетонитриле). Количество вещества нарингенина в фазе рецептора вычисляют как разницу между добавленным нарингенином и нарингенином в растворе. В каждом эксперименте с перемешиваемым химическим стаканом равновесие определяют многократно (6-12 раз) при увеличении концентрации нарингенина в системе. Для полученного количества нарингенина и добавленного растворителя, а также для удаленного вещества тщательно определяют баланс и принимают его во внимание при вычислении количеств вещества.

Таблица 7 Производные неподвижной фазы
Наименование	Сокращенное наименование	Структура
группа 4-метилвалериновой кислоты	MVS
бензилоксикарбонильная группа	BzlO
группа 4-имидазолилуксусной кислоты	ImAc
группа акридин-9-карбоновой кислоты	Acrid9Car
группа 2-нафтилкарбоновой кислоты	Naphcar
группа изоникотиновой кислоты	iNic

Для каждого установления равновесия получают одну точку на изотерме адсорбции (графике зависимости связанного с рецептором нарингенина [RS] от нарингенина в растворе [S]). Посредством использования модели Ленгмюра для изотерм адсорбции константы равновесия для ассоциации (K_A) и максимальной нагрузки [R₀] вычисляют посредством нелинейной регрессии.

Изотерма Ленгмюра: [RS] = [R₀]×[S]/(1/K_A+[S])

Для особенно слабых взаимодействий способ нелинейной регрессии не работает. В указанных обстоятельствах K_A и R₀ определяют посредством линейной регрессии по диаграмме Скатчарда (график зависимости [RS]/[S] от [RS]).

В графике Скатчарда простые изотермы Ленгмюра представляют собой прямые линии:

Линеаризация Скатчарда: [RS]/[S] = -K_A × [RS] + K_A × [R₀]

Важным преимуществом графика Скатчарда является то, что отклонения от линейности легко можно обнаружить. Такие отклонения могут указывать на фазы рецепторов, одновременно имеющие сайты связывания с различными прочностями связывания и количествами связей.

Значения константы ассоциации K_A и максимальной нагрузки R₀ приведены в таблице 8:

Таблица 8 Константа ассоциации KA и максимальная нагрузка R0
фаза рецептора	производное	Взаимодействие
		прочное	слабое
KA2	R02	KA1	R01
A BV 02051	100% амино групп	2121	14,7	931	22,1
C ND 02048#2	MVS-100	1302	48,4	760	66,3
D ND 03017#3	BzlO-100	-	-	329	29,2
E ND 03033#2	ImAc-100	6194	4,9	-	-
F ND 03049	Acrid9Car-100	2961	19,5	65	243
G ND 03050	NaphCar-100	1943	38,5	379	91
H ND 03062	iNic-100	-	-	778	21,7

Наблюдения и интерпретация наблюдений: За счет своих фенольных гидроксильных групп нарингенин может участвовать в полярных взаимодействиях с первичными амино группами амино фазы A. В апротонном растворителе ацетонитриле указанные взаимодействия могут легко измеряться. Существование сайтов прочного (K_A2) и слабого связывания (K_A1) может интерпретироваться таким образом, что нарингенин, разумеется, имеет возможность образовывать одновалентные, двухвалентные и трехвалентные полярные связи, в соответствии с тремя имеющимися фенольными группами.

В фазах рецепторов C, D и G большинство первичных амино групп фазы A дериватизованы липофильными остатками. Если бы указанные остатки не вносили вклад в связывание нарингенина, нагрузки R₀ указанных фаз уменьшались бы в соответствии с более низким содержанием амино групп. Константы равновесия должны оставаться приблизительно такими же, поскольку тип взаимодействия по-прежнему не менялся бы. На самом деле, нагрузки частично четко увеличиваются, например, от 14,7 до 38,5 ммоль/г фазы для нафтоил-дериватизованного рецептора (фазы рецепторов A и G). Указанный результат может объясняться только дополнительными взаимодействиями между нарингенином и дериватизационными группами. Указанные свободные группы рецепторов являются, как общая особенность, способными подвергаться липофильным взаимодействиям. Со своей стороны, нарингенин также имеет липофильные части молекулы для участия в таких взаимодействиях.

Из этого следует, что нарингенин мог бы одновременно реализовывать полярные связи с фазами рецепторов C, D и G, то есть с остающимися по-прежнему амино группами, и липофильные связи с группами рецепторов MVS, BzlO, соответственно, NaphCar. Замечательным является то обстоятельство, что указанные липофильные связи могли бы наблюдаться в органическом растворителе (ацетонитриле). Это означает, что между нарингенином и липофильными рецепторными группами имеют место контакты, которые конкурируют по энергии с сольватацией липофильной группы c органическим растворителем.

По этой причине константы ассоциации K_A с фазами рецепторов C, D и G состоят из вкладов полярных и липофильных связей. При этом константы ассоциации здесь являются более низкими, чем для амино фазы A. Разумеется, липофильные связи слабее, чем полярные связи, что, в свою очередь, может быть приписано используемому относительно полярному органическому растворителю (ацетонитрилу).

Фазы рецепторов E, F и H содержат рецепторные группы, которые могут принимать участие как в липофильных, так и полярных связях - все три содержат амино группы, являющиеся погруженными в частично растянутые ароматические структуры. На самом деле, оба самых высоких значения K_A могут быть обнаружены для фаз рецепторов E и F. Можно предположить, что здесь кооперативное совместное действие вкладов полярных и липофильных связей являются особенно благоприятным, в то время как в рецепторах C, D и G липофильные рецепторные группы включаются за счет амино групп.

Результат: В настоящем примере показано, что в одном растворителе субстрат (нарингенин) может иметь различные связи по отношению к соответствующим фазам рецепторов. При правильном выборе рецепторных групп в неподвижной фазе полярные и липофильные взаимодействия для связывания субстрата могут активироваться одновременно. Соответственно, могут синтезироваться фазы рецепторов, которые оптимизируются для связывания конкретных субстратов или групп субстратов, поскольку различные возможности для связывания представлены одновременно, и тем самым создаются селективные пространства взаимодействия.

Пример 3: Связывание структурно родственных производных бензола в качестве субстратов с фазой рецептора компании instrAction посредством, по меньшей мере, двухвалентных связей

Взаимодействие между структурно родственными производными бензола и фазой рецептора C instrAction (ND 02048#2, K1000-PVA-FA-2-4-Dod-MVS-100) измеряют в смеси неполярных органических растворителей. Наряду с группами 4-метилвалериновой кислоты (MVS), фаза рецептора C содержит также 0,16 ммоль/г амино групп. Растворитель представляет собой смесь простого метил-трет-бутилового эфира/гептана (1 часть/3 части объемных). В указанной смеси неполярных растворителей, с одной стороны, должны ожидаться преимущественно полярные взаимодействия, а с другой стороны, все исследуемые вещества в ней хорошо растворимы.

Константы ассоциации (K_A) и максимальная нагрузка (R₀) для взаимодействия между фазой рецептора и исследуемыми веществами определяются в так называемых "экспериментах в перемешиваемом химическом стакане".

Для экспериментов в перемешиваемом химическом стакане точно взвешенные количества фазы рецептора (каждое приблизительно 200-350 мг) суспендируются в точно отмеренных объемах растворителя (15 мл). К указанной суспензии по частям добавляют точно отмеренные количества субстрата. Субстрат, который должен исследоваться, распределяется между фазой рецептора и растворителем при установлении динамического равновесия. Состояние равновесия может точно определяться посредством определения концентрации субстрата в растворителе с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Здесь непосредственно получают количество вещества на субстрате в растворителе. Количество субстрата для субстрата на фазе рецептора вычисляют как разницу между добавленным субстратом и субстратом в растворе. Для каждого эксперимента в перемешиваемом химическом стакане равновесие определяют многократно (6-12 раз) при увеличении концентрации субстрата в системе. Точно составляют баланс для добавленного субстрата и растворителя, а также для удаленного вещества и принимают во внимание при вычислении количеств вещества.

Для каждого установления равновесия получают одну точку на изотерме адсорбции (графике зависимости связанного с рецептором субстрата [RS] от субстрата в растворе [S]). Посредством использования модели Ленгмюра для изотермы адсорбции константу равновесия для ассоциации (K_A) и максимальную нагрузку [R₀] вычисляют посредством нелинейной регрессии.

Изотерма Ленгмюра: [RS] = [R₀] × [S]/(1/K_A + [S])

Способ нелинейной регрессии не работает для особенно слабых взаимодействий. В указанных случаях K_A и R₀ определяют посредством линейной регрессии по диаграмме Скатчарда (график зависимости [RS]/[S] от [RS]).

На графике Скатчарда, простые изотермы Ленгмюра представляют собой прямые линии:

Линеаризация Скатчарда: [RS]/[S]= -K_A × [RS] + K_A × [R₀]

В таблице 9 полученные параметры взаимодействия K_A и R₀ представлены вместе с исследуемыми субстратами:

Таблица 9 Используемые исследуемые вещества и результаты связывания
Наименование субстрата	структура субстрата	KA в л/моль R0 в мкмоль/г фазы
4-амино-3-нитробензонитрил		17700 ± 2600 3,5 ± 0,3
3-нитробензонитрил		405 ± 109 12,9 ± 2,4
4-аминобензонитрил		991 ± 59 19,6 ± 0,7
бензонитрил		27 ± 14 точно не измеряется
нитробензол		Ниже предела измерений для используемой системы

Наблюдения результатов: Из таблицы 9 видно, что прочность взаимодействия между исследуемым веществом и фазой рецептора, которая представлена константой ассоциации K_A, увеличивается с количеством заместителей на бензольном кольце.

Бензольные кольца только с одним заместителем имеют константы ассоциации ниже 40 л/моль, значения, находящиеся на границе измеряемости в описываемой системе измерений.

Второй заместитель на бензольном кольце вносит вклад в дополнительную возможность взаимодействия для исследуемой молекулы. Оба слабых взаимодействия взаимодействуют и дают константы ассоциации для замещенных производных бензола, которые приблизительно представляют собой произведение констант ассоциации монозамещенных бензолов. Соответственно, получают значения K_A от 400 до 1000 л/моль.

Третий заместитель на бензольном кольце умножает константу ассоциации дизамещенного бензола на свой относительно слабый потенциал взаимодействия (K_A ˜ 20-40 л/моль), и для бензола с тремя заместителями получают константу ассоциации 17722 л/моль.

На фигуре 2 представлена диаграмма Скатчарда для 4-амино-3-нитробензонитрила.

Фигура 2: диаграмма Скатчарда для различных концентраций субстрата [S] 4-амино-3-нитробензонитрила

Здесь a, b и c имеют следующие значения:

a: область трехвалентных взаимодействий

[S] = 0,0044-0,043 ммоль

K_A3 = 17722 л/моль

R₀₃ = 3,5 мкмоль/г фазы

b: переходная область трехвалентных и двухвалентных связей

[S] = 0,086-0,30 ммоль

K_A2 = 2350 л/моль

R₀₂ = 16 мкмоль/г фазы

c: область двухвалентных взаимодействий

[S] = 0,40-0,98 ммоль

K_A1 = 855 л/моль

R₀₁ = 33 мкмоль/г фазы

Из изотермы Ленгмюра не только получают силу взаимодействия в форме константы ассоциации K_A, но также и количество сайтов взаимодействия как максимальную нагрузку R₀. Максимальная нагрузка для трехвалентного взаимодействия приблизительно в пять раз ниже, чем R₀ для двухвалентного взаимодействия. Это понятно непосредственно, поскольку можно предположить, что в синтетической фазе рецептора присутствует меньше сайтов связывания для трех одновременных взаимодействий по сравнению с двумя или даже с одним взаимодействием. В дополнение к трехвалентным сайтам связывания, 4-амино-3-нитробензонитрил может также занимать двухвалентные и даже одновалентные сайты связывания разумеется, с соответственно более низкими прочностями связывания (K_A) и более высокими максимальными нагрузками (R₀).

Указанное обстоятельство иллюстрируется на фигуре 2. Если параметры K_A и R₀ определяют при очень низких концентрациях субстрата, тогда преимущественно наблюдают сильное трехвалентное взаимодействие (K_A3 и R₃). Более слабые одновалентные и двухвалентные сайты связывания не являются заметно занятыми из таких разбавленных растворов. Если определяют K_A и R₀ при более высоких концентрациях субстрата, получают значения взаимодействия более слабых и более многочисленных двухвалентных сайтов связывания (например, K_A1 и R₀₁). Для этих концентраций субстрата сайты прочного связывания уже насыщены и обеспечивают только постоянный вклад в изотерму адсорбции. Одновалентные взаимодействия не иллюстрируются на фигуре 2.

Как правило, на диаграмме Скатчарда искривленный ход изотермы с увеличением слева говорит об одновременном присутствии сайтов связывания с различной прочностью.

Результат: С помощью представленных экспериментальных результатов можно показать, что фаза рецептора C (структура K1000-PVA-FA-2-5-Dod-MVS-100) может подвергаться как сильным трехвалентным, так и также более слабым одновалентным и двухвалентным взаимодействиям с 3-амино-4-нитробензонитрилом.

По отношению к субстратам с меньшим количеством заместителей та же фаза рецептора ведет себя соответствующим образом, то есть максимальная прочность связывания взаимосвязана с количеством заместителей на молекуле субстрата.

Более того, прочность связи может подвергаться влиянию зависимого от заместителей изменения постоянных и индуцированных диполей молекулы субстрата.

Пример 4: Связывание стероидов в качестве субстратов с фазами рецепторов компании instrAction посредством, по меньшей мере, двухвалентных связей

Связывание (удерживание) эстрадиола и тестостерона с фазой рецептора A (SBV 01044 VD/4 в колонке PV 02007), которая содержит только амино группы, и с фазой C (ND 02001/1 в колонке PV 02001), которая дериватизована разветвленными алкильными группами (4-метилвалериновой кислоты) на уровне 27%, определяют посредством градиентной ВЭЖХ.

Для градиентной ВЭЖХ используют следующие условия:

Нейтральные элюенты:

Элюент A: 1 часть диметилформамида + 9 частей воды (части объемные)

Элюент B: диметилформамид

Кислотные элюенты:

Элюент A: 10 ммоль трифторуксусной кислоты (TFA) в 1 части диметилформамида + 9 частей воды (части объемные)

Элюент B: 10 ммоль трифторуксусной кислоты в диметилформамиде

Профиль градиента: Постоянный элюент A со скоростью потока 0,2 мл/мин, в течение пяти минут; затем добавление B при 2%/мин, при 0,6 мл/мин, до полного элюирования вещества.

В градиенте соответствующее вещество будет элюироваться, если энергия Гиббса для метода растворителя в подвижной фазе начнет превосходить энергию связи рецептор/субстрат. Также энергия Гиббса ΔG взаимодействия рецептора/растворителя влияет на баланс энергии: как правило, энтропия ΔS уменьшается из-за увеличения количества адсорбированных более мелких молекул растворителя, а энтальпия взаимодействия ΔH является умеренно отрицательной.

Для фазы рецептора соответствующей композиции во время связывания (адсорбции) субстрата энтальпия взаимодействия ΔH адсорбции растворителя является значительно менее отрицательной, чем вклад энтальпии многовалентного взаимодействия ΔH между рецептором и субстратом.

Поскольку исследуемые вещества плохо растворяются в воде и хорошо растворяются в ДМФ, содержание ДМФ в подвижной фазе, являющееся необходимым для элюирования, представляет собой грубую меру, которая, однако, может просто определяться для быстрого сравнения прочности связывания нескольких субстратов по отношению к рецептору.

Ожидается, что как эстрадиол, так и тестостерон могут подвергаться липофильным взаимодействиям с фазами рецепторов, кроме того, эстрадиол должен быть способен к образованию ионоподобной связи фенол/амин. Кроме того, группа 4-метилвалериновой кислоты, существующая в фазе рецептора C (ND 02001/1 в колонке PV 02001), должна значительно упрочить часть липофильной связи по сравнению с амино фазой A.

Предсказывается, что в противоположность к тестостерону эстрадиол может подвергаться двухвалентной связи с ионной и липофильной частью. В этом случае эстрадиол должен элюироваться значительно позже, чем тестостерон, с фазы рецептора C в используемом градиенте растворителя. Для фазы A, с другой стороны, всегда должны ожидаться заметно более короткие времена удерживания, а также меньшие различия в элюационном поведении тестостерона и эстрадиола.

В таблице 10 указывается содержание ДМФ в подвижной фазе, которое необходимо для разрыва связи рецептор/субстрат.

Таблица 10 Градиентное элюирование эстрадиола и тестостерона
субстрат	градиент вода/ДМФ	градиент 10 ммоль TFA в воде/ДМФ
амино фаза A PV 02007	фаза рецептора C PV 02001	амино фаза A PV 02007	фаза рецептора C PV 02001
эстрадиол	13,1%	46,7%	11,3%	36,6%
тестостерон	10,0%	18,5%	10,0%	27,3%

1. Наблюдение: Результаты показывают, что эстрадиол связывается прочнее, чем тестостерон, уже в амино фазе A (PV 02007), что может быть приписано дополнительному ионному взаимодействию. На алкилированной фазе C (PV 02001) эстрадиол не элюируется до тех пор, пока концентрация ДМФ не достигнет 47,7%, что по сравнению с основной фазой представляет собой увеличение на 33,6 частей объемных. Относительно элюирующей способности ДМФ указанный результат соответствует резкому увеличению связывания. С другой стороны, связывание тестостерона умеренно увеличивается до 18,5% ДМФ.

2.Наблюдение: Как можно ожидать, связывание эстрадиола уменьшается, если его возможность ионного взаимодействия по большей части устраняется посредством протонирования амино группы на неподвижной фазе, в то время как к подвижной фазе добавляется 10 ммоль трифторуксусной кислоты.

С другой стороны, связывание тестостерона умеренно усиливается в кислотной среде по отношению к фазе C и остается неизменным по отношению к фазе A. Для обоих субстратов предполагается, что амино группы рецепторов, которые создаются в элюенте, благодаря трифторуксусной кислоте, подвергаются дополнительным взаимодействиям, которые недоступны для амина.

Всегда поразительно, что усиление связывания на фазе рецептора является значительно более высоким, если используют два различных типа нековалентного взаимодействия. Усиление связывания посредством только увеличения области липофильного контакта алифатических частей молекулы развивается слабо.

Кроме того, указанные результаты поддерживаются сравнением удерживания характерных структурных элементов молекулы эстрадиола. Для таких молекулярных зондов всесторонние исследования ВЭЖХ могут быть проделаны быстро. Так, 2-нафтол связывается с фазами типа C значительно сильнее, чем нафталин, и, в свою очередь, нафталин, лучше, чем 1,2,3,4-тетрагидронафтол. В свою очередь, ожидаемый вклад ионного связывания может быть получен из указанного поведения, в то время как полярное связывание спиртовых групп OH ожидаемо не осуществляется в водном растворителе.

Результат: Двухвалентное связывание фенольных стероидов на фазах, содержащих алкильные и амино группы, таких как C (PV 02001), является преимущественным для выделения из неароматических стероидов. При этом при условиях изократического разделения достигаются значения α (эффективности разделения) до 10.

С другой стороны, на слабо гидрофобной ионообменной фазе A (PV 02007) указанное разделение с удовлетворительным разрешением невозможно.

Иллюстрируемый принцип может быть обобщен на выделение фенольных веществ из нейтральных или основных алифатических соединений, а также и для ароматических соединений. Кроме того, могут хорошо выделяться также и многовалентные фенолы.

Пример 5: Связывание лактамов в качестве субстратов с фазами рецепторов компании instrAction посредством, по меньшей мере, двухвалентных связей

Связывание метилфенилгидантоина (MPH) 1, дифенилгидантоина (DPN) 2 и метилфенилсукцинимида 3 из хлороформа с рядом фаз рецепторов, содержащих 80% амино групп и 14% бензильных групп (например, PV 99047, PV 00010; степень поперечной сшивки 5%), определяют посредством фронтального анализа.

Для этого фазу рецептора, которую набивают в колонки ВЭЖХ (40 × 4 мм), промывают растворами субстрата с увеличением концентрации до наступления соответствующего насыщающего равновесия. Из скорости потока, из времени до сквозного прохождения вещества и из концентрации субстрата могут быть вычислены соответствующие концентрации связанного субстрата [RS] для известных постоянных концентраций субстрата [S] = [S₀]. Из кривых сквозного прохождения, которые измеряются для 10-12 концентраций субстрата, посредством изотерм адсорбции, соответственно, диаграмм Скатчарда, могут определяться константа связи K_A и концентрация насыщения [R₀], при этом могут детектироваться области двухвалентных и одновалентных связей.

Посредством выбора растворителя обеспечивается, чтобы реализовались в основном полярные взаимодействия, в частности водородные связи.

Типичные измеренные значения показаны как a)-c).

a) Связывание MPH с поли(бензил-N-аллил-карбаматом) на силикагеле, 6 слоев, поперечно сшитом (PAA-Obzl14-2Dod, PV 99047):

Область двухвалентных связей:

K_A= 12703 M^-1

ΔG = 5,50 ккал/моль

R₀ = 12,0 мкмоль/г

Область одновалентных связей:

K_A = 221 M^-1

ΔG = 3,14 ккал/моль

R₀ = 301,4 мкмоль/г

b) Связывание DPH с поли(бензил-N-аллил-карбаматом) на силикагеле, 6 слоев, поперечно сшитом (PAA-OBzll4-2Dod, PV 00010):

Область двухвалентных связей:

K_A = 19880 M^-1

ΔG = 5,76 ккал/моль

R₀ = 4,6 мкмоль/г

Область одновалентных связей:

K_A = 201 M^-1

ΔG = 3,09 ккал/моль

R₀ = 226,7 мкмоль/г

c) Связывание MPS с поли(бензил-N-аллил-карбаматом) на силикагеле, 3 слоя, поперечно сшитом (PAA-OBzll4-2Dod, PV 99047):

Область одновалентных связей:

K_A = 75-78 M^-1

R₀ = 96,5-97,4 мкмоль/г

1. Наблюдение: Для обоих гидантоинов 1 и 2 (MPH и DPH) в полной серии исследований константы двухвалентной связи K_A определяются в пределах между 6000 и 23000 M^-1, для насыщающих количеств вещества R₀ в пределах между 3 мкмоль/г фазы и 12,6 мкмоль/г фазы, для нескольких вариантов фаз рецепторов (например, PV 99047, PV 00010). Это показывает, что по отношению к амину могли бы сформироваться два водородных мостика. Константа одновалентной связи находится в пределах между 109 и 221 M^-1 (R₀ = 239-301 мкмоль/г). С другой стороны, для сукцинимидного производного константы только одновалентной связи от 75-78 M^-1 обнаружены для величины насыщения R₀ 96 мкмоль/г. Это может интерпретироваться таким образом, что сукцинимид может образовывать только один водородный мостик и по этой причине способен только к одновалентному связыванию.

2. Наблюдение: Константа связи для двухвалентной связи очень хорошо соответствует произведению значений объединенных констант одновалентной связи. Соответствующие одновалентные энергии Гиббса ΔG приблизительно складываются друг с другом. Для одной водородной связи группы лактама пятичленного кольца в хлороформе определяют энергии Гиббса ΔG в пределах между 2,5 и 3,14 ккал/моль, при 25°C, а для двухвалентных водородных связей - в пределах между 5,06 и 5,88 ккал/моль. Эти значения превосходят данные, которые ожидаются для растворителя хлороформа согласно литературе (MPH: K_A = 6014 M^-1, ΔG = 5,06 ккал/моль, R₀ = 3,2 мкмоль/г; DPH: K_A = 7171 M^-1, ΔG = 5,16 ккал/моль, R₀ = 6,9 мкмоль/г и K_A = 145 M^-1, ΔG = 2,90 ккал/моль, R₀ = 264,0 мкмоль/г).

Результат: При этом можно показать, что усиление двухвалентного связывания происходит также тогда, если со стороны субстрата и со стороны рецептора два сходных комплементарных остатка (остатки сайтов связывания), соответственно, взаимодействуют друг с другом, подобно эффектам хелатирования. В рассмотренном случае они представляют собой амидные группы субстратов и аминовые группы рецептора. При этом энергии Гиббса приблизительно складываются друг с другом, константы связывания умножаются друг на друга. В соответствии с указанным принципом, в частности, могут разрабатываться фазы рецепторов, которые являются пригодными для разделения гомологичных веществ или веществ с различной валентностью, по отношению к функциональным группам (например, одноатомные - шестиатомные спирты, такие как сахара).

Пример 6: Связывание некоторых C-блокированных аминокислот в качестве субстратов на сорбентах на основе поливиниламина/силикагеля в качестве сорбентов посредством, по меньшей мере, двухвалентных связей

Свойства удерживания 18 различных производных аминокислот (субстраты в таблице 11) исследуют посредством хроматографии на семи различных неподвижных фазах (синтетических рецепторах).

Производные аминокислот (1-18) представляют собой сложные эфиры аланина, лейцина, пролина, лизина, гистидина, фенилаланина, тирозина и триптофана. Эти сложные эфиры выбирают для исключения нежелательных взаимодействий ионизируемых карбоксилатных функциональных групп. Авторы не ожидают заметных вкладов во взаимодействия от сложных метиловых эфиров в противоположность сложным бензиловым эфирам.

Таблица 11 Производные аминокислот в качестве субстратов
субстрат	Наименование	структура
1	H-Ala-OMe
2	H-Ala-OBzl
3	H-Leu-OMe
4	H-Leu-OBzl
5	H-Pro-OMe
6	H-Pro-OBzl
7	Z-Lys-OMe
8	H-Lys(Z)-OMe
9	Boc-Lys-OMe
10	H-Lys(Boc)-OMe
11	H-His-OMe
12	Bzl-His-OMe
13	H-Phe-OMe
14	H-Phe-OBzl
15	H-Tyr-OMe
16	H-Tyr-OBzl
17	H-Trp-OMe
18	H-Trp-OBzl

Используемые фазы рецепторов представляют собой сферический силикагель с покрытием из поливиниламина, с размером частиц 20 мкм и диаметром пор 1000 Е. В способе нанесения покрытия сначала получают амино фазу A. Дериватизованные фазы рецепторов B-K получают из амино фазы A посредством твердофазного синтеза в соответствии с известными способами. Фазы приведены в таблице 12:

Таблица 12 Структура используемых фаз рецепторов
наименование фазы	состав фазы	структура фазы
A BV 03002	K1000-PVA-FA-2-5-Dod амино фаза
B ND 03001#2	K1000-PVA-FA-2-5-Dod-Ac-100 ацетильная фаза
C ND 03105	K1000-PVA-FA-2-10-Dod-MVS-100 4-метилвалерильная фаза
D ND 03017#3	K1000-PVA-FA-2-5-Dod-BzlO-100 бензилоксикарбонильная фаза
I ND 02061#2	K1000-PVA-FA-2-5-Dod-BSr-100 фаза янтарной кислоты
J ND 03096	K1000-PVA-FA-2-5-Dod-MVS-50-BSr-50 фаза с 4-метилвалерильными группами и группами янтарной кислоты
K ND 03088	K1000-PVA-FA-2-5-Dod-BzlO-50-BSr-50 фаза с бензилоксикарбонильными группами и группами янтарной кислоты

В качестве подвижной фазы для хроматографических исследований используют водный раствор 10 мМ трис-HCl-буфера, имеющего pH 7,5.

В качестве меры прочности взаимодействия между субстратом и рецептором в соответствующих буферных растворах используют приборно-независимый относительный коэффициент элюирования k' (коэффициент емкости). Его можно вычислить из разности объема элюирования на максимуме пика и мертвого объема колонки, деленной на мертвый объем колонки:

Значения k' субстратов в 10 ммоль трис-HCl-буфере приведены в таблице 13:

Таблица 13 Значения k' субстратов в 10 ммоль трис-HCl-буфере
субстрат	значения k' по отношению к фазе рецептора
A	B	C	D	I	J	K
1	H-Ala-OMe	0,0	0,0	0,0	0,2	13,7	8,7	11,6
2	H-Ala-OBzl	0,0	0,0	0,2	2,1	17,4	13,4	23,9
3	H-Leu-OMe	0,0	0,0	0,0	0,3	12,5	7,1	10,4
4	H-Leu-OBzl	0,0	0,1	6,3	10,0	13,1	18,6	41,7
5	H-Pro-OMe	0,0	0,0	0,0	0,4	-	11,9	15,9
6	H-Pro-OBzl	0,0	0,1	0,2	3,6	21,7	16,6	34,4
7	Z-Lys-OMe	0,0	0,1	0,0	2,4	19,7	20,9	61,5
8	H-Lys(Z)-OMe	0,0	0,1	0,6	6,5	12,0	11,5	30,2
9	Boc-Lys-OMe	0,0	0,0	0,0	0,4	14,3	11,9	20,2
10	H-Lys(Boc)-OMe	0,0	0,0	0,1	0,5	9,0	5,3	9,8
11	H-His-OMe	0,0	0,0	0,0	0,3	18,2	5,7	13,8
12	Bzl-His-OMe	0,0	0,0	0,5	1,2	4,5	1,9	3,7
13	H-Phe-OMe	0,0	0,0	0,1	0,2	6,5	1,7	3,2
14	H-Phe-OBzl	0,1	0,1	12,6	39,0	7,3	12,3	39,4
15	H-Tyr-OMe	0,0	0,2	0,7	1,0	8,7	4,8	6,5
16	H-Tyr-OBzl	0,1	0,3	16,7	20,3	9,4	16,3	16,5
17	H-Trp-OMe	0,5	0,2	1,0	4,4	12,5	10,7	17,7
18	H-Trp-OBzl	0,8	0,3	49,6	55,4	16,6	49,5	186,4

1. Наблюдение: В примере 1 значения k' производных аминокислот с карбоксилатными группами исследуют на амино фазах. Монокарбоксилаты Ac-Gln 1 и Boc-Gln 2 из примера 1 достигают коэффициентов k' 9,5 и 8,8 на амино фазе (BV 02042). В настоящем примере 6 получают для простых моноаминов, таких как H-ala-OMe, 1, и H-leu-OMe, 3, на карбоксилатной фазе I, значения k' 13,7 и 12,5.

Интерпретация наблюдения: При взаимной замене взаимодействующих групп в субстрате и фазе рецептора значения k' изменяются только ненамного. Этого можно было ожидать, поскольку прочность связи должна быть независимой от направления связи. Для планируемого применения взаимодействующих групп является важным, чтобы имело место сравнимое связывание, независимо от того, какая группа фиксируется в рецепторе или является подвижной в субстрате.

2. Наблюдение: На амино фазе A и ацетамидо фазе B удерживание субстратов по существу не имеет места.

Интерпретация наблюдения: Фазы рецепторов A и B не содержат рецепторных групп, с которыми было бы возможным заметное взаимодействие субстратов в выбранном буфере. Соответственно, значения k' приблизительно раны нулю. Эти фазы могут использоваться как нулевые точки на относительной шкале взаимодействий. Липофильное воздействие полимерного каркаса может не учитываться в балансе связывания.

3. Наблюдение: Все субстраты показывают четкое удерживание на карбоксилатной фазе I. Значения k' находятся в пределах между 4,5 и 21,7.

Интерпретация наблюдения: Все исследуемые субстраты содержат, по меньшей мере, одну амино группу. Указанная амино группа по большей части протонируется при pH 7,5 и может подвергаться сильным ионным взаимодействиям с карбоксилатными анионами фазы.

4. Наблюдение: Фазы рецепторов C и D показывают более низкое удерживание для субстратов, содержащих единственную липофильную парциальную структуру, например 2, 6, 7, 8, 15 или 17. Сильное удерживание (значения k' > 8) обнаруживают для субстратов, которые обладают, по меньшей мере, двумя липофильными молекулярными частями большего размера, таких как 4, 14, 16 и 18. При этом связывание с ароматической фазой рецептора D является в каждом случае большим, чем с алкильной фазой рецептора.

Интерпретация наблюдения: Фазы рецепторов C и D могут подвергаться только липофильным взаимодействиям. Эти связи являются относительно слабыми по сравнению с ионными взаимодействиями. Одновалентные липофильные взаимодействия часто находятся на пределе детектирования в выбранном буфере. Субстраты с двумя протяженными липофильными остатками демонстрируют увеличение удерживания вследствие большей области липофильного контакта.

5. Наблюдение: В большинстве случаев самое большое значение k' для соответствующего субстрата обнаруживают на фазе рецептора K.

Интерпретация наблюдения: Фаза рецептора K содержит приблизительно равные молярные количества карбоксилатных групп и бензилоксилкарбонильных групп, то есть рецепторных групп для ионных и для липофильных взаимодействий. Поскольку общее количество групп взаимодействий приблизительно соответствует их количеству в чистых фазах рецепторов C, D или I, на смешанной фазе рецептора K, нужно ожидать значения k' в пределах между значениями k' фаз D и I. Детектируемые высокие значения k' на смешанной фазе рецептора показывают, что в указанных случаях ионное и липофильное связывание имеют место одновременно, и при этом присутствует смешанный, двухвалентный режим связывания.

Для прочности π-π контактов между ароматическими системами связывание всех субстратов, имеющих ароматический остаток, с фазой, содержащей бензильную группу, сильнее, чем с фазой J, имеющей разветвленный алкильный остаток.

Результат: Для описанных выше экспериментов может быть четко доказано, что можно целенаправленно активировать и дезактивировать взаимодействия между субстратом и фазой рецептора посредством соответствующего выбора чистых рецепторных групп. Для регуляции сродства и селективности дополнительно могут варьироваться композиция растворителя, ионная сила и pH.

Если субстрат имеет две липофильных части молекулы, он может двухвалентно взаимодействовать с фазой рецептора, что приводит к значительному упрочнению связи. В таком случае это двухвалентное взаимодействие одинакового типа.

Можно также показать, что возможны двухвалентные взаимодействия различных типов (ионные и липофильные), если как фаза рецептора, так и субстрат содержат соответствующие комплементарные группы. Здесь также имеет место селективное усиление связывания.

Посредством конструирования рецептора, являющегося, соответственно, комплементарным к целевому веществу, сопутствующие вещества или побочные продукты могут легко отделяться. Мера для возможности разделения представляет собой отношение значений k', селективность альфа:

Селективность: альфа = k₂'/k₁'

Например, для фазы D бензил/рецептор хроматографическое разделение Boc-lys-OMe (9) и H-lys(Boc)-OMe (10) едва ли является возможным. На карбоксилатной фазе рецептора I получается значение альфа 1,59. Смешанные фазы рецепторов J и K уже показывают значения альфа 2,25 и 2,06. Это показывает значительное улучшение хроматографической разделяемости в смеси посредством соответствующего конструирования фазы рецептора.

1. Способ получения, по меньшей мере, одного сорбента, имеющего, по меньшей мере, две различные группы, которые способны к связыванию, для селективного, по меньшей мере, двухвалентного связывания второго субстрата, отличающийся тем, что он включает стадии (i)-(ii):

(i) определения, по меньшей мере, двух групп, способных к связыванию, из синтетического или природного первого субстрата,

(ii) соответственно, нанесения, по меньшей мере, двух различных групп, способных к связыванию второго синтетического или природного субстрата, на один соответствующий носитель, тем самым формирования, по меньшей мере, одного сорбента, при этом первый субстрат является таким же, как второй субстрат, и, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию второго субстрата, соответственно выбирают среди тех групп, которые являются комплементарными к группам, которые определяют на стадии (i),

и при этом группы на стадии (ii) выбирают таким образом, что вклады энергии Гиббса индивидуальных групп в нековалентное связывание со вторым субстратом дают отрицательное значение энергии Гиббса ΔG, так что образуется комплекс сорбент/субстрат, в котором, по меньшей мере, одна комплементарная группа в большей степени или сильнее участвует в связи со вторым субстратом, чем в комплексе между сорбентом и, по меньшей мере, одним веществом, которое должно отделяться, и при этом происходит упрочнение связывания, которое приводит к улучшению селективности разделения по отношению, по меньшей мере, к одному веществу, которое должно отделяться.

2. Способ получения, по меньшей мере, одного сорбента, имеющего, по меньшей мере, две различные группы, которые способны к связыванию, для селективного, по меньшей мере, двухвалентного связывания второго субстрата, отличающийся тем, что он включает стадии (i)-(ii):

(i) определения, по меньшей мере, двух групп, способных к связыванию, из синтетического или природного первого субстрата,

(ii) соответственно нанесения, по меньшей мере, двух различных групп, способных к связыванию второго синтетического или природного субстрата, на один соответствующий носитель, тем самым формирования, по меньшей мере, одного сорбента, при этом первый субстрат является отличным от второго субстрата, и, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию второго субстрата, соответственно выбирают среди тех групп, которые являются комплементарными к группам, которые определяют на стадии (i),

и при этом группы на стадии (ii) выбирают таким образом, что вклады энергии Гиббса индивидуальных групп в нековалентное связывание со вторым субстратом дают отрицательное значение энергии Гиббса ΔG, так что образуется комплекс сорбент/субстрат, в котором, по меньшей мере, одна комплементарная группа в большей степени или сильнее участвует в связи со вторым субстратом, чем в комплексе между сорбентом и, по меньшей мере, одним веществом, которое должно отделяться, и при этом происходит упрочнение связывания, которое приводит к улучшению селективности разделения по отношению, по меньшей мере, к одному веществу, которое должно отделяться.

3. Способ получения, по меньшей мере, одного сорбента, имеющего, по меньшей мере, две различные группы, которые способны к связыванию, для селективного, по меньшей мере, двухвалентного связывания второго субстрата, отличающийся тем, что он включает стадии (i)-(ii):

(i) определения, по меньшей мере, двух групп, способных к связыванию, из синтетического или природного первого субстрата,

(ii) соответственно нанесения, по меньшей мере, двух различных групп, способных к связыванию второго синтетического или природного субстрата, на один соответствующий носитель, тем самым формирования, по меньшей мере, одного сорбента, при этом первый субстрат является отличным от второго субстрата, и, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию второго субстрата, соответственно выбирают среди тех групп, которые определяют на стадии (i),

и при этом группы на стадии (ii) выбирают таким образом, что вклады энергии Гиббса индивидуальных групп в нековалентное связывание со вторым субстратом дают отрицательное значение энергии Гиббса ΔG, так что образуется комплекс сорбент/субстрат, в котором, по меньшей мере, одна комплементарная группа в большей степени или сильнее участвует в связи со вторым субстратом, чем в комплексе между сорбентом и по меньшей мере одним веществом, которое должно отделяться, и при этом происходит упрочнение связывания, которое приводит к улучшению селективности разделения по отношению, по меньшей мере, к одному веществу, которое должно отделяться.

4. Способ селективного, по меньшей мере, двухвалентного связывания второго субстрата, имеющего, по меньшей мере, две различные группы, которые способны к связыванию, по меньшей мере, с одним сорбентом, отличающийся тем, что он включает стадии (i)-(iv):

(i) определения, по меньшей мере, двух групп, способных к связыванию, из синтетического или природного первого субстрата,

(ii) соответственно нанесения, по меньшей мере, двух различных групп, способных к связыванию второго синтетического или природного субстрата, на один соответствующий носитель, тем самым формирования, по меньшей мере, одного сорбента, при этом первый субстрат является таким же, как второй субстрат, и, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию второго субстрата, соответственно выбирают среди тех групп, которые являются комплементарными к группам, которые определяют на стадии (i),

(iii) приведения в контакт, по меньшей мере, одного второго субстрата, который является таким же, как первый субстрат в соответствии с (i) или отличным от него, по меньшей мере, с одним сорбентом со стадии (ii),

(iv) исследования прочности связывания, по меньшей мере, одного второго субстрата, по меньшей мере, с одним сорбентом со стадии (iii), и при этом группы на стадии (ii) выбирают таким образом, что вклады энергии Гиббса индивидуальных групп в нековалентное связывание со вторым субстратом дают отрицательное значение энергии Гиббса ΔG, так что образуется комплекс сорбент/субстрат, в котором, по меньшей мере, одна комплементарная группа в большей степени или сильнее участвует в связи со вторым субстратом, чем в комплексе между сорбентом и, по меньшей мере, одним веществом, которое должно отделяться, и при этом происходит упрочнение связывания, которое приводит к улучшению селективности разделения по отношению, по меньшей мере, к одному веществу, которое должно отделяться.

5. Способ селективного, по меньшей мере, двухвалентного связывания второго субстрата, имеющего, по меньшей мере, две различные группы, которые способны к связыванию, по меньшей мере, с одним сорбентом, отличающийся тем, что он включает стадии (i)-(iv):

(i) определения, по меньшей мере, двух групп, способных к связыванию, из синтетического или природного первого субстрата,

(ii) соответственно нанесения, по меньшей мере, двух различных групп, способных к связыванию второго синтетического или природного субстрата, на один соответствующий носитель, тем самым формирования, по меньшей мере, одного сорбента, при этом первый субстрат является отличным от второго субстрата, и, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию второго субстрата, соответственно выбирают среди тех групп, которые являются комплементарными к группам, которые определяют на стадии (i),

(iii) приведения в контакт, по меньшей мере, одного второго субстрата, который является таким же, как первый субстрат в соответствии с (i) или отличным от него, по меньшей мере, с одним сорбентом со стадии (ii),

(iv) исследования прочности связывания, по меньшей мере, одного второго субстрата, по меньшей мере, с одним сорбентом со стадии (iii),

и при этом группы на стадии (ii) выбирают таким образом, что вклады энергии Гиббса индивидуальных групп в нековалентное связывание со вторым субстратом дают отрицательное значение энергии Гиббса ΔG, так что образуется комплекс сорбент/субстрат, в котором, по меньшей мере, одна комплементарная группа в большей степени или сильнее участвует в связи со вторым субстратом, чем в комплексе между сорбентом и, по меньшей мере, одним веществом, которое должно отделяться, и при этом происходит упрочнение связывания, которое приводит к улучшению селективности разделения по отношению, по меньшей мере, к одному веществу, которое должно отделяться.

6. Способ селективного, по меньшей мере, двухвалентного связывания второго субстрата, имеющего, по меньшей мере, две различные группы, которые способны к связыванию, по меньшей мере, с одним сорбентом, отличающийся тем, что он включает стадии (i)-(iv):

(i) определения, по меньшей мере, двух групп, способных к связыванию, из синтетического или природного первого субстрата,

(ii) соответственно нанесения, по меньшей мере, двух различных групп, способных к связыванию второго синтетического или природного субстрата, на один соответствующий носитель, тем самым формирования, по меньшей мере, одного сорбента, при этом первый субстрат является отличным от второго субстрата, и, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию второго субстрата, соответственно выбирают среди тех групп, которые определяют на стадии (i),

(iii) приведения в контакт, по меньшей мере, одного второго субстрата, который является таким же, как первый субстрат в соответствии с (i) или отличным от него, по меньшей мере, с одним сорбентом со стадии (ii),

(iv) исследования прочности связывания, по меньшей мере, одного второго субстрата, по меньшей мере, с одним сорбентом со стадии (iii),

и при этом группы на стадии (ii) выбирают таким образом, что вклады энергии Гиббса индивидуальных групп в нековалентное связывание со вторым субстратом дают отрицательное значение энергии Гиббса ΔG, так что образуется комплекс сорбент/субстрат, в котором по меньшей мере одна комплементарная группа в большей степени или сильнее участвует в связи со вторым субстратом, чем в комплексе между сорбентом и, по меньшей мере, одним веществом, которое должно отделяться, и при этом происходит упрочнение связывания, которое приводит к улучшению селективности разделения по отношению, по меньшей мере, к одному веществу, которое должно отделяться.

7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что определение на стадии (i) включает расщепление синтетического или природного первого субстрата, по меньшей мере, на два компонента, имеющие, по меньшей мере, две группы, способные к связыванию сорбента.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что один компонент имеет, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что выбор, по меньшей мере, двух групп, способных к связыванию, из синтетического или природного первого субстрата на стадии (i) дает два компонента, каждый из которых имеет, по меньшей мере, одну группу, способную к связыванию, и на стадии (ii) получают один сорбент; или выбор, по меньшей мере, двух групп, способных к связыванию, из синтетического или природного первого субстрата на стадии (i) дает три компонента, каждый из которых имеет, по меньшей мере, одну группу, способную к связыванию, и на стадии (ii) получают, по меньшей мере, три сорбента; или выбор, по меньшей мере, двух групп, способных к связыванию, из синтетического или природного первого субстрата на стадии (i) дает четыре компонента, каждый из которых имеет, по меньшей мере, одну группу, способную к связыванию, и на стадии (ii) получают, по меньшей мере, шесть сорбентов.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию, по меньшей мере, одного сорбента, выбирают среди групп, которые представляют собой части аминокислот, сахаров, нуклеотидов, нуклеозидов, пиримидиновых оснований и пуриновых оснований.

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию, по меньшей мере, одного второго субстрата выбирают среди групп, которые представляют собой части аминокислот, сахаров, нуклеотидов, нуклеозидов, пиримидиновых оснований и пуриновых оснований.

12. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что, по меньшей мере, две различные группы на стадии (ii), соответственно ковалентно связаны с полимером.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что полимер непосредственно синтезируют на носителе посредством полимеризации или поликонденсации, по меньшей мере, одного мономера, имеющего, по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию, или, по меньшей мере, двух мономеров, каждый из которых имеет, по меньшей мере, одну группу, способную к связыванию, при этом указанные группы являются различными.

14. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что на стадии (ii), по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию второго субстрата, наносят на носитель при помощи реагента, который выбирают из группы, содержащей активирующие реагенты, силанизирующие реагенты и спейсер, или смеси двух или более из указанных реагентов.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что на стадии (ii), по меньшей мере, две различные группы, способные к связыванию второго субстрата, выбирают из группы, состоящей из фенильного, гидроксифенильного, карбоксильного, амино, амидного, гидроксильного, индольного, имидазольного и гуанидинового остатков.

16. Способ по любому из пп.4-15, отличающийся тем, что он дополнительно включает стадию (v):

(v) выделения, по меньшей мере, одного второго субстрата.

17. Способ по любому из пп.4-16, отличающийся тем, что он дополнительно включает стадию (vi):

(vi) характеризации и идентификации, по меньшей мере, одного второго субстрата.

18. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что первый или второй субстрат содержит один или несколько природных агентов, выбранных из группы, включающей аминокислоты, олигопептиды, нуклеотиды, белки, гликопротеины, антигены, антитела, углеводы, ферменты, коферменты, гормоны, алкалоиды, стероиды, вирусы, микроорганизмы, вещества, содержащиеся в растительных и животных тканях, клетки, фрагменты клеток, отделы клеток, остатки клеток, лектины, флавилиевые соединения, флавоны и изофлавоны, или один или несколько синтетических агентов, выбранных из группы веществ, оказывающих воздействие на нервную систему, оказывающих воздействие на гормональную систему, оказывающих воздействие на медиаторы, оказывающих воздействие на сердечно-сосудистую систему, оказывающих воздействие на дыхательные пути, оказывающих воздействие на желудочно-кишечный тракт, оказывающих воздействие на почки и мочевыводящий тракт, оказывающих воздействие на глаза, оказывающих воздействие на кожу, веществ для профилактики и терапии инфекционных заболеваний, оказывающих воздействие на злокачественные опухоли, оказывающих воздействие на иммунную систему и веществ, оказывающих иммунологическое воздействие, а также инсектицидов, гербицидов, пестицидов и фунгицидов.

19. Комбинаторная библиотека, содержащая коллекцию сорбентов, полученных способом по любому из пп.1-3, 7-15 или 18, и имеющих, по меньшей мере, две различные первые группы, соответственно которые способны к нековалентному, по меньшей мере, двухвалентному связыванию, по меньшей мере, одного субстрата, имеющего, по меньшей мере, две различные вторые группы.

20. Комбинаторная библиотека по п.19, отличающаяся тем, что, по меньшей мере, две различных группы сорбентов и, по меньшей мере, две различные группы, по меньшей мере, одного субстрата, выбирают среди групп, которые представляют собой части аминокислот, сахаров, нуклеотидов, нуклеозидов, пиримидиновых оснований и пуриновых оснований.

21. Комплекс сорбент/субстрат, содержащий, по меньшей мере, один сорбент, полученный способом по любому из пп.1-3, 7-15 или 18, и, по меньшей мере, один субстрат, имеющий, по меньшей мере, две различные вторые группы, при этом указанный сорбент имеет, по меньшей мере, две различные первые группы, способные к нековалентному, по меньшей мере, двухвалентному связыванию, по меньшей мере, одного субстрата, имеющего, по меньшей мере, две различные вторые группы.

22. Применение способа по любому из пп.4-18 для детектирования взаимодействия рецептор/агент, для скрининга агентов, для разработки ведущих веществ, для отделения субстратов, для очистки субстратов, для разделения изомерных соединений, для очистки жидкостей посредством отделения вредных веществ, для ограничения динамических комбинаторных библиотек.

23. Применение комбинаторной библиотеки по любому из пп.19 или 20 для детектирования взаимодействия рецептор/агент, для скрининга агентов, для разработки ведущих веществ, для отделения субстратов, для очистки субстратов, для разделения изомерных соединений, для очистки жидкостей посредством отделения вредных веществ, для ограничения динамических комбинаторных библиотек.

24. Применение комплекса сорбент/субстрат по п.21 для детектирования взаимодействия рецептор/агент, для скрининга агентов, для разработки ведущих веществ, для отделения субстратов, для очистки субстратов, для разделения изомерных соединений, для очистки жидкостей посредством отделения вредных веществ, для ограничения динамических комбинаторных библиотек.