Биомиметический протез связки и способ его изготовления

Настоящее изобретение относится к медицине, конкретно к искусственным биомиметическим протезам из полиэфира, особенно из полиэтилентерефталата, а также к способу биомиметической функционализации упомянутых протезов. Способ включает стадию прививки биологически активных полимеров или сополимеров на полиэфирную поверхность упомянутых протезов, причем эта стадия прививки состоит в осуществлении окисления поверхности с образованием пероксидных соединений путем озонирования с последующей стадией радикальной полимеризации раствора по меньшей мере одного мономера. Кроме того, этот способ включает факультативную стадию импрегнирования протезов фибронектинами и/или коллагеном типа I и/или III. Протезы, изготовленные по настоящему изобретению, обеспечивают нормальный и равномерный рост фибробластов, значительно повышая таким образом биологическую интеграцию таких полиэфирных протезов. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 2 табл.

 

Настоящее изобретение относится к биомиметическому протезу связки и к способу его изготовления.

Искусственным связкам для замены биологических связок суставов, особенно коленного сустава, в некоторых специфических случаях отдается предпочтение по сравнению с непосредственным сшиванием для аутогенной трансплантации. Действительно, качество этих связок как в отношении механических свойств, так и с точки зрения биосовместимости за последние два десятилетия значительно улучшилось.

Так, например, в патенте Франции FR-96.14263 описана протезная связка из полиэтилентерефталата (PET), называемая связкой "с ориентированными волокнами". Эта связка состоит из свернутого или сложенного полотнища ткани, причем это полотнище содержит две оконечные внутрикостные части и промежуточную внутрисуставную часть, состоящую из пучка продольных уточных активных волокон, прилегающих друг к другу и не соединенных между собой поперечными связями. При сборке этой связки каждому активному волокну сообщают продольное закручивание, получая таким образом связку с правым или левым закручиванием, воспроизводящим естественное закручивание связок при сгибании. Этот тип связки из PET-материала, обладающего хорошо известной биосовместимостью, обладает чрезвычайно высоким сопротивлением усилиям растяжения, изгиба и кручения, что позволяет прогнозировать увеличение его срока службы по сравнению с другими известными связками.

Тем не менее, несмотря на этот значительный прогресс в отношении биомеханических характеристик, отмечаются случаи разрушения таких искусственных связок у пациентов. Предпринятые исследования причин таких случаев обнаружили неудовлетворительное возобновление роста фибробластов после имплантации. Действительно, распределение этих клеток по поверхности связки неоднородно, фибробласты не развиваются во внутрикостных зонах протеза и сосредотачиваются на волокнах во внутрисуставной зоне. Кроме того, у этих фибробластов отмечается аномальная округленная морфология с незначительным количеством точек сцепления с поверхностью связки. Действительно, секреция коллагена этими клетками нарушается и приводит к разобщению отдельных волокон внутрисуставной зоны с накоплением волокнистой ткани между оболочкой и центральной частью протеза, что также способствует его повреждению.

Для решения задачи обеспечения эффективного "повторного заселения" протеза фибробластами патент FR 2.651.994 предлагает пропитывание протезной связки коллагеном, причем волокна коллагена ориентируют вдоль продольной оси связки с целью достижения благоприятного направления ее заполнения живой соединительной тканью. Помимо ограниченной и неудовлетворительной эффективности существенным недостатком этого решения является зависимость достигаемого результата от трудно воспроизводимого качества используемого коллагена.

Настоящее изобретение направлено на решение этой проблемы и с этой целью предлагает способ биомиметической функционализации связок, а именно способ сообщения им способности к имитации живых материалов для улучшения их биологической интеграции.

В этом отношении и в соответствии с изобретением предлагается способ биомиметической функционализации протезов из полиэфиров, в частности из полиэтилентерефталата (PET), отличающийся тем, что он включает по меньшей мере одну стадию прививки биологически активных полимеров или сополимеров к полиэфирной поверхности упомянутых протезов, причем эта стадия прививки состоит в осуществлении окисления поверхности с образованием пероксидных соединений путем озонирования с последующей стадией радикальной полимеризации раствора по меньшей мере одного мономера. Следует отметить, что термин "полиэфирный протез" означает любой протез, состоящий из волокон PET или производного полиэфира, обеспечивающего характеристики, пригодные для его использования в связках, а также любой протез, имеющий на своей поверхности или на поверхности своих волокон слой полиэфира, в частности PET.

Имеется в виду, что создание на поверхности связки, изготовленной в соответствии с вышеупомянутым патентом FR-96.14263, "ковра" из биологически активных полимеров модифицирует ее свойства в отношении адгезии и пролиферации клеток, обеспечивая благоприятные условия для нормального и однородного заселения поверхности фибробластами, о чем свидетельствуют полученные результаты культивирования клеток.

Кроме того, согласно другой характеристике изобретения эти свойства можно улучшить на дополнительной стадии подготовки поверхности полиэфира только в среде растворителя или в среде растворителя с последующей обработкой в водной среде, которая предшествует стадии прививки.

Эти два варианта указанной стадии подготовки обеспечивают значительное повышение эффективности стадии прививки путем повышения качества подвергаемой прививке поверхности, а также увеличения количества привитого полимера (сополимера). Они также играют существенную роль в обеспечении биосовместимого характера связки, обработанной указанным образом.

Другие преимущества и характеристики изобретения ясны из нижеследующего полного описания варианта осуществления изобретения, представленного в качестве неограничительного примера способа функционализации по настоящему изобретению.

Способ по настоящему изобретению применяется к уже сформированным протезам связок или к пучкам полиэфирной ткани, используемым для изготовления упомянутых протезов. Способ подразделяется на следующие стадии:

Стадия 1: Подготовка полиэфирной поверхности

1А) В среде растворителя

Эта операция, называемая обезжириванием, необходима для удаления с полиэфирных волокон, применяемых для изготовления связки, жиров, масел и загрязнений, введенных в процессе получения волокон. Она позволяет также избежать патологических реакций организма пациента типа острого синовита в процессе имплантации. Кроме того, эта стадия позволяет обеспечить рост фибробластов на очищенной полиэфирной поверхности, который не наблюдается на неочищенных поверхностях.

В зависимости от природы выбранного растворителя различают два варианта этой подготовки поверхности в среде растворителя.

Вариант 1: обезжиривание без набухания поверхности

Проводят не менее 12 циклов экстракции в аппарате Сокслета и определяют остаточное содержание жирных веществ после 12-го цикла очистки гексаном. После этих циклов очистки гексаном проводят циклы промывки диэтиловым эфиром (квалификации "реактив для электронной техники", RPE); количество циклов промывки не менее трех с определением остаточных загрязнений после третьей промывки.

Вариант 2: обезжиривание растворителем, способным вызвать набухание поверхности полиэфира

Применение растворителя, способного вызвать набухание поверхности полиэфира, обеспечивает преимущество, заключающееся в повышении эффективности прививки, достигаемом вследствие увеличения количества пероксидов на поверхности после обработки на стадии озонирования.

Характерным признаком такого растворителя является значение диэлектрической постоянной, превышающее 30. Этот растворитель предпочтительно относится к классу циклических или алифатических простых эфиров. Кроме того, этот растворитель выбирают из группы, в которую входят: тетрагидрофуран (ТГФ, THF), диметилсульфоксид (ДМСО, DMSO), N,N-диметилформамид (ДМФ, DMF), N,N-диметилацетамид (ДМАА, DMA), N-метилпирролидон (NMP). Преимуществом этих растворителей является незначительная токсичность или нетоксичность, что упрощает их применение в промышленных условиях.

Обработку осуществляют путем погружения изделий из полиэфира в растворитель на период времени от 5 мин до приблизительно 1 ч, предпочтительно на 10-25 мин. При использовании тетрагидрофурана выбирают время погружения, например 15 мин, при температуре окружающей среды.

1В) В водной среде

Целью этой факультативной стадии подготовки поверхности в водной среде является удаление присутствующих на поверхности остаточных загрязнений, введенных в процессе получения полиэфира, например, низкомолекулярных органических кислот, например, терефталевой кислоты в случае PET. Таким образом получают поверхность, полностью подготовленную к озонированию.

Эта обработка состоит в промывке изделий из полиэфира в растворе карбоната натрия (Na₂CO₃) (5% (масс.) в дистиллированной воде). Промывку осуществляют в горячем растворе, т.е. при температуре выше 60°С и ниже 120°С, предпочтительно при слабом кипении, т.е. при 100±5°С, в течение приблизительно 10 мин. Разумеется, для этой цели можно применять любой другой карбонат щелочного или щелочноземельного металла, например K₂CO₃ или CaCO₃. После этой промывки проводят несколько последовательных промывок дистиллированной водой до достижения рН промывной воды 7.

1С) Окончательная очистка

Независимо от предшествующих стадий (вариантов 1 или 2 стадии 1А с последующей стадией 1В или только стадии 1А) изделие из полиэфира затем окончательно очищают, например, путем ополаскивания абсолютным этанолом или тетрагидрофураном (ТГФ) с последующей сушкой в сушильном шкафу в течение, например, 30 мин.

Стадия 2. Прививка биологически активных полимеров или сополимеров на полиэфирную поверхность

2А. Выбор и подготовка мономеров

К мономерам, применяемым по настоящему изобретению, относятся мономеры, способные к радикальной полимеризации или сополимеризации с образованием биосовместимых полимеров, стимулирующих пролиферацию и дифференциацию клеток, и более конкретно пролиферацию и дифференциацию фибробластов. Такие мономеры, содержащие карбоксильные, фосфатные, сульфонатные и сульфатные группы, описаны, например, в патенте США 6,365,692 и могут быть применены в соответствии с настоящим изобретением индивидуально или в виде смесей. Предпочтение отдается применению метакриловой кислоты и стиролсульфоната, а также их смесей. Перед использованием для полимеризации эти мономеры предварительно подвергают очистке. Так, например, стиролсульфонат натрия очищают путем перекристаллизации из смеси бидистиллированной воды со спиртом (10:90 по объему), а затем растворяют в этой смеси при 70°С. Затем полученный раствор фильтруют под вакуумом через пористый стеклянный фильтр с показателем пористости 3 и выдерживают при 4°С. Образовавшиеся кристаллы стиролсульфоната натрия отделяют фильтрованием и сушат в вакууме при 50°С до постоянной массы.

2В) Озонирование

Протезы или волокнистые изделия из полиэфира, являющиеся составными частями этих протезов, предварительно обработанные согласно стадии 1, помещают в устройство обычно используемого типа для озонирования.

Например, можно использовать трубчатый реактор объемом 500 см³, содержащий 100 см³ воды, оборудованный плунжерной трубкой для подачи озона. Можно применять, например, поток газообразного озона, эквивалентный 50 г/м³ кислорода. При таком количестве озона оптимальная длительность озонирования PET составляет от 20 мин до 90 мин. Измерения относительного количества пероксидов показывают, что оптимальное количество достигается при длительности озонирования в пределах от 30 мин до 60 мин при том же потоке озона. Следует отметить также, что при длительности озонирования свыше 90 мин происходит сильное разрушение поверхности PET.

Кроме того, следует отметить дополнительное преимущество варианта 2 стадии 1А. Действительно, использование растворителя, способного обеспечить набухание поверхности, повышает содержание пероксидов в 5 раз по сравнению с применением растворителя без набухания. По окончании озонирования протезы или волокнистые изделия из полиэфира, являющиеся составными частями этих протезов, помещенные в устройство для озонирования, промывают и очищают, например, по следующей методике: трижды промывают бидистиллированной водой, затем трижды абсолютным спиртом, а затем трижды тетрагидрофураном (ТГФ). Затем следует сушка в вакуумном сушильном шкафу в течение 30 мин при 25°С.

2С Полимеризация

Мономер (или мономеры), выбранный для применения и подготовленный согласно стадии 2А, растворяют в воде, предпочтительно в бидистиллированной. При этом можно применять любую концентрацию, совместимую с осуществлением реакции радикальной полимеризации, при минимальном значении 5% (масс.) Целесообразно выбирать концентрации, близкие к пределу растворимости полимера (полимеров) в растворе, с обеспечением вязкой среды, способствуя таким образом предпочтительному протеканию реакций радикального удлинения полимерной цепи по сравнению с реакциями обрыва цепи: при этом получают привитые полимерные цепи большей длины. Это соответствует выбору массовой концентрации k=s-ε, где s - предел растворимости, а ε составляет 1-7% (масс.). Так, например, в случае полистиролсульфоната, для которого предел растворимости равен 20% (масс.), выбирают концентрацию 15%.

Длительность стадии полимеризации зависит от природы мономера. Она определяется временем, необходимым для желатинизации среды при температуре реакции. Так, например, можно указать, что для полистиролсульфоната при 70°С полимеризация будет длиться 1 ч, а при 65°С - 1 ч 30 мин.

Реакцию полимеризации проводят в герметически закрытом сосуде, из которого удален кислород, например, путем продувания аргоном. В этот сосуд вводят раствор мономеров или сомономеров, предназначенный для проведения реакции с протезами или лентами ткани из полиэфира, предварительно подвергнутыми озонированию. Герметизированный сосуд нагревают на водяной бане при температуре и в течение периода времени, выбранных, как указано выше.

По окончании реакции изделия из полиэфира с привитыми полимерами извлекают из реактора. Эти привитые материалы можно затем подвергнуть промывке с целью удаления непрореагировавших остатков мономера (мономеров). Например, можно несколько раз промыть функционализированную поверхность растворителем, пригодным для растворения мономера (мономеров), например, бидистиллированной водой, и факультативно осуществить окончательную промывку любым соответствующим растворителем, например абсолютным этанолом, с целью удаления возможных следов непривитых полимеров.

Стадия 3. Импрегнирование биохимическими агентами

Эта стадия является факультативной. Она направлена на усиление способности связки, к которой предварительно привиты биомиметические полимеры в соответствии со стадиями 1 и 2, к биологической интеграции. Таким образом, импрегнирование протеза одним или несколькими биохимическими агентами предназначено для повышения эффективности адгезии и пролиферации клеток на нем. К этим биохимическим агентам, способствующим образованию колоний фибробластов, относятся протеин из семейства фибронектинов и/или коллаген типа I и/или типа III. Целесообразно использовать смесь вышеуказанных протеинов, т.е. смесь фибронектинов и коллагена типа I и/или типа III. В этом случае наблюдается синергическое влияние на адгезию фибробластов. Импрегнирование протеза этими агентами можно осуществить, например, путем пропитывания в ванне, содержащей коллаген.

Очевидно, что эта стадия импрегнирования не обязательно следует за стадией прививки и что она может выполняться между другими стадиями подготовки связки, в зависимости от последовательности ее изготовления. Кроме того, целесообразно, чтобы за этой стадией импрегнирования следовала стадия стерилизации связки.

С целью количественной оценки эффективности описываемого способа были выполнены сопоставительные испытания на образцах трикотажной ткани из PET. Полиэфир имел полукристаллическую структуру с показателем кристалличности 40±5% и температуру плавления приблизительно 260±5°С. Эти волоконные материалы были составными частями искусственных связок, производимых и поставляемых на рынок заявителем. Были изготовлены также сравнительные образцы волокон PET без прививки и двух типов волокон PET с привитыми полимерами, полученными с применением стиролсульфоната натрия и смеси равных массовых количеств метакриловой кислоты (AM) и стиролсульфоната натрия (SSNa). В таблице 1 представлены условия получения образцов.

Таблица 1. Изготовление образцов
	Подготовка поверхности	Озонирование	Прививка
Непривитые волокна PET	Гексан и диэтиловый эфир; 5% Na2СО3	--	--
Привитые волокна PET (1)	THF: 15 мин; Na2СО3: 5%	60 мин при 50 г О3/м3 О2	Раствор SSNa 15% (масс.); 1 ч 30 мин при 65°С
Привитые волокна PET (2)	THF: 15 мин; Na2СО3: 5%	60 мин при 50 г О3/м3 О2	Раствор 15% SSNa и 15% AM (масс.); 1 ч 30 мин при 65°С

Затем были проведены различные испытания с целью биологической оценки, а именно роста культур фибробластов, а также адгезии фибробластов на этих различных поверхностях. Полученные результаты представлены в приведенной ниже таблице 2.

Таблица 2. Биологическая оценка
Параметры	PET без прививки	Привитый PET (1) и (2)
Количество слившихся клеток (культура на 24-луночном планшете)	1×105 клеток на лунку	1×105 клеток на лунку
Развитие фибробластов	Неоднородно распределенные вдоль волокон скопления	Однородное распределение по всей поверхности ткани
Морфология	Округленная форма	Удлиненная и растянутая форма
Усилие адгезии (относительные единицы)	1	5-8
Параметры	PET без прививки	Привитый PET (1) и (2)
Адсорбция коллагена типа I (относительная доля, нг/см2)	100	143

Таким образом, прививка биомиметических полимеров, в частности стиролсульфоната, на поверхности связок из полиэфира обеспечивает нормальное и равномерное развитие фибробластов на этой поверхности.

Обнаружено также, что обработанная поверхность имеет более высокое сродство к протеинам, что обеспечивает повышенную адгезию коллагена и других биохимических факторов, способствующих развитию колоний фибробластов. Ясно также, что связки, поверхность которых обработана согласно стадиям 1 и 2 способа, подвергнутые затем импрегнированию упомянутыми биохимическими факторами согласно стадии 3, обладают еще более высокой способностью к адгезии фибробластов и к ориентированию их развития в благоприятном направлении.

Наконец, очевидно, что способ биомиметической функционализации по настоящему изобретению может быть применен к любому типу протезов из полиэфира, для которых он обеспечивает улучшение биологической интеграции, и что приведенные примеры являются лишь иллюстрациями частных случаев и никоим образом не ограничивают область применения изобретения.

1. Способ обработки искусственных протезов из полиэфира, в частности из полиэтилентерефталата, с целью сообщения им способности к имитации живых материалов и особенно облегчения адгезии и развития фибробластов после имплантации упомянутых протезов, причем упомянутый способ биомиметической функционализации отличается тем, что он включает первую стадию подготовки полиэфирной поверхности в среде растворителя с последующей стадией прививки биологически активных полимеров или сополимеров к полиэфирной поверхности упомянутых протезов, причем эта стадия прививки состоит в осуществлении окисления поверхности с образованием пероксидных соединений путем озонирования с последующей стадией радикальной полимеризации раствора по меньшей мере одного мономера.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полиэтилентерефталат является полукристаллическим.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что длительность озонирования при содержании озона порядка 50 г/м³ составляет от 20 до 90 мин.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что мономером является стиролсульфонат натрия.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствор мономеров имеет концентрацию мономера (мономеров) в пределах от 5 до k %, где k - концентрация, близкая к пределу растворимости мономера (мономеров) в растворе.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что после первой стадии подготовки полиэфирной поверхности в среде растворителя перед осуществлением прививки выполняют дополнительную стадию подготовки в водной среде.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что среда растворителя состоит из гексана и диэтилового эфира.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что среда растворителя состоит из по меньшей мере одного растворителя, способного модифицировать поверхность путем набухания.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что растворитель, способный модифицировать поверхность путем набухания, относится к классу циклических или алифатических простых эфиров, имеющих низкую токсичность, или нетоксичных.

10. Способ по п.8, отличающийся тем, что растворитель, способный модифицировать поверхность путем набухания, имеет диэлектрическую постоянную, превышающую 30.

11. Способ по п.8, отличающийся тем, что растворитель, способный модифицировать поверхность путем набухания, выбран из группы, в которую входят тетрагидрофуран (ТГФ, THF), диметилсульфоксид (ДМСО, DMSO), N,N-диметилформамид (ДМФ, DMF), N,N-диметилацетамид (ДМАА, DMA), N-метилпирролидон (NMP).

12. Способ по п.6, отличающийся тем, что стадия подготовки поверхности в водной среде состоит в обработке полиэфирной поверхности при повышенной температуре водным раствором карбонатов щелочных или щелочноземельных металлов, например Na₂CO₃ или СаСО₃, с целью удаления присутствующих на поверхности остаточных загрязнений, введенных в процессе получения полиэфира.

13. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что он включает после стадии прививки дополнительную стадию импрегнирования протеза одним или несколькими биохимическими агентами, способствующими образованию колоний фибробластов.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что биохимическим агентом является протеин из семейства фибронектинов и/или коллаген типа I и/или типа III.

15. Искусственная связка из тканых или вязаных волокон PET, отличающаяся тем, что упомянутые волокна обработаны по способу, соответствующему любому из пп.1-14.