Способ очистки бактериального цитолизина

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ очистки бактериального цитолизина, такого как пневмококковый пневмолизин. Данный способ включает выращивание культуры клеток, экспрессирующих бактериальный цитолизин, приготовление экстракта из культуры, содержащей бактериальный цитолизин, связывание растворимого агрегированного бактериального цитолизина, содержащегося в экстракте, с гидрофобным хроматографическим сорбентом в присутствии детергента в условиях высокой концентрации соли и элюции бактериального цитолизина в присутствии детергента в условиях низкой концентрации соли. Одностадийная хроматография позволят более эффективно и просто очищать цитолизин посредством связывания растворимого агрегированного цитолизина с гидрофобным хроматографическим сорбентом в присутствии детергента и высокой концентрации соли. 40 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл.

 

Область применения

Настоящее изобретение относится к области очистки бактериальных цитолизинов и, в частности, к способу очистки пневмолизина. Пневмолизин представляет собой белок из Streptococcus pneumoniae, обладающий хорошими антигенными свойствами, который является подходящим компонентом вакцины против инфекции, вызываемой S. pneumoniae, или среднего отита. Способ по изобретению включает нестандартную и эффективную стадию очистки пневмолизина в одну хроматографическую стадию посредством его связывания с гидрофобной колонкой в присутствии детергента и высокой концентрации соли. В этом способе преимущественно используют такое свойство бактериальных цитолизинов, как их высокое сродство к ароматическим соединениям, подобным холестерину, в частности, в агрегированном состоянии, и поэтому этот способ будет широко применяться для очистки членов данного семейства токсинов.

Тиол-активированные цитолизины образуют известную группу бактериальных токсинов, наиболее известным из которых является стрептолизин О (BiHington et al., FEMS Microbiol. Lett. (2000), 182; 197-205). Эти токсины оказывают литическое действие на эукариотические клетки посредством образования пор в клеточной мембране. Окисляющие агенты отрицательно влияют на их цитолитическую активность, тогда как восстанавливающие агенты могут восстанавливать эту активность. Члены этой группы имеют 30-60% сходства в первичной аминокислотной последовательности и содержат почти константную ундекапептидную последовательность вблизи С-конца. Холестерин представляет собой главный рецептор в клетках-мишенях для этих токсинов. Цитолизины связываются с холестеринсодержащими мембранами и олигомеризуются с образованием трансмембранных пор, имеющих диаметр до 30 нм и состоящих из 40-80 мономерных субъединиц. Связывание мембранного холестерина вызывает конформационное изменение в мономере токсина, приводящее к последующим событиям олигомеризации, встраивания в мембрану и образования поры.

Streptococcus pneumoniae является возбудителем некоторых заболеваний человека, включающих в себя пневмонию, бактериемию, менингит, средний отит и синусит. Иногда эти заболевания могут приводить к смерти, несмотря на применение антибиотиков. Появление устойчивых к антибиотикам штаммов S. pneumoniae усугубляет проблемы, вызываемые этим патогеном. В связи с этим, важно разработать эффективные вакцины против S. pneumoniae.

Поливалентные пневмококковые вакцины, содержащие очищенные капсульные полисахариды, имеются в продаже уже в течение нескольких лет. Их применение ограничивается слабой иммуногенностью, особенно в группах высокого риска, включающих в себя детей в возрасте до 7 лет, пожилых людей и людей с серповидно-клеточной анемией, множественной миеломой, циррозом печени или алкоголизмом. Они также обеспечивают серотип-специфическую защиту, и только 23 из 90 известных серотипов охватываются существующими препаратами. Это будет обеспечивать защиту против 90% серотипов, обнаруженных в американской популяции, но только против примерно 70% серотипов, обнаруженных в азиатских популяциях. В последнее время стали применять конъюгированную семивалентную вакцину, которая имеет аналогичные проблемы защиты против всех пневмококковых штаммов.

Пневмолизин (Ply) представляет собой тиол-активированный цитолизин (53 кДа), обнаруженный во всех штаммах S. pneumoniae, который высвобождается при автолизе и вносит вклад в патогенез S. pneumoniae. Он представляет собой высококонсервативный белок лишь с несколькими аминокислотными заменами, встречающимися среди белков Ply различных серотипов. Высокая степень консервативности пневмолизина и его иммуногенность делают его возможным кандидатом в качестве компонента вакцины. Однако Ply дикого типа не пригоден для включения в вакцины для применения у людей из-за его токсичности. Ply вызывает повреждение в клеточных мембранах благодаря взаимодействию с мембранным холестерином и олигомеризации с образованием пор в мембране. Консервативный цистеинсодержащий мотив, обнаруженный вблизи С-конца, вовлечен в литическую активность. Предполагают, что мутации в Ply снижают эту токсичность (WO 90/06951, WO 99/03884).

Двухстадийный способ очистки пневмолизина был описан Lock с соавт. (Microbial. Pathogenesis (1996) 21; 71-83). Рекомбинантный пневмолизин очищали из культуры клеток E.coli, используя комбинацию ионообменной и гель-фильтрационной хроматографии. Этот способ включает стадии приготовления экстракта и пропускания его через колонку с ДЭАЭ-Сефарозой, а затем через колонку с Сефакрилом C200-HR. Этот способ может быть использован для очистки рекомбинантного или нативного пневмолизина.

Куо с соавт. описал способ очистки рекомбинантного слитого белка, состоящего из GST (глутатион-S-трансферазы) и пневмолизина (Infection and Immunity (1995) 63; 2706-2713). Слитый белок экспрессируют в культуре E.coli, и клеточный лизат наносят на глутатион-агарозный гель. Слитый белок элюируют глутатионом, а тромбин может быть использован для расщепления слитого белка. Белки снова пропускали через колонку с глутатион-агарозой для удаления GST. Аффинно очищенный пневмолизин затем очищали с использованием колоночной хроматографии на гидроксилапатите.

Mitchell с соавт. описал способ очистки пневмолизина с использованием гидрофобной хроматографии (ВВА (1989) 1007; 67-72). В условиях, которые использовали авторы (250 мМ соли), пневмолизин оказался неспособным прочно связываться с колонкой, несмотря на то, что его движение замедлялось, и пневмолизин элюировался в виде широкого пика. Дополнительные стадии определения того, какие фракции содержали чистый пневмолизин, концентрирование положительных фракций, повторное нанесение на колонку и элюция малым объемом воды были необходимы, для того чтобы преодолеть проблему, возникшую вследствие непрочного связывания пневмолизина с сорбентом колонки.

Существует постоянная потребность в улучшении вакцин против S. pneumoniae. Включение Ply компонента является перспективным, хотя токсичность этого белка остается проблемой. Необходима также разработка быстрой и эффективной методики очистки больших количеств пневмолизина. Описанные выше способы включают применение многостадийной очистки со стадиями промежуточного анализа и концентрирования. В настоящем изобретении предложен более эффективный способ очистки, в котором преимущественно используют одностадийную хроматографию, которая может быть использована для очистки больших количеств пневмолизина.

Описание графических материалов

Фиг.1 - Результаты электорофореза в ПААГ (полиакриламидном геле) с ДСН (додецилсульфатом натрия), демонстрирующие очистку пневмолизина. Следующие образцы подвергали электрофорезу в ПААГ с ДСН: дорожка 1 - стандарты молекулярных масс, дорожка 2 - супернатант клеточного экстракта, дорожка 3 - проскок через фенил-сефарозу, дорожка 4 - первая промывка фенил-сефарозы, дорожка 5 - вторая промывка фенил-сефарозы, дорожка 6 - промывка фенил-сефарозы 0,5 М NaCl, дорожка 7 - элюция фенил-сефарозы низкосолевым буфером, дорожка 8 - пневмолизин после стадий денатурации/ренатурации, дорожка 9 - пневмолизин после стерилизующей фильтрации.

Панель А демонстрирует гель после окрашивания кумасси голубым. Панель Б демонстрирует гель после процедуры вестерн-блоттинга с использованием антител к белкам E.coli для проверки на загрязнение этими белками.

Фиг.2 - Анализ методом электрофореза в ПААГ с ДСН пневмолизина, модифицированного GMBS (N-(γ-малеимидобутирилокси)сукцинимидным эфиром) и окрашенного кумасси голубым.

Следующие образцы подвергали электрофорезу в ПААГ с ДСН: дорожка 1 - стандарты молекулярных масс, дорожка 2 - немодифицированный пневмолизин, дорожка 3 - PLY, обработанный GMBS в молярном соотношении GMBS/лизин 4/1, дорожка 4 - PLY, обработанный GMBS в молярном соотношении GMBS/лизин 4/1 и инкубированный в течение 7 дней при 37°С, дорожка 5 - PLY, обработанный GMBS в молярном соотношении GMBS/лизин 8/1, дорожка 6 - PLY, обработанный GMBS в молярном соотношении GMBS/лизин 8/1 после инкубации в течение 7 дней при 37°С, дорожка 7 - PLY, обработанный сульфо-NHS (сульфо-N-гидроксисукцинимида) ацетатом в молярном соотношении NHS/лизин 10/1, дорожка 8 - PLY, обработанный NEM (N-этилмалеимидом), дорожка 9 - PLY, обработанный NEM после инкубации в течение 7 дней при 37°С.

Фиг.3 - Токсичность GMBS-обработанного пневмолизина, вводимого мышам интраназально. Линия, обозначенная ромбиками, показывает выживаемость мышей, зараженных 2 мкг нативного пневмолизина. Линия, обозначенная квадратиками, показывает выживаемость мышей, зараженных 10 мкг GMBS-обработанного пневмолизина.

Фиг.4 - Защита, индуцированная GMBS-обработанным пневмолизином у мышей, зараженных интраназально нативным пневмолизином. Линия, обозначенная прямоугольниками, показывает выживаемость мышей, привитых только адъювантом. Линия, обозначенная ромбиками, показывает выживаемость мышей, привитых нативным пневмолизином. Линия, обозначенная квадратиками, показывает выживаемость мышей, привитых 10 мкг GMBS-обработанного пневмолизина.

Фиг.5 - Защита, индуцированная прививкой PhtD и GMBS-обработанным пневмолизином у мышей, зараженных интраназально пневмококковым штаммом D39 типа 2. Линия, обозначенная прямоугольниками, представляет выживаемость мышей, привитых только адъювантом. Линия, обозначенная ромбиками, представляет выживаемость мышей, привитых PhtD. Линия, обозначенная квадратиками, представляет выживаемость мышей, привитых PhtD и GMBS-обработанным пневмолизином.

Подробное описание

Способы

Способ по изобретению представляет собой способ очистки такого бактериального цитолизина, как пневмолизин. Цитолизин, например пневмолизин, очищают, используя только одну стадию колоночной хроматографии, не требующую повторного нанесения на колонку. Белок в агрегированной форме связывается с гидрофобной колонкой в присутствии детергента и соли. В этих условиях некоторые белки связываются с колонкой, что позволяет выполнить очистку цитолизина в одну стадию.

Для целей данного изобретения растворимый агрегат цитолизина, предпочтительно пневмолизина, представляет собой агрегированную форму цитолизина, которая остается в супернатанте после центрифугирования при 30000g в течение 20 минут. Растворимый агрегат удерживается на гидрофобном хроматографическом сорбенте, предпочтительно фенил-сефарозе, в присутствии высокой концентрации соли, предпочтительно 1 М. Возможно, растворимый агрегат является коллоидным.

Цитолизин, предпочтительно пневмолизин, связывается с колонкой в форме растворимого агрегата. Нанесение агрегатов на колонку является нетрадиционным приемом по разным причинам, включая закупорку колонки или фильтров и потерю материала. Однако благодаря использованию детергента, который уменьшает размер агрегатов с образованием растворимого агрегата, обнаружено, что эти агрегаты прочно связываются с колонкой при денатурирующих условиях, но могут быть элюированы с чистотой по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, предпочтительно 90%, 95%, более предпочтительно 97%, 98%, 99%, как определено с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН, без неблагоприятного воздействия на фильтры колонки. Способ предпочтительно дает выход по меньшей мере 100, 200, 500, 700, более предпочтительно 1000, 1500, 1700 или 1900 мг цитолизина, предпочтительно пневмолизина, на литр ферментации. Предпочтительно, по меньшей мере, 1%, 2%, 5%, 7%, 9% или 10% белка из ферментирующей культуры извлекают в виде очищенного цитолизина, предпочтительно пневмолизина.

В способе используют способность цитолизинов, таких как пневмолизин, связываться с холестерином и другими ароматическими соединениями. Это связывание является особенно прочным в том случае, когда цитолизин агрегирован, позволяя цитолизину связываться в присутствии детергента. Этот способ может быть распространен на другие члены семейства цитолизинов, поскольку все члены обладают способностью связываться с ароматическими соединениями и образовывать поры. В действительности, этот способ может быть использован для очистки других семейств белков, которые связываются с холестерином или другими ароматическими соединениями и/или образуют поры, предпочтительно и то, и другое.

Согласно первому воплощению предложен способ очистки бактериального цитолизина, включающий стадии:

а) выращивания культуры клеток, экспрессирующих бактериальный цитолизин;

б) приготовления экстракта из культуры, содержащей бактериальный цитолизин;

в) связывания растворимого агрегированного бактериального цитолизина, содержащегося в экстракте, с гидрофобным хроматографическим сорбентом в присутствии детергента (предпочтительно алифатического детергента) при высокой концентрации соли (предпочтительно 0,5-2 М соли);

г) элюции бактериального цитолизина в присутствии детергента (предпочтительно алифатического детергента) при низкой концентрации соли (предпочтительно 0-0,2 М соли).

Во втором воплощении предложен способ очистки бактериального цитолизина, включающий стадии:

а) выращивания культуры клеток, экспрессирующих бактериальный цитолизин;

б) приготовления экстракта из культуры, содержащей бактериальный цитолизин;

в) связывания бактериального цитолизина, содержащегося в экстракте, с гидрофобным хроматографическим сорбентом в присутствии раствора, содержащего 0,5-2 М соли и 0,1-5% детергента;

г) элюции бактериального цитолизина с использованием раствора с низкой концентрацией соли (предпочтительно 0-0,2 М соли), содержащего 0,1-5% детергента.

В любом из вышеуказанных воплощений способ по изобретению предпочтительно включает дополнительные стадии:

д) удаления детергента из бактериального цитолизина;

е) солюбилизации бактериального цитолизина путем добавления денатурирующего агента;

ж) удаления денатурирующего агента из бактериального цитолизина.

Способ по изобретению может быть использован преимущественно для очистки пневмококкового пневмолизина. Другие цитолизины, которые могут быть очищены этим способом по изобретению, включают в себя пиолизин из A. pyogenes, цереолизин из В. cereus, турингиолизин О из В. thuringiensis, латероспоролизин из В. latersporus, биферментолизин из С. bifermentans, ботулинолизин из С. botulinum, шовулизин (chauveolysin) из С. chauvoel, гистолитиколизин из С. histolyticum, эдематолизин из С. novyi типа А, перфринголизин О из С. perfringens, септиколизин из С. septicum, сорделлилизин из С. sordellii, тетанолизин из С. tetani, иванолизин О из L. ivanovi, листериолизин О из L. monocytogenes, зеелигерилизин (seeligerilysin) О из L. seeligeri, альвеолизин из Р. alvei, стрептолизин О из S. pyogenes, S. canis или S. equisimilis, интермедилизин из S. intermedius, суилизин из S. suis или пневмолизин из S. pneumoniae, которые могут быть токсинами дикого типа или генетически модифицированными токсинами с низкими уровнями токсичности, такие как PdA и PdB, описанные выше.

Под пневмолизином или Ply подразумевается нативный пневмолизин из пневмококка или рекомбинантный пневмолизин, пневмолизин дикого типа или мутантные формы пневмолизина (например, пневмолизины, описанные в WO 90/06951 и WO 99/03884). Возможно, пневмолизин может также означать любой фрагмент пневмолизина или любой вариант пневмолизина, который имеет 70, 80, 90 или 95% идентичности аминокислотной последовательности пневмолизина дикого типа, который все еще сохраняет способность очищаться способами по изобретению, что легко определит специалист в данной области техники.

В предпочтительных воплощениях по изобретению один и тот же детергент присутствует на стадиях (б) и (в), (б) и (г), (в) и (г), более предпочтительно на стадиях (б), (в), (г), предпочтительно в концентрации 0,1%-5% (масс./об.). Для целей данного изобретения алифатический детергент определяют как по существу алифатический детергент с недостаточным ароматическим характером для предупреждения связывания цитолизина с колонкой на стадии (в). Предпочтительно детергент будет иметь одно или меньше ароматических колец, более предпочтительно не будет иметь ни одного ароматического кольца. На стадии (б) детергент преимущественно разрушает более крупные агрегаты цитолизина до меньших агрегатов, которые образуют растворимый агрегат. На стадиях (в) и (г) детергент преимущественно сохраняет растворимое агрегированное состояние цитолизина, позволяя ему с высокой аффинностью связываться с колонкой при высокой концентрации соли.

Цитолизин, предпочтительно пневмолизин, экспрессируется в культуре бактериальных клеток, предпочтительно S. pneumoniae, E.coli или, альтернативно, в дрожжевых клетках, клетках насекомых, клетках млекопитающих или в любой другой экспрессионной системе, подходящей для его экспрессии. В экспрессионных системах, которые дают высокие выходы пневмолизина, пневмолизин часто агрегирует сам по себе, и способ по изобретению является идеальным для его очистки. Предпочтительно пневмолизин экспрессируется с высокими выходами, так что его содержание составляет в итоге более 2, 3, 4, 5, 7 или 10% тотального белка в экспрессионной системе. Предпочтительно пневмолизин находится в агрегированной форме и поэтому в основном не имеет гемолитической активности. Например, экспрессия в Е.coli в ферментере под промотором фага λ или другими промоторами, которые разрешают высокий уровень экспрессии, хорошо известны специалистам в данной области техники.

Предпочтительно цитолизин выделяют из экспрессионной системы в виде агрегата. Альтернативно экспрессионная система с меньшим выходом может обеспечить растворимый цитолизин. В этом случае рН экстракта, содержащего цитолизин, предпочтительно пневмолизин, доводят до значения ниже 7,5, что позволяет цитолизину агрегировать в течение по меньшей мере 8 часов, предпочтительно по меньшей мере 24 часов.

Приготовление экстракта на стадии (б) предпочтительно включает одну или более чем одну стадию механического разрушения клеток и/или обработки клеток детергентом. Если цитолизин получен способом с высоким выходом, он остается в форме агрегатов, но эти агрегаты должны быть достаточно маленькими, для того чтобы оставаться в супернатанте после центрифугирования образца в условиях, необходимых для осаждения нерастворимого клеточного дебриса. Предпочтительно используемый детергент согласно изобретению представляет собой алифатический детергент, который не содержит ароматических колец, предпочтительно ионный детергент, более предпочтительно катионный или анионный детергент и более предпочтительно лауроилсаркозинат натрия. Предпочтительные детергенты способны солюбилизировать цитолизин, при этом оставляя его в форме маленьких агрегатов, которые связываются с гидрофобной колонкой, не вызывая закупорки фильтров, присоединенных к колонке. Предпочтительные детергенты способны уменьшать размер агрегатов пневмолизина, позволяя агрегатам пневмолизина становиться достаточно маленькими, для того чтобы оставаться в супернатанте после центрифугирования образца при 30000g в течение 20 минут. Такие растворимые агрегаты очищаются как таковые на гидрофобной колонке. Детергент присутствует в концентрации 0,1-5%, предпочтительно от 0,5% до 3% (масс./об.), более предпочтительно 0,75-2%, наиболее предпочтительно примерно 1%. Предпочтительно детергент можно отдиализовать.

После механического разрушения клеток культуры и/или разрушения их с помощью детергента на стадии (б) способ по изобретению включает цетрифугирование клеточного материала и сбор супернатанта в виде экстракта, который следует наносить на хроматографический сорбент на стадии (в). Цитолизин предпочтительно присутствует в супернатанте в виде растворимых агрегатов.

В способе по изобретению используют гидрофобную хроматографию для очистки пневмолизина в одну стадию. Колоночный сорбент на стадии (в) предпочтительно содержит ароматические группы, предпочтительно фенильные группы и более предпочтительно представляет собой фенил-сефарозу.

Раствор, используемый на стадии (в) и/или стадии (г) во время нанесения и элюции с колонки, содержит ионный детергент, предпочтительно катионный или анионный детергент, предпочтительно детергент, который растворим при концентрациях соли выше 0,5 М, более предпочтительно этот детергент представляет собой лауроилсаркозинат натрия. Используемый детергент представляет собой детергент, который будет уменьшать размер агрегатов цитолизина, предпочтительно пневмолизина, позволяя цитолизину присутствовать в образце в виде растворимого агрегата, так что он будет связываться с гидрофобными колоночным сорбентом без необратимого застревания на колонке. Детергент присутствует в концентрации предпочтительно 0,1-5%, предпочтительно 0,5-3% (масс./об.), более предпочтительно 0,75-2%, наиболее предпочтительно примерно 1%.

Раствор, используемый на стадии (в) и/или (г), содержит соль, предпочтительно соль, выбранную из группы, состоящей из хлорида натрия, хлорида магния, хлорида аммония, сульфата натрия, сульфата магния, сульфата аммония, фосфата натрия, фосфата магния, фосфата аммония, и является предпочтительно забуференным при рН 6-8, предпочтительно при рН около 7. Может быть использован любой буфер, способный поддерживать рН в диапазоне от 5 до 9.

Раствор, используемый для связывания цитолизина с колонкой, в способе по изобретению содержит высокую концентрацию соли, предпочтительно 0,6-2 М, более предпочтительно примерно 1 М. Концентрацию соли выбирают таким образом, чтобы пневмолизин оставался в растворимой агрегированной форме и был способен связываться с гидрофобным хроматографическим сорбентом.

Возможно, стадия (в) может включать дополнительную стадию промывки колонки при промежуточной концентрации соли около 0,5 М или концентрации соли, способствующей удалению любых слабо связанных примесей.

В способе по изобретению используют нисходящий градиент соли для элюции пневмолизина с колонки. Предпочтительно, раствор с низкой концентрацией соли, используемый для создания градиента соли на стадии (г), содержит 0-0,1 М соли, более предпочтительно 0-40 мМ соли. Альтернативно может быть использована ступенчатая элюция низкосолевым буфером, используемым на стадии (г), содержащим 0-0,2 М соли, более предпочтительно 0-40 мМ соли.

К способу по изобретению могут быть добавлены возможные стадии, если это предпочтительно для денатурации пневмолизина и последующей его ренатурации посредством удаления денатурирующего агента. Эти возможные стадии гарантируют получение чистого цитолизина, предпочтительно пневмолизина, с нативной структурой. Первая возможная стадия (д) включает удаление детергента диафильтрацией, диализом или разбавлением. Эта стадия предпочтительно включает диафильтрацию/диализ против буфера с рН 8-10, предпочтительно около 9, более предпочтительно, чтобы буфер был способен поддерживать щелочные значения рН, наиболее предпочтительно буфер представляет собой ДЭА (диэтаноламин). Раствор предпочтительно имеет низкую ионную силу, предпочтительно 10-50 мМ, более предпочтительно около 25 мМ. Диафильтрацию или диализ предпочтительно проводят при 4°С, но в качестве альтернативы проводят при комнатной температуре.

На второй возможной стадии цитолизин, предпочтительно пневмолизин, денатурируют и солюбилизируют путем добавления денатурирующего агента. Предпочтительно денатурирующий агент, используемый на стадии (е), представляет собой гуанидингидрохлорид, более предпочтительно 5-8 М гуанидингидрохлорида, наиболее предпочтительно примерно 6 М гуанидингидрохлорида. Пневмолизин инкубируют с гуанидингидрохлоридом в течение по меньшей мере 10 минут, предпочтительно в течение по меньшей мере 1 часа, более предпочтительно в течение примерно 1 часа.

Цитолизин, предпочтительно пневмолизин, затем приводят в контакт с 5-9 М мочевины, предпочтительно примерно 8 М мочевины на стадии (е). Этого достигают путем диафильтрации или диализа цитолизина, предпочтительно пневмолизина против мочевины. Предпочтительно, один и тот же буфер и рН поддерживают во время смены денатурирующего агента. Предпочтительно, во время смены денатурирующего агента добавляют восстанавливающий агент (ДТТ (дитиотреитол), 2-меркаптоэтанол или глутатион).

Предпочтительно, стадия (е) включает приведение цитолизина, предпочтительно пневмолизина, в контакт с 5-8 М гуанидингидрохлорида с последующей заменой гуанидингидрохлорида на 5-9 М мочевины.

Для того чтобы предотвратить образование нежелательных дисульфидных связей, образующихся в процессе денатурации цитолизина, предпочтительно пневмолизина, желательно обеспечить присутствие восстанавливающего агента по меньшей мере на стадиях (е) и (ж). Предпочтительным восстанавливающим агентом является 0,1-10 мМ ДТТ, предпочтительно примерно 1 мМ ДТТ. Альтернативно используют глутатион или 2-меркаптоэтанол. Предпочтительная концентрация глутатиона составляет 1-50 мМ, более предпочтительно 10-30 мМ.

Возможная стадия (ж) включает удаление денатурирующего агента для ренатурации цитолизина, предпочтительно пневмолизина, предпочтительно путем диафильтрации или диализа против низкосолевого буфера с рН 6-11, предпочтительно с рН около 9. Предпочтительно концентрацию цитолизина, предпочтительно пневмолизина, поддерживают на уровне по меньшей мере 100 мкг/мл, предпочтительно 100-1000 мкг/мл, более предпочтительно около 500 мкг/мл. Возможно, диафильтрацию или диализ проводят против буфера, содержащего пропиленгликоль от 10 до 30%, предпочтительно примерно 15%. Предпочтительно восстанавливающий агент, как описано выше, оставляют на стадии (ж). Диафильтрацию или диализ предпочтительно проводят при 4°С, но в качестве альтернативы проводят при комнатной температуре.

Следующая возможная стадия (з) включает удаление восстанавливающего агента после того, как цитолизин, предпочтительно пневмолизин, был ренатурирован. Этого предпочтительно достигают путем диафильтрации или диализа против низкосолевого буфера с рН 6-11, предпочтительно с рН около 9. Возможно, диафильтрацию или диализ проводят против буфера, содержащего пропиленгликоль от 10 до 30%, предпочтительно примерно 15%. Диафильтрацию или диализ предпочтительно проводят при 4°С, но в качестве альтернативы проводят при комнатной температуре.

В предпочтительных способах по изобретению цитолизин, предпочтительно пневмолизин, ренатурируют таким образом, чтобы его гемолитическая активность восстанавливалась до уровня выше 25%, 50%, 75%, более предпочтительно до уровня выше 90% активности правильно уложенного белка. Для целей данного изобретения 'уложенный' (folded) белок представляет собой белок, имеющий третичную структуру белка, полученного способом при неденатурирующих условиях. В случае пневмолизина дикого типа ожидаемая гемолитическая активность ренатурированного цитолизина составляет 500000-1000000 гемолитических единиц/мг пневмолизина. В случае пневмолизина с точечной мутацией, имеющего сниженную гемолитическую активность, гемолитическая активность ренатурированного цитолизина будет соответственно ниже.

Детоксикация токсина

Цитолизин, очищенный способом по изобретению, предпочтительно пневмолизин, может быть подвергнут дополнительной возможной стадии детоксикации путем химической обработки. Эта дополнительная стадия является особенно предпочтительной, если цитолизин, предпочтительно пневмолизин, будет вводиться животным или человеку. Пневмолизин дикого типа высокотоксичен. Было выделено несколько мутантных белков пневмолизина, которые имеют пониженную токсичность, однако они все же сохраняют остаточную токсичность, которая может создавать проблемы при введении пневмолизина в организм (WO 99/03884, WO 90/06951). Альтернативно он может быть детоксицирован путем конъюгирования с полисахаридами (WO 96/05859).

Способом по изобретению можно детоксицировать цитолизин, например пневмолизин, как дикого типа, так и мутантный, путем химической обработки. В предпочтительных воплощениях используют сшивающий агент, более предпочтительно содержащий одно или более чем одно химическое соединение, выбранное из группы, состоящей из формальдегида, глутаральдегида и сшивающего агента, содержащего N-гидроксисукцинимидную эфирную и/или малеимидную группировку (например GMBS).

Сами способы детоксикации являются аспектом изобретения и могут быть использованы для детоксикации бактериальных токсинов, предпочтительно пневмолизина, полученного другими способами.

В одном воплощении способ детоксикации по изобретению описывает детоксикацию бактериального токсина, включающую обработку токсина химическим соединением, предпочтительно сшивающим агентом, который взаимодействует, предпочтительно избирательно взаимодействует, более предпочтительно специфически взаимодействует с аминогруппами, более предпочтительно с первичными аминогруппами.

Для целей этой заявки сшивающий агент определяют как соединение с по меньшей мере двумя реакционноспособными группами, из которых по меньшей мере одна группа способна взаимодействовать с по меньшей мере одной группой на бактериальном токсине. Еще одна реакционноспособная группа способна взаимодействовать как с группой на бактериальном токсине, так и с отдельным соединением (например, аминокислотой, пептидом, полипептидом, углеводом или полисахаридом).

Предпочтительно химическое соединение или сшивающий агент взаимодействует, более предпочтительно избирательно взаимодействует, наиболее предпочтительно специфически взаимодействует с амино- и сульфгидрильными группами. Предпочтительно химическое соединение взаимодействует с первичной аминогруппой лизина, более предпочтительно сшивающий агент взаимодействует с первичной аминогруппой лизина и сульфгидрильной группой цистеина. Этот способ особенно предпочтителен при детоксикации пневмолизина, поскольку модификация остатков как цистеина, так и лизина ведет к синергическому снижению уровня гемолиза по сравнению с остаточной гемолитической активностью в том случае, когда сшивающий агент взаимодействует только с лизином или цистеином.

Таким образом, согласно альтернативному воплощению предложен способ детоксикации бактериальных токсинов, включающий модификацию цистеинового остатка (возможно, вблизи С-конца токсина), вовлеченного в токсическую активность токсина (предпочтительно литическую активность), включающий обработку токсина сшивающим агентом (предпочтительно гетеробифункциональным сшивающим агентом), который перекрестно сшивает сульфгидрильные группы с другой аминокислотой токсина, расположенной в первичной структуре предпочтительно на расстоянии более 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40 аминокислот от цистеина. Предпочтительно другая аминокислота содержит первичную аминогруппу, и более предпочтительно эта аминокислота представляет собой лизин.

В некоторых воплощениях более 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% токсина сохраняет молекулярную массу в пределах 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%, более предпочтительно 1-50%, наиболее предпочтительно 5-10% от его первоначальной молекулярной массы после обработки, как определено с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН. Предпочтительно токсин приобретает несколько более высокую молекулярную массу после детоксицирующей обработки вследствие того, что несколько аминокислотных остатков модифицируются путем ковалентного связывания с химическим соединением. Однако способ по изобретению предпочтительно не включает экстенсивное конъюгирование токсина либо путем его ковалентного связывания с другими молекулами токсина с образованием токсина с мультимерной четвертичной структурой, либо путем ковалентного связывания токсина с другими большими белками, полисахаридами или липополисахаридами. Наиболее предпочтительно, чтобы способы, белки или продукты, раскрытые в WO 96/05859, не охватывались данным изобретением.

Способ по изобретению может быть использован для детоксикации бактериальных токсинов. Предпочтительные токсины включают в себя тиол-активируемые цитолизины: пиолизин из A. pyogenes, цереолизин из В. cereus, турингиолизин О из B. thuringiensis, латероспоролизин из В. latersporus, биферментолизин из С. bifermentans, ботулинолизин из С. botulinum, шовулизин (chauveolysin) из С. chauvoel, гистолитиколизин из С. histolyticum, эдематолизин из С. novyi типа А, перфринголизин О из С. perfringens, септиколизин из С. septicum, сорделлилизин из С. sordellii, тетанолизин из С. tetani, иванолизин О из L. ivanovi, листериолизин О из L. monocytogenes, зеелигерилизин (seeligerilysin) О из L. seeligeri, альвеолизин из Р. alvei, стрептолизин О из S. pyogenes, S. canis или S. equisimilis, интермедилизин из S. intermedius, суилизин из S. suis или пневмолизин из S. pneumoniae, которые могут представлять собой токсины дикого типа или генетически модифицированные токсины с низкими уровнями токсичности, такие как PdA и PdB, описанные выше (WO 90/06951 и WO 99/03884).

Способ может быть также использован для детоксикации нейссериальных токсинов FrpA, FrpC (WO 92/01460), FrpB (Microbiology 142; 3269-3274, (1996); J. Bacteriol. 181; 2895-2901 (1999)), NM-ADPRT (13^th International Pathogenic Neisseria Conference 2002 Masignani et al., p.135). FrpA и FrpC содержат участок, который является консервативным у этих двух белков, и предпочтительный фрагмент данных токсинов будет представлять собой полипептид, включающий этот консервативный участок, предпочтительно содержащий аминокислоты 227-1004 последовательности FrpA/C.

Способ по изобретению может быть также использован для детоксикации токсинов бордетелл, включая аденилатциклазу (СуаА) (Glaser (1988) Mol. Microbiol. 2; 19-30), дермонекротический токсин (Livey (1984) J. Med, Microbiol. 17; 91-103) и коклюшный токсин (РТ от англ. pertussis toxin) (Munoz et al. (1981) Infect Immun 33; 820-826). Способ по изобретению также используют для детоксикации столбнячного токсина (ТТ от англ. tetanus toxin), дифтерийного токсина (DT от англ. diphtheria toxin) и токсинов из S. aureus и S. epidermidis, включая аутолизин и гемолизин (WO 01/98499, WO 02/59148).

Способы по изобретению приводят к снижению величины токсичности и/или гемолитической активности токсина по меньшей мере на 90%, предпочтительно на 95%, 96%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или 99,99%. Гемолитическую активность измеряют, используя способ из примера 3, а токсичность может быть измерена способом из примера 5. Нативный пневмолизин имеет гемолитическую активность 500000-1000000 единиц на мг пневмолизина. Некоторые варианты пневмолизина с точечной мутацией имеют пониженные токсичность и гемолитическую активность. Детоксикация варианта пневмолизина может не давать такого большого процентного снижения гемолитической активности из-за более низкой исходной точки, с которой снижается гемолитическая активность, однако предполагают, что большая часть оставшейся гемолитической активности удаляется способами по изобретению.

На стадии детоксикации в способе по изобретению предпочтительно предложена реакция перекрестного сшивания, которая по существу является необратимой. Обратимость оценивают путем мониторинга гемолитической активности детоксицированного токсина непосредственно после детоксикации и после инкубации при температуре около 25°С, предпочтительно выше 30°С, более предпочтительно выше 35°С, наиболее предпочтительно выше 37°С в течение по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней. По существу необратимая реакция приводит к по существу необратимой детоксикации и определяется как реакция, в которой уровень гемолитической активности возрастает менее чем на 100%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% после инкубации при повышенной температуре, как описано выше. Многие способы детоксикации, например с использованием формальдегидной обработки, приводят к детоксикации, которая является нестабильной и со временем усиливает токсичность.

В предпочтительной стадии детоксикации в способе по изобретению более 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% токсина сохраняет мономерную четвертичную структуру после реакции перекрестного сшивания. Многие сшивающие агенты образуют межмолекулярные перекрестные сшивки (например, формальдегид или глутаральдегид). Это может влиять на иммунологические свойства токсина, поскольку некоторые эпитопы будут скрыты внутри агрегата. Способы по изобретению предпочтительно включают простую модификацию аминокислотных остатков, предпочтительно сульфгидрильных и/или первичных аминогрупп аминокислот, и/или образование преимущественно внутримолекулярных сшивок. Полученная в результате мономерная четвертичная структура позволяет эпитопам оставаться экспонированными на поверхности токсина.

В предпочтительном воплощении стадии детоксикации сшивающий агент является бифункциональным. Предпочтительные сшивающие агенты содержат N-гидроксисукцинимидную эфирную группу, которая избирательно, более предпочтительно специфически взаимодействует с первичными аминогруппами. Предпочтительно сшивающий агент содержит малеимидную группу, которая избирательно, более предпочтительно специфически взаимодействует с сульфгидрильными группами. При рН около 7 малеимидная группа взаимодействует с сульфгидрильными группами в 1000 раз быстрее, чем с аминогруппами. Предпочтительно сшивающий агент содержит как N-гидроксисукцинимидную эфирную группу, так и малеимидную группу. Сшивающий агент предпочтительно не расщепляется при использовании восстанавливающего агента, так как это приводит к менее эффективной детоксикации.

Расстояние между реакционноспособными группами сшивающего агента может влиять на эффективность детоксикации. Предпочтительно, расстояние между группами сшивающего агента, которые взаимодействуют с амино- и сульфгидрильными группами, составляет 1,5-20 ангстрем, более предпочтительно 5-15 ангстрем и наиболее предпочтительно примерно 10 ангстрем согласно способу по изобретению. Предпочтительно аминокислотные остатки в бактериальном токсине модифицируют путем добавления группы, длина которой составляет более 5, 7, 10, 12, 15, 18, 20, 50, 100, 500 ангстрем. Предпочтительно размер модифицирующей группы составляет 5-100 ангстрем, более предпочтительно 10-20 ангстрем.

Стадия детоксикации в способе по изобретению позволяет модифицировать достаточное количество остатков таким образом, чтобы стерические затруднения и/или конформационные изменения ингибировали функцию бактериального токсина. Предпочтительно модифицируются по меньшей мере 5, 7, 10, 12, 14, 15, 20 или 25 аминокислотных остатков бактериального токсина. В случае, когда на сшивающем агенте присутствуют непрореагировавшие малеимидные группы, для непрямой оценки числа сшивающих молекул, присоединенных к каждой молекуле токсина, может быть использована реакция Эллмана (Ellman, Arch. Biochem. Biophys. (1959) 82; 70).

Предпочтительными сшивающими агентами являются SMPT, сульфо-LC-SMPT, сульфо-KMUS, LC-SMCC, KMUA, сульфо-LC-SPDP, LC-SPDP, SMPB, сульфо-SMPB, SMPH, сульфо-SMCC, SMCC, SIAB, сульфо-SIAB, GMBS (GMBS N-(γ-малеимидобутирилокси)сукцинимидный эфир), сульфо-GMBS, MBS, сульфо-МВС, сульфо-EMCS, ЕМСА, EMCS, BMPS, SPDP, SBAP, BMPA, AMAS, SATP и SIA (Pierce).

В предпочтительном способе по изобретению токсин обрабатывают химическим соединением или сшивающим агентом в условиях, при которых рН составляет 5,0-9,0, предпочтительно 6,5-8,0, более предпочтительно 7,0-7,8. В обработках, способствующих взаимодействию малеимидной группы с сульфгидрильной группой, предпочтительное значение рН реакции составляет 6,0-8,0, более предпочтительно 6,5-7,5. Предпочтительная концентрация солей во время реакции составляет от 100 мМ до 1 М, более предпочтительно 150-500 мМ, наиболее предпочтительно 200-300 мМ. Однако авторы изобретения обнаружили, что иногда предпочтительнее проводить реакцию при низкой концентрации соли без добавления хлорида натрия или другой соли. В том случае, когда реакцию проводят при рН от 7,6 до 7,8, реакция возможно может быть проведена без добавления соли. Аналогично применение более высоких соотношений GMBS к токсину может осуществляться без добавления соли при рН в интервале 7,0-8,0.

Предпочтительно используют 50-500, более предпочтительно 130-350 или 350-900, более предпочтительно примерно 250-кратный молярный избыток химического соединения или сшивающего агента по отношению к каждому токсину. Пневмококковый пневмолизин содержит 31 остаток лизина. Поэтому 248-кратный молярный избыток химического соединения или сшивающего агента относительно пневмолизина эквивалентен 8-кратному молярному избытку химического соединения или сшивающего агента к каждому остатку лизина. В способах по изобретению используют предпочтительно 2-20, более предпочтительно 4-15 или 15-30, наиболее предпочтительно 8-кратное молярное соотношение химического соединения или сшивающего агента к остаткам лизина.

Обработка сшивающим агентом длится в течение по меньшей мере 15 минут, предпочтительно в течение по меньшей мере 30 минут, наиболее предпочтительно в течение примерно одного часа при 4-40°С, предпочтительно при 15-25°С, наиболее предпочтительно при комнатной температуре. Способ по изобретению дополнительно может включать стадию блокирования с использованием соединения, содержащего сульфгидрильную группу, предпочтительно гасящее соединение имеет молекулярную массу более 50, 100 или 120, более предпочтительно блокирующее соединение представляет собой аминокислоту, такую как цистеин. Альтернативно указанные группы могут взаимодействовать с пептидной или полисахаридной группировкой, способной взаимодействовать с малеимидом, например с пептидом, содержащим остаток цистеина. Это особенно является подходящим, когда непрореагировавшая малеимидная группа присутствует до начала стадии блокирования.

Стадия детоксикации подходит для применения к бактериальным токсинам, описанным выше. Предпочтительно бактериальный токсин выделен из Streptococcus pneumoniae, наиболее предпочтительно токсин представляет собой пневмолизин. Пневмолизин является нативным или рекомбинантным белком или белком, который был генетически сконструирован для снижения его токсичности (как описано выше). Слитые белки токсинов, предпочтительно пневмолизина, или фрагментов токсинов, предпочтительно пневмолизина, могут быть детоксицированы с использованием способа по изобретению.

Таким образом, в предпочтительном воплощении токсин (такой как пневмолизин) детоксицируют с помощью сшивающего агента, который предпочтительно является бифункциональным, имеющим группы, взаимодействующие с остатками лизина и цистеина, и имеет определенный размер, наиболее предпочтительно имеет реакционные группы, расположенные на расстоянии 10-20 ангстрем друг от друга, так что любая из двух или предпочтительно обе следующие реакции имеют место:

а) 5-30, предпочтительно примерно 12-14 аминокислотных остатков токсина модифицируют посредством ковалентного связывания сшивающей молекулы предпочтительно с остатком лизина или аргинина (предпочтительно, как определено косвенно с помощью реакции Эллмана), при этом другой конец блокирован (предпочтительно цистеином), и/или

б) боковую цепь цистеина, вовлеченную в токсическую активность токсина (предпочтительно вблизи С-конца токсина), перекрестно сшивают с другой боковой цепью токсина (предпочтительно с остатком лизина или аргинина), который в первичной последовательности токсина предпочтительно отделен более чем 2, 5, 10, 20, 30, 40 аминокислотами от остатка цистеина.

В еще одном предпочтительном воплощении токсин (предпочтительно пневмолизин) детоксицируют с помощью монофункционального химического соединения, которое предпочтительно взаимодействует с аминокислотами, содержащими первичную аминогруппу, более предпочтительно лизин, и имеет определенный размер, наиболее предпочтительно 10-100 ангстрем, так что токсин покрывается 5-30, более предпочтительно примерно 14-ангстремным химическим соединением, связанным с аминокислотными остатками.

Конъюгаты с полисахаридами

Проблема, связанная с использованием полисахаридов в вакцинации, состоит в том, что полисахариды сами по себе являются слабыми иммуногенами. Для того чтобы преодолеть эту проблему, полисахариды могут быть конъюгированы с белками-носителями, которые обеспечивают неспецифический Т-хелперный ответ. Способ по изобретению может преимущественно включать дополнительную стадию конъюгирования цитолизина, предпочтительно пневмолизина, с бактериальным полисахаридом, например липоолигосахаридом или предпочтительно капсульным полисахаридом.

Предпочтительный конъюгат по изобретению включает в себя цитолизин, предпочтительно пневмолизин, полученный способом по изобретению, конъюгированный с капсульными полисахаридами, происходящими из Streptococcus pneumoniae. Пневмококковые капсульные полисахаридные антигены предпочтительно выбраны из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F (наиболее предпочтительно из серотипов 1, 3, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18С, 19F, и 23F), или смесей двух или более указанных конъюгатов (4, 7, 9, 11, 13 или 23).

Цитолизин, предпочтительно пневмолизин, очищенный способом по изобретению, также предпочтительно конъюгируют с капсульными полисахаридами из других штаммов бактерий. Такие полисахариды могут быть выделены, например, из Н. influenzae, H. influenzae типа В (Hib), N. meningitides групп А, С, W, Y, стрептококков, отличных от S. pneumoniae (например, стрептококка группы В, S. pyogenes и т.д.), стафилококка (например, S. aureus, S. epidermidis), E.coli, энтерококка (например, Е. faecalis и Е. faecium) и т.д. Предпочтительно, полисахариды выделены из Н. influenzae типа В (Hib) и/или N. meningitides групп А, С, W135 и/или Y.

Полисахарид может быть пришит к цитолизину, предпочтительно пневмолизину, любым известным способом (например, способом, разработанным Likhite, патент US 4372945; и Armor с соавт., патент US 4474757). Предпочтительно осуществляют конъюгирование с помощью CDAP (1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторбората) (WO 95/08348). Для усиления иммуногенности полисахариды могут быть дополнены адъювантами и/или лиофилизированы. Полисахариды по изобретению могут быть полноразмерными или с заданным размером после очистки до полисахаридов или олигосахаридов меньшего размера.

Способ по изобретению предпочтительно включает следующую стадию приготовления цитолизина, предпочтительно пневмолизина, в виде вакцины.

Белки и иммуногенные композиции

В еще одном воплощении изобретения предложен цитолизин, предпочтительно пневмолизин, очищенный способом по изобретению. Это воплощение включает в себя конъюгат пневмолизина с бактериальным капсульным полисахаридом, полученный способом по изобретению.

В еще одном воплощении изобретения предложена иммуногенная композиция, содержащая цитолизин, предпочтительно пневмолизин, или конъюгат пневмолизина с бактериальным капсульным полисахаридом, полученный способом по изобретению (как описано выше).

Иммуногенная композиция по изобретению предпочтительно дополнительно содержит один или более членов пневмококкового семейства холинсвязывающих белков, предпочтительно холинсвязывающий белок А или его иммуногенный фрагмент и/или один или более членов полигистидинового триадного семейства (включая их слитые белки), предпочтительно PhtA, PhtB, PhtD и PhtE или их иммуногенные фрагменты.

Что касается семейства холинсвязывающих белков (CbpX), то члены этого семейства впервые были идентифицированы как пневмококковые белки, которые могли быть очищены холин-аффинной хроматографией. Все холинсвязывающие белки нековалентно связываются с фосфорилхолиновыми группировками тейхоевой кислоты клеточной стенки и мембранно-связанной липотейхоевой кислоты. Структурно они имеют несколько общих для целого семейства участков, хотя некоторые свойства белков (аминокислотная последовательность, длина и т.д.) могут варьироваться. Холинсвязывающие белки обычно содержат N-концевой участок (N), консервативные повторяющиеся участки (R1 и/или R2), пролин-богатый участок (Р), и консервативный холинсвязывающий участок (С), образованный множественными повторами, который включает в себя примерно половину белка. Используемый в этой заявке термин "семейство холинсвязывающих белков (CbpX)" выбран из группы, состоящей из холинсвязывающих белков, которые рассмотрены в WO 97/41151, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD и CbpG. CbpA раскрыт в WO 97/41151. CbpD и CbpG раскрыты в WO 00/29434. PspC раскрыт в WO 97/09994. PbcA раскрыт в WO 98/21337. SpsA представляет собой холинсвязывающий белок, раскрытый в WO 98/39450. Предпочтительно холинсвязывающие белки выбраны из группы, состоящей из CbpA, PbcA, SpsA и PspC.

В другом предпочтительном воплощении представлены укороченные формы CbpX, где термин "CbpX" определен выше, и термин "укороченные формы" обозначает белки CbpX, утратившие 50 или более % холинсвязывающего участка (С). Предпочтительно такие белки полностью утрачивают холинсвязывающий участок. Более предпочтительно такие укороченные белки утрачивают (1) холинсвязывающий участок, а также (2) часть N-концевой половины белка, при этом они все еще сохраняют по меньшей мере один повторяющийся участок (R1 или R2). Более предпочтительно, однако, чтобы укороченный белок имел 2 повторяющихся участка (R1 и R2), более предпочтительно, чтобы укороченный белок сохранял пролин-богатый участок (Р). Примерами таких предпочтительных воплощений являются NR1×R2 и R1×R2, как описано в WO 99/51266 или WO 99/51188, и NR1×R2P, однако другие холинсвязывающие белки, утратившие похожий холинсвязывающий участок, также рассматриваются в рамках этого изобретения.

Семейство LytX представляет собой мембранно-связанные белки, вовлеченные в клеточный лизис. N-концевой домен включает в себя холинсвязывающий(е) домен(ы), однако семейство LytX не имеет всех признаков, обнаруженных в указанном выше семействе CbpA, и поэтому считается, что семейство LytX отличается от семейства CbpX. В отличие от семейства CbpX, С-концевой домен содержит каталитический домен из семейства белков LytX. Это семейство включает в себя LytA, В и С. Что касается семейства LytX, то LytA раскрыт в Ronda et al., Eur J. Biochem, 164:621-624 (1987). LytB раскрыт в WO 98/18930 и также обозначается как Sp46. LytC также раскрыт в WO 98/18930 и также обозначается как Sp91. Предпочтительным членом этого семейства является LytC.

Другим предпочтительным воплощением являются укороченные формы LytX, где термин "LytX" определен выше, и термин "укороченные формы" относится к белкам LytX, утратившим 50 или более% холинсвязывающего участка. Предпочтительно такие белки полностью утрачивают холинсвязывающий участок. Пример таких укороченных белков можно найти в разделе "Примеры" этого изобретения.

Еще одним предпочтительным воплощением этого изобретения являются химерные (или слитые) белки, состоящие из укороченного CbpX и укороченного LytX. Предпочтительно это воплощение включает в себя NR1×R2 (или R1×R2 или NR1×R2P) CbpX и С-концевой участок (С-конец, то есть утративший холинсвязывающие домены) LytX (например С-конец LytC или С-конец Sp91). Более предпочтительно CbpX выбран из группы, состоящей из CbpA, PbcA, SpsA и PspC. Однако более предпочтительным является CbpA. Предпочтительно LytX представляет собой LytC (обозначаемый также как Sp91).

В другом воплощении настоящего изобретения представлен PspA или PsaA, или укороченные белки, утратившие холинсвязывающий домен (С), возможно, экспрессирующиеся в виде слитого белка с LytX. Предпочтительно LytX представляет собой LytC.

Семейство Pht (Poly Histidine Triad) включает в себя белки PhtA, PhtB, PhtD и PhtE. Это семейство характеризуется наличием последовательности для липидизации, двух доменов, разделенных пролин-богатым участком и несколькими гистидиновыми триадами, возможно, вовлеченными в связывание металлов или нуклеозидов, или ферментативную активность, (3-5) биспиральных участков, консервативного N-конца и гетерогенного С-конца. Это семейство есть у всех исследованных пневмококковых штаммов. Гомологичные белки также были обнаружены у других стрептококков и нейссерий. Предпочтительные члены этого семейства включают в себя PhtA, PhtB и PhtD. Более предпочтительно они включают в себя PhtA или PhtD. Однако понятно, что термины PhtA, PhtB, PhtD и PhtE обозначают белки, имеющие последовательности, раскрытые в нижеуказанных ссылках, а также их природные (и сконструированные) варианты, которые имеют гомологичные последовательности, по меньшей мере на 90% идентичные эталонным белкам. Предпочтительно идентичность составляет по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно 97%.

Иммуногенная композиция по изобретению может включать слитые белки гистидиновых триадных белков. Предпочтительные слитые белки содержат: 1) PhtD или его фрагмент, сшитый с PhtE или его фрагментом, или 2) PhtB или его фрагмент, сшитый с PhtE или его фрагментом.

Что касается белков PhtX, то PhtA раскрыт в WO98/18930, и также обозначается как Sp36. Как указано выше, он представляет собой белок из полигистидинового триадного семейства и имеет сигнальный мотив LXXC типа II.

PhtD раскрыт в WO 00/37105 и также обозначается как Sp036D. Как указано выше, он также представляет собой белок из полигистидинового триадного семейства и имеет сигнальный мотив LXXC типа II.

PhtB раскрыт в WO 00/37105 и также обозначается как Sр036В. Другим членом семейства PhtB является С3-деградирующий полипептид, который раскрыт в WO 00/17370. Этот белок также представляет собой белок из полигистидинового триадного семейства и имеет сигнальный мотив LXXC типа II. Предпочтительным иммунологически функциональным эквивалентом является белок Sp42, раскрытый в WO 98/18930. Укороченный белок PhtB (примерно 79 кДа) раскрыт в WO 99/15675, который также считается членом семейства PhtX.

PhtE раскрыт в WO 00/30299 и обозначается как BVH-3.

Для того чтобы получить иммуногенную композицию по изобретению, способную вызывать иммунный ответ против более чем одного патогенного микроорганизма, вовлеченного в этиологию среднего отита, предпочтительно, чтобы иммуногенные композиции по изобретению дополнительно содержали антиген из одного или более чем одного (2, 3, 4, 5, 6) штаммов S. pneumoniae, нетипируемого штамма Haemophitus influenzae, Moraxella catarrhalis, RSV (респираторно-синтициального вируса), вируса парагриппа и/или вируса гриппа.

Настоящее изобретение также охватывает комбинированные вакцины, которые обеспечивают защиту против ряда различных патогенов. Многие педиатрические вакцины вводят теперь в виде комбинированной вакцины, для того чтобы уменьшить количество инъекций ребенку, который должен их получить. Таким образом, для педиатрических вакцин могут быть приготовлены другие антигены из других патогенных микроорганизмов вместе с вакцинами по изобретению. Например, вакцины по изобретению могут быть приготовлены (или введены отдельно, но в одно и то же время) с общеизвестной 'трехвалентной' комбинированной вакциной, содержащей дифтерийный анатоксин (DT), столбнячный анатоксин (ТТ) и коклюшные компоненты [обычно детоксицированный коклюшный анатоксин (РТ) и филаментный гемагглютинин (FHA) с возможным пертактином (PRN) и/или агглютинином 1+2], например, с имеющейся в продаже вакциной INFANRIX-DTPa^TM (Smith KlineBeecham Biologicals), которая содержит антигены DT, ТТ, РТ, FHA и PRN, или с цельно-клеточным коклюшным компонентом, например, имеющимся в продаже в виде Tritantrix^TM (SmithKlineBeecham Biologicals). Комбинированная вакцина может содержать также другой антиген, например, поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg), антигены вируса полиомиелита (например, инактивированный трехвалентный полиовирус - IPV), наружные мембранные белки Moraxella catarrhalis, белки нетипируемого штамма Haemophilus influenzae, наружные мембранные белки N. meningitidis В.

Примеры предпочтительных белковых антигенов Moraxella catarrhatis, которые могут быть включены в комбинированную вакцину (особенно для предупреждения среднего отита) представляют собой: ОМР106 [WO 97/41731 (Antex) и WO 96/34960 (PMC)j; OMP21; LbpA и/или LbpB [WO 98/55606 (РМС)]; TbpA и/или TbpB [WO 97/13785 и WO 97/32980 (РМС)]; СорВ [Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010]; UspA1 и/или UspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP 99/03824); PilQ (PCT/EP 99/03823); OMP85 (PCT/EP 00/01468); liро06 (GB 9917977.2); liро10 (GB 9918208.1); lipo11 (GB 9918302.2); lipo18 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP 99/03038); D15 (PCT/EP 99/03822); OmplA1 (PCT/EP 99/06781); Hly3 (PCT/EP 99/03257) и OmpE. Примеры нетипируемых антигенов Haemophilus influenzae, которые могут быть включены в комбинированную вакцину (особенно для предупреждения среднего отита), включают: белок фимбрин [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] и слитые белки, содержащие его пептиды: [например, слитые пептиды LB1(f); US 584346 (OSU) или WO 99/64067]; OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (State University of New York)]; TbpA и/или TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); белок D (EP 594610); P2 и Р5 (WO 94/26304).

Другие предполагаемые комбинации представляют собой цитолизин, предпочтительно пневмолизин, по изобретению в комбинации с вирусными антигенами, например из вируса гриппа (аттенуированный, расщепленный или субъединичный [например, поверхностные гликопротеины нейраминидаза (NA) или гемагглютинин (НА), см., например, Chaloupka I. et al., Eur. Journal Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996, 15:121-127]; RSV (например, антигены F и G или слитый белок F/G, см., например, Schmidt A.C. et al., J. Virol., May 2001, р. 4594-4603); вируса парагриппа 3 (PIV3) (например, белки HN или F, см., например, выше Schmidt A.C. et al.), вируса ветряной оспы (например, аттенуированный, гликопротеины I-V и т.д.), и любым (или всеми) компонентом(ами) MMR (тривакцина против кори, эпидемического паротита и коревой краснухи от англ. measles-mumps-rubella vaccine).

Вакцины

Еще одно воплощение изобретения представляет собой вакцину, содержащую цитолизин, предпочтительно пневмолизин, или конъюгат пневмолизина с бактериальным капсульным полисахаридом, полученный способом по изобретению, и фармацевтически приемлемый эксципиент и возможно адъювант.

Вакцина по изобретению может включать описанные выше иммуногенные композиции по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент.

Вакцины по изобретению способны вызывать защитный иммунный ответ против инфекции, вызываемой S. pneumoniae, и/или среднего отита.

Еще одно воплощение изобретения включает в себя способ приготовления вакцины путем взятия цитолизина, предпочтительно пневмолизина, полученного способом по изобретению, и приготовления его в виде вакцины с фармацевтически приемлемым эксципиентом и возможно одним или более чем одним дополнительным антигеном, описанным выше.

Еще одно воплощение изобретения включает в себя способ лечения или предупреждения бактериальной инфекции, предпочтительно инфекции Streptococcus pneumoniae или среднего отита, включающий введение вакцины или иммуногенной композиции по изобретению.

Еще одно воплощение изобретения представляет собой применение цитолизина, предпочтительно пневмолизина, и/или конъюгата цитолизина с бактериальным капсульным полисахаридом, каждый из которых получен способом по изобретению, для приготовления вакцины для лечения или предупреждения бактериальной инфекции, предпочтительно инфекции Streptococcus pneumoniae или среднего отита.

Вакцины по настоящему изобретению предпочтительно содержат адъюванты. Подходящие адъюванты включают в себя соль алюминия, такую как гель гидроксида алюминия (квасцы) или фосфат алюминия, но также могут представлять собой соль кальция, магния, железа или цинка, или могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина или ацилированных сахаров, катионные или анионные производные полисахаридов или полифосфазены.

Предпочтительно, чтобы адъювант был выбран таким образом, чтобы он являлся избирательным индуктором ответа Th1-типа. Такие высокие уровни цитокинов Th1-типа способствуют индукции клеточно-опосредованных иммунных ответов на вводимый антиген, в то время как высокие уровни цитокинов Тh2-типа способствуют индукции гуморальных иммунных ответов на этот антиген.

Важно помнить, что различие между иммунным ответом Тh1- и Тh2-типа является условным. В действительности, индивидуум будет поддерживать иммунный ответ, который описывают как представляющий собой преимущественно Тh1 или преимущественно Тh2. Однако часто принято рассматривать семейства цитокинов в терминах семейств, описанных на мышиных CD4+ Т-клеточных клонах Мосманном и Коффманом (Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual. Review of Immunology, 7, p145-173). Обычно ответы Th1-типа связаны с продукцией Т-лимфоцитами цитокинов INF-γ (интерферона гамма) и IL-2 (интерлейкина-2). Другие цитокины, часто связанные непосредственно с индукцией иммунных ответов Th1-типа, не продуцируются Т-клетками, например IL-12. В отличие от этого, ответы Тh2-типа связаны с секрецией IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Подходящие системы адъювантов, которые стимулируют преимущественно ответ Тh1-типа, включают в себя: монофосфориллипид А или его производное, в частности 3-де-O-ацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL) (для его приготовления см. GB 2220211 А); и комбинацию монофосфориллипида А, предпочтительно 3-де-O-ацилированного монофосфориллипида А, вместе с любой солью алюминия (например, фосфатом алюминия или гидроксидом алюминия) или эмульсией масло-в-воде. В таких комбинациях антиген и 3D-MPL содержатся в одних и тех же частицах, обеспечивая возможность для более эффективной доставки антигенных и иммуностимулирующих сигналов. Исследования показали, что 3D-MPL может дополнительно усиливать иммуногенность абсорбированного на квасцах антигена [Thoelen et al., Vaccine (1998) 16:708-14; Ер 689454-В1].

Усиливающая система включает в себя комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, в частности комбинацию QS21 и 3D-MPL, раскрытую в WO 94/00153, или менее реактогенную композицию, где QS21 блокируют холестерином, как раскрыто в WO 96/33739.

Особенно эффективный препарат адъюванта, включающий QS21, 3D-MPL и токоферол в эмульсии масло-в-воде, описан в WO 95/17210 и представляет собой предпочтительный препарат.

Предпочтительно вакцина дополнительно содержит сапонин, более предпочтительно QS21. Препарат может содержать также эмульсию масло-в-воде и токоферол (WO 95/17210).

В настоящем изобретении также предложен способ приготовления вакцинного препарата, включающий смешивание цитолизина по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым эксципиентом, таким как 3D-MPL.

Неметилированные CpG-содержащие олигонуклеотиды (WO 96/02555) также являются предпочтительными индукторами ответа Тh1-типа и являются подходящими для применения в настоящем изобретении.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена вакцина, как описано здесь, для применения в медицине. В одном воплощении предложен способ предупреждения или улучшения состояния при пневмонии у пожилых людей (старше 55 лет), включающий введение указанному пожилому пациенту безопасного и эффективного количества вакцины по изобретению и возможно Тh1-адъюванта.

В еще одном аспекте изобретения предложен способ предупреждения или улучшения состояния при среднем отите у младенцев (до 24 месяцев) или детей младшего возраста (обычно от 24 месяцев до 5 лет), включающий введение указанному младенцу или ребенку младшего возраста безопасного и эффективного количества вакцины, содержащей цитолизин, предпочтительно пневмолизин, по изобретению, возможно с одним или более чем одним дополнительным антигеном, описанным выше, и возможно Th1-адъювант.

Вакцинные препараты по настоящему изобретению могут быть использованы для профилактики или лечения млекопитающего (предпочтительно человека), восприимчивого к инфекции, путем введения указанной вакцины системным путем или через слизистые оболочки. Эти введения могут включать инъекцию внутримышечным, внутрибрюшинным, внутрикожным или подкожным путями или введение через слизистые оболочки в ротовой/пищеварительный, дыхательный или мочеполовой тракты. Интраназальное введение вакцин для лечения пневмонии или среднего отита является предпочтительным (поскольку носоглоточное носительство пневмококков может быть более эффективно предупреждено, ослабляя таким образом инфекцию на самых ранних стадиях ее развития). Хотя вакцина по изобретению может быть введена в виде одноразовой дозы, ее компоненты могут быть также совместно введены в одно и то же время или в разное время (например, если в вакцине присутствуют полисахариды, то они могут быть введены раздельно в одно и то же время или через 1-2 недели после введения комбинации бактериальных белков для оптимальной координации иммунных ответов на каждый из них). Кроме одноразового пути введения могут быть использованы два разных пути введения. Например, вирусные антигены могут быть введены в/к (внутрикожно), в то время как бактериальные белки могут быть введены в/м (внутримышечно) или и/н (интраназально). Если присутствуют полисахариды, то они могут быть введены в/м (или в/к), и бактериальные белки могут быть введены и/н (или в/к). Кроме того, вакцины по изобретению могут быть введены в/м, если это касается первичных доз, или и/н, если это касается бустерных доз.

Количество конъюгированного антигена в каждой дозе вакцины выбирают как количество, которое индуцирует иммунозащитный ответ без значительных нежелательных побочных эффектов на обычные вакцины. Такое количество будет варьироваться в зависимости от того, какой специфический иммуноген используют и как он представлен. Содержание белковых антигенов в вакцине обычно находится в диапазоне 1-100 мкг, предпочтительно 5-50 мкг, наиболее типично в диапазоне 5-25 мкг. Если включены полисахариды, то обычно предполагают, что каждая доза будет включать 0,1-100 мкг полисахарида, предпочтительно 0,1-50 мкг, более предпочтительно 0,1-10 мкг, из которых 1-5 мкг является наиболее предпочтительным диапазоном.

Оптимальные количества компонентов для конкретной вакцины могут быть определены стандартными исследованиями, включающими наблюдение соответствующих иммунных ответов у индивидуумов. После первичной вакцинации индивидуумы могут получить одну или несколько бустерных иммунизаций через адекватные интервалы времени. Типично вакцина будет включать антиген (белки), адъювант и эксципиенты или фармацевтически приемлемый носитель.

Получение вакцин описано в общих чертах в разделе 'Создание вакцин' ("Субъединичный и адъювантный подход") ("The subunit and adjuvant approach", eds Powell M.F. & Newman M.J. (1995) Plenum Press New York). Инкапсуляция в липосомы описана Fullerton в патенте США US 4235877.

Хотя вакцины по настоящему изобретению могут быть введены любым путем, введение описанных вакцин в кожу (в/к) составляет отдельное воплощение настоящего изобретения. Кожа человека включает внешнюю "ороговевшую" кутикулу, называемую роговым слоем, который покрывает эпидермис. Снизу этот эпидермис представляет собой слой, называемый дермой, которая в свою очередь покрывает подкожную ткань. Исследователи показали, что инъекция вакцины в кожу и, в частности, в дерму, стимулирует иммунный ответ, который также может быть связан с рядом дополнительных преимуществ. Внутрикожная вакцинация описанными здесь вакцинами является предпочтительным признаком настоящего изобретения.

Традиционная методика внутрикожной инъекции ("реакция Манту") включает стадии дезинфекции кожи, натягивания кожи одной рукой и введения под наклоном узкой иглы (толщина 26-31 G), при этом иглу вводят под углом 10-15°. После введения иглы под наклоном, стержень иглы опускают и дополнительно продвигают, обеспечивая легкое надавливание, чтобы продвинуть ее под кожу. Затем очень медленно вводят жидкость, в результате чего образуется пузырек или вздутие на поверхности кожи, с последующим медленным извлечением иглы.

Недавно были описаны устройства, которые специально разработаны для введения жидких агентов в или через кожу, например устройства, описанные в WO 99/34850 и ЕР 1092444, а также устройства для безыгольного впрыскивания, описанные, например, в WO 01/13977; US 5480381, US 5599302, US 5334144, US 5993412, US 5649912, US 5569189, US 5704911, US 5383851, US 5893397, US 5466220, US 5339163, US 5312335, US 5503627, US 5064413, US 5520639, US 4596556, US 4790824, US 4941880, US 4940460, WO 97/37705, WO 97/13537. Альтернативные способы внутрикожного введения вакцинных препаратов могут включать в себя обычные шприцы и иглы или устройства, разработанные для баллистической доставки твердых вакцин (WO 99/27961), или трансдермальных путей (WO 97/48440; WO 98/28037); или вводимые в поверхность кожи (трансдермальная или чрескожная доставка: WO 98/20734; WO 98/28037).

Если вакцины по настоящему изобретению должны быть введены в кожу, или более конкретно в дерму, то вакцину вводят в малом объеме жидкости, в частности в объеме примерно от 0,05 мл до 0,2 мл.

Содержание антигенов в вакцинах для кожного или внутрикожного введения по настоящему изобретению может совпадать с традиционными дозами, как обнаружено в случае внутримышечных вакцин. Соответственно, содержание белковых антигенов, присутствующих в вакцинах для внутрикожного введения, может находиться в диапазоне 1-100 мкг, предпочтительно 5-50 мкг. Аналогично, если присутствует антиген, конъюгированный с полисахаридом, то его количество в каждой дозе вакцины, как обычно ожидают, составляет 0,1-100 мкг полисахарида, предпочтительно 0,1-50 мкг, предпочтительно 0,1-10 мкг, и может составлять от 1 до 5 мкг. Однако признаком вакцин для кожного или внутрикожного введения является то, что эти препараты могут быть "низкодозовыми". Соответственно, белковые антигены в "низкодозовых" вакцинах предпочтительно присутствуют в концентрациях до 0,1-10 мкг, предпочтительно 0,1-5 мкг на дозу; и если присутствуют антигены, конъюгированные с полисахаридом, то они могут быть представлены в диапазоне 0,01-1 мкг и предпочтительно 0,01-0,5 мкг полисахарида на дозу.

Используемый здесь термин "внутрикожная доставка" обозначает доставку вакцины в участок дермы в коже. Однако вакцина необязательно будет локализована исключительно в дерме. Дерма представляет собой слой в коже, расположенный на расстоянии примерно 1-2 мм от поверхности кожи человека, но существует некоторый диапазон варьирования между индивидуумами и в разных частях организма. В общем, можно ожидать достижения дермы, проникая на 1,5 мм ниже поверхности кожи. Дерма расположена между роговым слоем и эпидермисом на поверхности и подкожным слоем снизу. В зависимости от способа доставки, вакцина в конечном счете может быть локализована исключительно или главным образом внутри дермы, или она может быть распределена исключительно внутри эпидермиса и дермы.

Иммуногенные композиции и вакцины по изобретению могут быть оценены на различных животных моделях или с помощью сыворотки человека. В качестве примера, для оценки пневмококковой инфекции могут быть использованы следующие животные модели. Мыши СЗН/HeJ (в возрасте 6-8 недель) могут быть иммунизированы п/к 15 мкг белка в комбинации с 50 мкл ПАФ (полного адъюванта Фрейнда), с последующей бустерной иммунизацией с помощью 15 мкг белка с НАФ (неполным адъювантом Фрейнда) через 3-4 недели. Для демонстрации пассивной и активной защиты от системной инфекции мышам может быть введена внутрибрюшинно иммунная сыворотка или белки перед их заражением путем внутрибрюшинной инъекции 15-90 LD₅₀ пневмококков (на 8-10 неделе). Кроме этого, белки могут быть протестированы на мышиной модели носоглоточной колонизации (Wu et al., Microbial Pathogenesis 1997; 23:127-137).

Кроме мышей, к колонизации и инфекции S. pneumoniae восприимчивы новорожденные крысы. В исследованиях пассивного защитного эффекта введение мышиной иммунной сыворотки (100 мкл в/б или 10 мкл и/н) может быть осуществлено перед контрольным заражением путем интраназального введения S. pneumoniae (10 мкл) 2-5-дневным новорожденным крысам. Колонизация может быть определена путем посева назальных смывов (закапали 20-40 мкл, извлекли 10 мкл).

Полезные взаимодействия между белковыми (или белковыми и полисахаридными) компонентами комбинированной вакцины могут быть продемонстрированы путем введения дозы каждого белка (или белка и полисахарида) в вакцине, которая будет недостаточно защищающей (sub-protective) в моновалентной вакцине. Повышенная защитная эффективность комбинированной вакцины по сравнению с моновалентными вакцинами может быть объяснена полезным взаимодействием между компонентами.

Изобретение проиллюстрировано соответствующими примерами. Примеры выполнены с использованием стандартных методик, которые являются общеизвестными и рутинными для специалистов в данной области техники, за исключением других случаев, описанных подробно. Примеры предназначены для иллюстрации, а не для ограничения изобретения.

Примеры

Пример 1. Очистка пневмолизина

Через 18 часов после индукции культуры E.coli путем повышения температуры до 39,5°С клетки E.coli осаждали центрифугированием при 17000g в течение 1 часа. Осадок ресуспендировали в 25 мМ диэтаноламине, рН 9,0, и клетки E.coli механически разрушали, используя одно прохождение при 500 psi (примерно 3448 кПа) в аппарате Раннье (Rannie). К разрушенным клеткам E.coli добавляли 1% лауроилсаркозината натрия (ЛСН), и эту смесь инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре перед тем, как центрифугировать при 30000g в течение 20 минут, чтобы осадить клеточный дебрис. Супернатант разбавляли в 2,5 раза в 20 мМ фосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 1 М NaCl и 1% ЛСН, и затем наносили на колонку с фенил-сефарозой HP, уравновешенную тем же буфером (уравновешивающий буфер: 20 мМ фосфатный буфер, рН 7,0, содержащий 1 М NaCl и 1% ЛСН). Колонку промывали 4 объемами (колонки) уравновешивающего буфера с последующей промывкой 2 объемами (колонки) 20 мМ фосфатного буфера, рН 7,0, содержащего 0,5 М NaCl и 1% ЛСН. Пневмолизин элюировали с колонки путем нанесения низкосолевого буфера, содержащего 20 мМ фосфатный буфер, рН 7,0, содержащий 1% ЛСН. Фракции, содержащие пневмолизин, идентифицировали, используя анализ методом электрофореза в ПААГ с ДСН, объединяли, и буфер заменяли на 25 мМ диэтаноламин, рН 9,0, используя диафильтрацию.

Пневмолизин солюбилизировали путем денатурации, добавляя твердый гуанидингидрохлорид вплоть до конечной концентрации 6 М и инкубируя в течение одного часа. Затем подвергали диафильтрации против 8 М мочевины в 25 мМ диэтаноламине, рН 9,0, содержащем 1 мМ ДТТ. Пневмолизин ренатурировали посредством диафильтрации против 20 мМ боратного буфера, рН 9,0, содержащего 1 мМ ДТТ. После ренатурации ДТТ удаляли диафильтрацией против 20 мМ боратного буфера, рН 9,0.

Чистоту полученного пневмолизина анализировали, проводя электрофорез в ПААГ с ДСН и окрашивая кумасси бриллиантовым голубым. Разделяющий гель анализировали вестерн-блоттингом, используя антитела против E.coli, чтобы определить уровень белков E.coli, оставшихся в препарате очищенного пневмолизина. Биологическую активность очищенного пневмолизина оценивали, используя анализ гемолиза in vitro.

Результаты

Как показано на фиг.1, вышеописанный способ способен обеспечивать высокоэффективную очистку пневмолизина после проведения одностадийной хроматографии. На панели А гель, окрашенный кумасси голубым, демонстрирует, что элюция колонки низкосолевым буфером, не содержащим хлорида натрия, способствует элюции полосы 53 кДа, соответствующей пневмолизину с колонки в высокоочищенной форме. Значительно более слабая полоса примерно 45 кДа, как полагают авторы, также представляет собой пневмолизин, поскольку эта вторая полоса связывается с антителами к пневмолизину (результаты не показаны) и не способна связываться с антителами к E.coli, как показано на панели Б. Вестерн-блоттинг на панели Б является высокочувствительным методом обнаружения любых загрязняющих белков, которые остаются в очищенном пневмолизине. Этим методом смогли обнаружить очень незначительные количества примесей, и эти примеси присутствовали на более низком уровне, чем уровень обнаружения при окрашивании кумасси. Следовательно, пневмолизин очищают до уровня чистоты 98-100%.

Выход данного способа очистки также является хорошим в обычном режиме, дающем примерно 1900 мг пневмолизина на литр ферментации. Примерно 10% белка от массы ферментирующей культуры было выделено в виде очищенного пневмолизина.

Активность пневмолизина оценивали в анализе гемолиза после того, как пневмолизин был обработан смесью гуанидингидрохлорид/мочевина и был ренатурирован путем удаления денатурирующего агента. Гемолитическую активность определяли разбавлениями очищенного пневмолизина до концентраций 1,3 нг/мл, демонстрирующих, что гемолитическая активность восстанавливалась. Активность соответствует 500000-1000000 гемолитических единиц на мг пневмолизина дикого типа.

Пример 2. Детоксикация пневмолизина из S. pneumoniae с использованием GMBS

Очищенный пневмолизин детоксицировали посредством модификации сульфгидрильных и первичных аминогрупп, используя NHS эфир-малеимидный сшивающий агент GMBS (N-(γ-малеимидобутирилокси)сукцинимидный эфир). Пневмолизин в концентрации 0,5 мг/мл диализовали против 50 мМ фосфатного буфера, рН 7,0. GMBS сначала растворяли в ДМСО и добавляли к пневмолизину в 248-кратном молярном избытке GMBS. Обработку продолжали в течение одного часа при комнатной температуре. Избыток GMBS и побочные продукты удаляли диализом против 100 мМ фосфата натрия, рН 6,8. Другие малеимидные группы блокировали путем взаимодействия с 0,6 мг/мл цистеина в течение двух часов при комнатной температуре. Для того чтобы удалить избыток цистеина, образец диализовали против 2 мМ фосфата натрия, рН 7,15.

Пример 3. Характеристика детоксицированного пневмолизина

Гемолитическая активность

Анализ гемолиза использовали для оценки остаточной токсичности детоксицированного пневмолизина. Последовательные 2-кратные разведения пневмолизина инкубировали с эритроцитами барана. После центрифугирования супернатант переносили в иммунопланшеты, и высвобожденный гемоглобин измеряли, используя считывание оптической плотности при 405 нм. Результаты выражали как нг/мл пневмолизина, соответствующие усредненному значению на кривой OD. Анализ повторяли после инкубации детоксицированного пневмолизина при 37°С в течение 7 дней для проверки обратимости детоксикации. Как показано в таблице 1, обработка GMBS способна в значительной степени снижать гемолитическую активность PLY вплоть до 3000-кратного снижения гемолитической активности. Более высокие молярные соотношения GMBS к лизину способны давать лучшее удаление гемолитической активности, при этом соотношения 4:1 и 5:1 являются оптимальными в этом эксперименте. Оценили, что эта обработка приводит к модификации примерно 14 остатков лизина. В тех случаях, когда было модифицировано меньшее количество остатков лизина, снижение гемолитической активности было меньше.

ELISA

Антигенность детоксицированного пневмолизина оценивали с помощью ELISA (иммуноферментный анализ от англ. enzyme-linked immunosorbent assay). Планшеты для ELISA покрывали антипневмолизин антителами морской свинки. Образцы, содержащие разведения пневмолизина, инкубировали в планшетах в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывки связавшийся пневмолизин определяли, используя кроличьи поликлональные антитела против пневмолизина, конъгированные с пероксидазой хрена. После промывки планшетов использовали реакцию с субстратом для оценки количества пневмолизина, связавшегося с каждой лункой.

Как показано в таблице 1, обработка GMBS приводила к некоторой потере антигенности, как определено с помощью ELISA. Однако данные ELISA составляют примерно 66% от данных, полученных с необработанным PLY, показывая, что многие антитела могли все еще распознавать модифицированный пневмтолизин.

Анализ методом электрофореза в ПААГ с ДСН

Детоксицированные пневмолизиновые белки разгоняли с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН (4-20% полиакриламидный гель Novex, Invitrogen), и кумасси бриллиантовый голубой использовали для визуализации белков. Как показано на фиг.2, обработка GMBS приводила к незначительному повышению молекулярной массы PLY от 53 кДа до примерно 56 кДа. Это повышение обусловлено модификацией многочисленных аминокислотных остатков с помощью GMBS. Небольшой процент PLY превращается в мультимерные формы, как видно по появлению слабых полос с молекулярной массой примерно 110 кДа и 170 кДа, однако большая часть PLY остается по существу в мономерной форме. Инкубация PLY при 37°С в течение 7 дней не приводила к существенному изменению в появлении PLY на электрофорезе в ПААГ с ДСН, показывая, что модифицированный PLY не подвергается деградации или последующему образованию ковалентно-сшитых мультимеров.

Таблица 1 Исследования детоксикации PLY с помощью GMBS
Исследование	Избыток GMBS (GMBS/лизин)	Малеимидные функциональные группы	Соотношение ELISA/Лоури %	Гемолитический титр, нг/мл
4°С	7 дней, 37°С	4°С	7 дней, 37°С
1	/	/	95	56	1,7	4,2
	1/1	8	63	87	186	111
	1,5/1	8,5	69	/	48	/
	2/1	9,4	76	/	309	/
	3/1	11,8	56	/	530	/
	4/1	13,5	66	/	6308	/
5/1	14,2	67	/	4284	/
2	4/1	13,8	26,2	24,8	NH	NH
	8/1	17,6	23,9	38,0	NH	NH
3	4/1	11,3	89	46	1598	6309

Исследования были выполнены с 1 мг PLY (1 мг/мл), за исключением последнего анализа, для которого обрабатывали 3 мг (PLY в концентрации 0,68 мг/мл).

Пример 4. Оценка реактогенности детоксицированного пневмолизина на крысах

Группы по три крысы OFA однократно иммунизировали внутримышечной (в большеберцовые мышцы) инокуляцией физиологического раствора, адъюванта QS21 (US 5057540), пневмолизина, пневмолизина с адъювантом, формальдегид-детоксицированного пневмолизина, формальдегид-детоксицированного пневмолизина с адъювантом, GMBS-детоксицированного пневмолизина, GMBS-детоксицированного пневмолизина с адъювантом, NHS-ацетат-детоксицированного пневмолизина и NHS-ацетат-детоксицированного пневмолизина с адъювантом. Через три дня после иммунизации всех крыс умерщвляли и большеберцовые мышцы подготавливали для гистологического исследования. Большеберцовую мышцу фиксировали в формалине и разрезали на 2 мм кусочки, которые обезвоживали и заливали в парафин. Перед микроскопическим исследованием получали срезы толщиной 7 мкм и окрашивали их, используя метод Trichrome Masson.

Реактогенность оценивали, используя четыре критерия: дегенерация/некроз, воспаление эндомизия, геморрагия и воспаление апоневроза. Для каждого гистологического критерия была установлена шкала в баллах для каждой мышцы из каждой группы, и шкалу средней величины поражения затем рассчитывали для каждой группы. 0 баллов = нормальное, 1 балл = минимальное, 2 балла = слабое, 3 балла = умеренное, 4 балла = заметное, 5 баллов = сильное.

Результаты

Исследовали гистологию срезов. Средние значения баллов для дегенерации/некроза, воспаления эндомизия, геморрагии и воспаления апоневроза показаны в таблице 2.

Таблица 2
Инокуляция	Дегенерация /некроз	Воспаление эндомизия	Геморрагия	Воспаление апоневроза
NaCl	0	0,5	0	0
Ply	3,6	3,8	3,0	1,4
GMBS-Ply	0,6	1,3	1,3	0,4
Адъювант	2,9	3,9	2,8	2,8
Ply+адъювант	4,2	3,9	4,6	1,8
GMBS-Ply+адъювант	2,9	3,9	3,8	1,6

Сравнение гистологических баллов для безадъювантного нативного и детоксицированного пневмолизина показывает, что GMBS является особенно эффективным сшивающим агентом для применения в детоксикации пневмолизина, вызывая большое снижение дегенерации/некроза, воспаления эндомизия, геморрагии, воспаления апоневроза.

Добавление адъюванта (50 мкг фосфата алюминия и 5 мкг MPL) к инокуляциям повышает величину реактогенности в виде побочного эффекта стимуляции иммунной системы. Детоксификация пневмолизина с помощью GMBS дает возможность понизить уровень дегенерации/некроза до уровня, полученного только с адъювантом, который оказался ниже уровня, полученного после инокуляции нативным пневмолизином. Пневмолизин, детоксицированный с помощью GMBS, индуцировал более низкий уровень геморрагии, чем уровень, полученный с нативным пневмолизином. Уровни воспаления эндомизия повышались адъювантом, и этот уровень все еще сохранялся в присутствии нативного или GMBS-детоксицированного пневмолизина с адъювантом. Однако воспаление апоневроза уменьшалось относительно уровня, полученного только с адъювантом, нативным или GMBS-детоксицированным пневмолизином, при этом уровень апоневроза был незначительно ниже в случае, когда пневмолизин был обработан GMBS.

Пример 5. Оценка токсичности GMBS-обработанного пневмолизина на мышах

Группы по 20 мышей OF1 заражали интраназально, либо нативным пневмолизином, либо GMBS-обработанным пневмолизином, и мышей наблюдали в течение следующих 9 дней.

Как показано на фиг.3, заражение 2 мкг нативного пневмолизина очень быстро приводило к смерти всех мышей в данной группе. Пневмолизин индуцировал поражения во всей дыхательной системе, которые приводили к затруднениям дыхания и к смерти. Напротив, GMBS-обработанный пневмолизин в значительной степени снижал токсичность во всех мышах, привитых 2 мкг, 5 мкг или 10 мкг GMBS-обработанного пневмолизина, выживших после заражения.

Пример 6. Исследования защиты с использованием детоксицированного пневмолизина

Группы по 20 мышей OF1 иммунизировали 3 раза внутримышечно на 0-й, 14-й и 28-й день 5 мкг пневмолизина и 50 мкг фосфата алюминия и 5 мкг MPL в качестве адъюванта. Контрольных мышей иммунизировали только адъювантом. Использовали либо необработанный пневмолизин, либо детоксицированный с использованием GMBS-обработки, как описано выше.

На 42-й день мышей заражали интраназально летальной дозой 2 мкг нативного пневмолизина. Выживаемость мышей контролировали в течение следующих 9 дней.

Результаты

Модель летального заражения давала 90%-ную смертность у контрольных мышей (фиг.4). Иммунизация GMBS-детоксицированным пневмолизином давала очень хорошую защиту, при этом только 5% мышей умерло в течение следующих 9 дней. Эта защита сравнима с защитой, полученной после иммунизации нативным пневмолизином, после которого умерло 10% мышей.

Пример 7. Оценка детоксицированного пневмолизина в комбинации с PhtD в модели летального заражения мышей

Группы по 20 мышей OF1 иммунизировали внутримышечно (а) только адъювантом, (б) 1 мкг PhtD и адъювантом, или (в) 1 мкг PhtD и 5 мкг GMBS-детоксицированного пневмолизина и адъювантом. Используемый адъювант включал 50 мкг фосфата алюминия и 5 мкг MPL, и иммунизации проводили на 0-й и 14-й день. Мышей заражали интраназально летальной дозой 5·10⁵ КОЕ штаммом D39 S. pneumoniae серотипа 2, и выживаемость проверяли в течение следующих 10 дней.

Результаты

Как показано на фиг.5, заражение штаммом D39 приводило к 75%-ной смертности через 10 дней у контрольных мышей. Иммунизация только PhtD не обеспечивала существенной защиты, при этом 70% мышей из этой группы умерло через 10 дней (р=0,29). Иммунизация PhtD вместе с GMBS-детоксицированным пневмолизином давала существенно лучшую защиту, при этом летальность снизилась до 50% (р=0,04).

Пример 8. Детоксикация пневмолизина с использованием формальдегида

Исходный раствор очищенного пневмолизина в концентрации примерно 0,4 мг/мл в 25 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,0, обрабатывали 50 мМ L-лизина и 0,1% формальдегида (мас./об.) в течение 21 дня при 40°С.

1. Способ очистки бактериального цитолизина, включающий стадии

а) выращивания культуры клеток, экспрессирующих бактериальный цитолизин;

б) приготовления экстракта из культуры, содержащей бактериальный цитолизин;

в) связывания растворимого агрегированного бактериального цитолизина, содержащегося в экстракте, с гидрофобным хроматографическим сорбентом в присутствии детергента в условиях высокой концентрации соли, составляющих 0,6-2 М соли;

г) элюции бактериального цитолизина в присутствии детергента в условиях низкой концентрации соли, составляющих 0-0,2 М соли.

2. Способ по п.1, дополнительно включающий стадии

д) удаления детергента из бактериального цитолизина;

е) растворения бактериального цитолизина путем добавления денатурирующего агента;

ж) удаления денатурирующего агента из бактериального цитолизина.

3. Способ по п.1 или 2, где бактериальный цитолизин представляет собой пневмококковый пневмолизин.

4. Способ по п.1, где стадия (б) включает механическое разрушение клеток.

5. Способ по п.1, где стадия (б) включает обработку детергентом.

6. Способ по п.1, где на стадиях (в) и (г) присутствует один и тот же детергент.

7. Способ по п.5, где на стадиях (б), (в) и (г) присутствует один и тот же детергент.

8. Способ по п.1, где детергент присутствует в концентрации 0,1-5% (мас./об.).

9. Способ по п.1, где стадия (б) включает центрифугирование разрушенного клеточного материала и сбор супернатанта в виде экстракта стадии (в).

10. Способ по п.1, где гидрофобный хроматографический сорбент, используемый на стадии (в), содержит ароматические группы.

11. Способ по п.10, где гидрофобный хроматографический сорбент представляет собой фенил-сефарозу.

12. Способ по п.1, где детергент, присутствующий в растворе, используемом на стадии (в) и/или (г), представляет собой алифатический детергент.

13. Способ по п.1, где детергент представляет собой лауроилсаркозинат натрия.

14. Способ по п.1, где условия высокой концентрации соли на стадии (в) включают 1 М соли.

15. Способ по п.1, где раствор, используемый на стадии (в) и/или (г), содержит соль, выбранную из группы, состоящей из хлорида натрия, хлорида магния, хлорида аммония, сульфата натрия, сульфата магния, сульфата аммония, фосфата натрия, фосфата магния, фосфата аммония.

16. Способ по п.1, где условия, используемые на стадии (в) и/или (г), включают рН 6-8, предпочтительно рН 7.

17. Способ по п.1, где условия, используемые на стадии (г), включают 0-0,1 М соли.

18. Способ по п.17, где условия, используемые на стадии (г), включают 0-40 мМ соли.

19. Способ по п.2, где стадия (д) включает удаление детергента диафильтрацией или диализом.

20. Способ по п.19, где диафильтрацию/диализ осуществляют против низкосолевого буфера, содержащего 0-0,2 М соли с рН 8-10, предпочтительно с рН9.

21. Способ по п.2, где стадия (е) включает денатурацию бактериального цитолизина посредством добавления денатурирующего агента, и стадия (ж) включает ренатурацию бактериального цитолизина путем постепенного удаления денатурирующего агента.

22. Способ по п.2, где денатурирующий агент, используемый на стадии (е), представляет собой гуанидингидрохлорид.

23. Способ по п.22, где используют 5-8 М гуанидингидрохлорида.

24. Способ по пп.21-23, где бактериальный цитолизин приводят в контакт с 5-9 М мочевины на стадии (е).

25. Способ по п.24, где стадия (е) включает приведение бактериального цитолизина в контакт с 5-8 М гуанидингидрохлорида с последующей заменой гуанидингидрохлорида на 5-9 М мочевины.

26. Способ по п.21, где восстанавливающий агент присутствует по меньшей мере частично на стадиях (е) и (ж).

27. Способ по п.26, где восстанавливающий агент представляет собой 0,1-10 мМ ДТТ (дитиотреитола), предпочтительно 1 мМ ДТТ.

28. Способ по п.2, где стадия (ж) включает удаление денатурирующего агента диафильтрацией или диализом.

29. Способ по п.28, где диафильтрацию или диализ осуществляют против раствора с рН 7-9.

30. Способ по п.2, включающий дополнительную стадию детоксикации бактериального цитолизина посредством химической обработки сшивающим агентом.

31. Способ по п.30, где сшивающий агент содержит одно или более чем одно химическое соединение, выбранное из группы, состоящей из формальдегида, глутаральдегида, N-гидроксисукцинимидных эфиров и GMBS (N-(гамма-малеимидобутирилокси)сукцинимидного эфира).

32. Способ по п.2, включающий дополнительную стадию конъюгирования бактериального цитолизина с бактериальным капсульным полисахаридом.

33. Способ по п.32, где бактериальный капсульный полисахарид происходит из Streptococcus pneumoniae.

34. Способ по п.2, включающий дополнительную стадию приготовления бактериального цитолизина в виде вакцинной композиции с фармацевтически приемлемым эксципиентом.

35. Способ по п.34, где бактериальный цитолизин приготовлен с холинсвязывающим белком А или его иммуногенным фрагментом.

36. Способ по п.34 или 35, где бактериальный цитолизин приготовлен с одним или более чем одним из PhtA, PhtB, PhtD или PhtE или его иммуногенным фрагментом.

37. Способ по п.34, где бактериальный цитолизин приготовлен с антигеном из нетипируемого штамма Haemophilus influenzae (NtHi).

38. Способ по п.34, где бактериальный цитолизин приготовлен с антигеном из Moraxella catarrhalis.

39. Способ по п.34, где бактериальный цитолизин приготовлен с антигеном из RSV (респираторно-синцитиального вируса).

40. Способ по п.34, где бактериальный цитолизин приготовлен с антигеном из вируса парагриппа.

41. Способ по п.34, где бактериальный цитолизин приготовлен с антигеном из вируса гриппа.